专利名称：慢病毒载体的生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产慢病毒载体的方法。
背景技术：
慢病毒例如I型人类免疫缺陷病毒是很有希望的基因治疗工具，这 是因为它们能够转导并整合至分裂细胞及非分裂细胞的基因组中。然而， 用于大规模临床应用的复制缺陷慢病毒载体的生产仍面临着挑战。慢病
毒载体的生产通常通过以多种不同质粒构建体共转染293T人胚肾细胞 实现。最初的临床慢病毒载体生产是基于一个双质粒体系(Lu W n/.， 2004)。为了进一步提高该体系的安全性，可以将慢病毒基因组分至4个 质粒中。这些质粒为自失活转移载体、包含^^-/^/的包装质粒、rev质 粒以及通常编码水泡性口膜炎病毒糖蛋白G (VSV-G)的包膜糖蛋白质 粒。为了大规模生产慢病毒，已通过贴壁细胞的生长将其变成细胞工厂 (cell factory )。此外，已在无血清的条件下使用3-L生物反应器在悬浮 培养物中瞬时地生产出慢病毒载体。
由于用于病毒生产的瞬时转染体系可能存在问题并且很费时，已经 开始尝试开发稳定的大规模生产体系。然而，慢病毒蛋白酶和融合包膜 蛋白VSV-G的毒性妨碍了组成型载体的生产。 一种生产方法是使用受四 环素诱导型启动子体系或蜕皮激素诱导型启动子体系控制的诱导型包装 细胞系。其他的生产方法涉及将毒性VSV-G蛋白替换为低毒糖蛋白。
慢病毒载体还可以被多种病毒表面蛋白假型化。最常用的是水泡性 口膜炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)。另外，多种不同的包膜糖蛋白例 如来自？反转录病毒(如猫内源性反转录病毒RD114env、改良的长臂 猿白血病病毒GalV或莫洛尼小鼠白血病病毒MLV)、曱病毒、狂犬病 病毒或杆状病毒的包膜糖蛋白也已用于假型慢病毒载体。
假型化可扩大慢病毒的转导范围，在多种不同细胞和组织中已经获 得了长时间的转基因表达(Delenda， 2004 )。假型化还可强化脆弱的慢病毒，使得可通过超速离心浓缩获得高效价。
杆状病毒在基因送递应用方面具有多个优点。它们具有大插入容量
(> 100 kb )并且能够转导大多数哺乳动物细胞系——甚至是无血清条件 下的大规模悬浮细胞培养物(Scotte/fl/.，2007)。另外，杆状病毒易于以 大规模及高效价生产，并且由于它们不能在哺乳动物细胞中复制而很少 呈现安全问题。几乎不能检测到细胞毒性，甚至在较高感染复数(MOI) 的情况下也是如此。
杆状病毒已经被用于昆虫细胞中的大规模蛋白的生产，以及用于病 毒样颗粒(VLP)例如肝炎VLP的生产。已经使用杂交杆状病毒产生出 了完整病毒。在哺乳动物细胞中，杆状病毒介导的重组流感病毒、腺病 毒(Cheshenko C "/， 2001)和AAV ( Auang " "/， 2007 )的生产已经有记 载。
发明内容
根据本发明， 一种生成慢病毒载体的方法，包括将慢病毒转移构 建体、gflg、 po/、包膜蛋白和"v中的每一种分别地克隆至相同的杆状病 毒或不同的杆状病毒中，并且以这些杆状病毒或每种杆状病毒转导生产 细胞。
以下的附示说明了本发明的实施方案。
图1的示意图显示了克隆的杆状病毒供体质粒BAC-转移体 (transfer), BAC陽gag-pol、 BAC-VSVg和BAC國rev。 图2的示意图为杆状病毒介导的慢病毒的生产。
具体实施例方式
为了实施本发明的方法，所述杆状病毒必须包含慢病毒转移构建 体、g"g、戶八合适的包膜蛋白和/w。
术语"慢病毒转移构建体"应是本领域技术人员已知的。慢病毒转移 构建体是慢病毒RNA基因组/慢病毒载体RNA和转基因盒的来源。慢病 毒转移构建体的一个实例是LV1-GFP。用于产生慢病毒转移构建体的方 法亦应是本领域技术人员已知的。术语"包膜蛋白"应是本领域技术人员已知的。包膜蛋白是保护病毒
的核酸的蛋白质。适合在本发明中使用的包膜蛋白的一个实例为VSV-G。 术语"生产细胞"应是本领域技术人员已知的。适合在本发明中使用 的生产细胞的实例有293T细胞、H印G2细胞、CHO细胞、BHK细胞、 Sf9细胞、Sf21细胞、293细胞、BTI-Tn 5 B 1-4细胞、COS细胞、NIH/3T3 细胞、Vero细胞、NSO细胞或PerC6细胞。而且，生产细胞可以;故贴 壁培养或悬浮培养。
优选地，生产本发明的功能性慢病毒需要的所有元件被克隆至3种 不同的杆状病毒中。更优选地，它们被克隆至2种不同的杆状病毒中， 并且最优选地，它们被克隆至单种杆状病毒中。这可通过将BAC-转移 体、BAC-gag-pol、 BAC-VSVg和BAC-rev的特征合并至单种杆状病毒 中实现。
已经构建了 4种源自苜蓿丫紋夜蛾核多角体病毒(爿"tog/7i/;/^ cfl/^/bf"/cflf multicapsid nucleopolyhedrovirus ) ( AcMNPV )的重组軒状病 毒BAC-转移体、BAC-gag-pol、 BAC-VSVg和BAC-rev。它们可编码 在哺乳动物细胞中生成慢病毒载体需要的所有元件。通过用这些杆状病 毒转导293T细胞，已经产生了功能性慢病毒。
由于生产容易、杆状病毒的浓度、在无血清条件下对悬浮哺乳动物 细胞的有效转导以及安全性这些原因，杆状病毒技术是规模化病毒生产 的有吸引力的选择。慢病毒载体的生产还可以采用编码或展示病毒蛋白 rev、 tat、 net、 vit或vpu的杆状病毒来实现，其方式为但不限于将所述 病毒蛋白与一种杆状病毒蛋白融合。所述杆状病毒蛋白可以是大包膜蛋 白gp64或者壳体蛋白vp39和p24。
所产生的慢病毒可以被异源蛋白或其他配体例如VSV-g、 gp64、亲 和素、链霉亲和素或生物素假型化。
以下的实施例举例说明了本发明。 #存希才法
^ f4Z并炎'^毒^^在發
将用于在哺乳动物细胞中产生第3代慢病毒载体的所有必需元件 亚克隆至杆状病毒供体载体pFastBacl中，以构建4种源自苜蓿丫紋夜 蛾核多角体病毒(AcMNPV)的重组杆状病毒BAC-转移体、 BAC-gag-pol、 BAC-VSVg和BAC-rev (图1)。首先，将包含多克隆位点
(尸附證緒尸s/脂/I/4/ni /尸fld争薩M/尸附c贩oRI"/ml/5V"肠cI )的多聚接头(polylinker)克隆至pFastBacl的独特JvHI位点。该多 聚接头的序列为
5'CACGTGGCTAGCCTGCAGGTCGACCTTAAGTTAATTAAACTAG TACGCGTGTTTAAACGAATTCGGGCCCATTTAAATGGCGCGCC-3 ，(SEQ ID No: 1 )。为了方便杆状病毒效价测定，所述供体载体还包含受 多角体蛋白启动子控制的红色荧光蛋白标记基因(DsRed)。
为了生成第3代自失活慢病毒转移构建体，来自质粒 LV國hPGK國ANGFP-WPRE-SIN (Makinen， 2006 )的(LV1-GFP ) ANGFP 被GFP替换。在该构建体中，GFP标记基因受磷酸甘油酸激酶(PGK) 启动子驱动。pBAC-转移体载体的构建通过将来自LV1-GFP的相关序列 分两阶段亚克隆至pFastBacl供体栽体多聚接头中实现。为了克隆所述 序列的第一部分，将LV1-GFP用5srBI和消化并亚克隆至所述供 体载体多聚接头的Sh^I""I位点中。所述序列的第二部分的克隆是通 过将LV1-GFP用」wl和^rll消化，并将片段插入至所述改良的 pFastBacl质粒的和JwII位点中。
由CMV启动子驱动表达和的包装构建体(pBAC-gag-pol) 源自通过^/;"Ll消化的质粒pMDLg/pRRE( Follenzi and Naldini， 2002 )， 将该构建体亚克隆至所述供体载体的S附/I位点。在连接之前，将J/mLl 端用T4DNA聚合酶(Finnzymes， Helsinki, Finland )平端化。
将来自质粒pCMV-VSVG的VSV-G包膜构建体分两阶段亚克隆至 pFastBacl栽体中。首先，将pCMV-VSVG以JVWl消化并使用T4 DNA 聚合酶平端化，然后以五co/ I消化。将该片段亚克隆至所述多聚接头的 S附/I/五coRI位点。将所述序列的第二部分用五"RI从pCMV-VSVG上 消化下，并亚克隆至多聚接头E^RI位点。
使用正向引物和反向引物通过聚合酶链反应(PCR)从质粒 pRSV-REV (Dull W /， 1998 )获得Rev cDNA。所述正向引物为 5'CGAAGGAATTCGTCGCdCATGGCAGGAAGAAGCGGA-3' ( SEQ ID No: 2)。 rev基因的第l-18位核苷酸的序列为粗体，Kozak共有序列 为斜体，五coRI位点以下划线示出。所述反向引物为 5'AGCTAGCTAGCGTATTCTCCTGACTCCAATATTGT-3' ( SEQ ID No:3)。 rev基因的第349-325位核苷酸的序列为粗体，并且A^d位点以下 划线示出。将扩增的PCR产物经五"RI和A7^1消化，4吏用Wizard Clean up试剂盒(Promega， Madison, WI， USA)纯化，并亚克隆至所述 pFastBacl多聚接头的五"RI/A7^I位点，以形成pBAC-rev。 Rev cDNA 受CMV启动子的控制，所述CMV启动子在之前作为pcDNA3载体 (Invitrogen)的A^"I/f"RI片段被亚克隆至pFastBacl多聚接头的 5Wfll/五coRI位点。
将293T细胞铺板接种24 h，然后进行转导。将细胞在都补加有10% 胎牛血清(FBS )的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM )或RPMI 1640 中培养。在无血清或补加血清的DMEM或RPMI中以每个细胞50-1000 pfu的不同感染复数(MOI)进行转导。在37。C下于无血清培养基中孵 育4 h后或者于补加血清的DMEM或RPMI中孵育18 h后，洗涤细胞 并更换培养基。在转导后48h收集包含慢病毒的细胞上清液，并且在室 温下以1500 rpm离心10 min。
作为对照，制备了未使用所述3种杆状病毒(BAC-gag-pol、BAC-Rev 或BAC-VSVg)中的其中一种的数批培养上清。还通过常规的四质粒瞬 时转染方法(Follenzi and Naldini， 2002 )在293T细胞中制备了慢病毒。 为了增强细胞在平板底部的贴附，依照制造商的说明书以多聚-L-赖氨酸 包,皮平板。
虔^#^放#浙定
慢病毒转化单位(TU/ml)通过分析能够转导HeLa细胞的病毒颗粒 的数目确定。在第一天，将Hela细胞以每孔lxl()S个细胞接种于6孔板 中，或者以每孔5xl()S个细胞接种于96孔板中。在第二天以系列稀释度 进行慢病毒转导。在第五天以荧光显微镜观察细胞并通过流式细胞仪分 析，以得出被表达GFP的慢病毒转导的细胞的百分数。效价的计算如 Follenzi and Naldini， 2002中所述。
脊差萄^炎矽/^^S
将Hela细胞(5xl03 )接种于96孔板上，第二天以杆状病毒产生的 慢病毒转导，并将细胞培养至最多6周。通过流式细胞仪监测GFP表达， 每周一次。作为另一个对照，还以表达GFP的杆状病毒BAC-转移体转 导Hela细胞，并以类似的方式监测表达情况。通过p24 ELISA试剂盒(NENTM Life Science Products HIV-1 p24 ELISA)确定慢病毒壳体蛋白p24的量(pg/ml)。通过p24ELISA测定 法对细胞培养上清液中有复制能力的慢病毒(RCL)进行测试。用慢病 毒转导HeLa细胞，并通过流式细胞仪监测转导效率。将细胞培养4周， 收集上清液并且重复地测量该上清液中p24的浓度作为RCL的标示物。 这还通过以收集的上清液转导原初HeLa细胞得到确证，并通过荧光显 微镜和流式细胞仪监测GFP表达。
通过GraphPadPrism 4 ( GraphPad Software Inc., San Diego， CA，
USA)进行统计分析。
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将关键的第三代元件克隆至4种杆状病毒中。通过限制分析验证杆 状病毒质粒构建体，并且在昆虫细胞中生产4种杆状病毒。为了监测杆 状病毒生产的稳定性，用针对杆状病毒的大包膜蛋白的抗gp64抗体对每 一批细胞进行免疫印迹分析。在昆虫细胞中对浓缩的杆状病毒进行终点 效价测定(IU/ml)。产生的所有病毒都被测得为高效价(>101GIU/ml), 该测量的高效价被用于控制慢病毒生产中的MOI。
慢病毒的生产通过以4种杆状病毒转导293T细胞。使用不同的培养 基和孵育时间进行转导。在转导后20 h通过荧光显微镜监测转导效率。 在转导后48 h收集包含慢病毒的上清液，并且测定在HeLa细胞中的效 价，作为转导单位(TU/ml)。
当在无血清条件下进行4 h转导时，MOI均为500的4种杆状病毒 均产生平均为6.0xl05 TU/ml的慢病毒效价。MOI为750的杆状病毒浓 度产生了平均为1.2 xl06 TU/ml的更高的慢病毒效价。在使用更高的杆 状病毒浓度(4种杆状病毒的MOI均为1000 )时，检测到了效价的降低。 当杆状病毒被过夜转导时，MOI为250的4种杆状病毒产生平均为 2.5X106 TU/ml的最高效价。当RPMI培养基被用于转导时，MOI为50 时就以达到平均为5.9xl05 TU/ml的最高效价。这些效价与由常规的四质 粒转导方法(Follenzi and Naldini， 2002 )产生的效价是相当的。不同的质粒比可影响质粒转染中的效价。当使用与通常使用的质粒
比相同的杆状病毒比的时候，慢病毒效价比预期的低0.64倍。还将BAC-转移体病毒加倍，以观察是否能获得更高的慢病毒效价。然而，所述效 价与用相似剂量的杆状病毒进行生产相比没有显著不同。以加倍量的 BAC-转移体获得的效价平均为1.4xl06 TU/ml。
作为阴性对照，每次不使用其中一种杆状病毒(BAC-gag-pol、 BAC-Rev或BAC-VSVg)进行慢病毒生产。收集的培养基被用于转导 HeLa细胞，并且在转导后四天通过流式细胞仪对GFP阳性细胞的数目 (% )进行分析。在这些实验中未测定到GFP阳性细胞。
经常使用的慢病毒生物效价(TU/ml)的滴定方法是通过ELISA测 量p24浓度(pg/ml)。 p24在培养基中的浓度为191 ± 105 ng/ml，这与 代表性病毒制品的值相当。然而，p24浓度没有将生物活性颗粒分开。 为了比较感染颗粒和p24比率，从以不同量或比例的杆状病毒产生的多 种制品测量了这两个参数。结果显示出良好的TU/p24比率。
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在收集的慢病毒培养基中残留的杆状病毒通过终点效价测定进行评 估，并且效价为用于293T细胞转导的剂量的0.1-0.5%。为了确证转基 因表达源自所产生的慢病毒，而不是源自残留的杆状病毒，将293T细 胞仅以BAC-转移体杆状病毒转导。然后，将HeLa细胞以通过类似于慢 病毒制备中的方式收集的培养基进行转导，在转导后4天以流式细胞仪 对GFP阳性细胞进行分析。未检测到GFP阳性细胞。
杆状病毒载体不会在脊推动物细胞中复制，并且它们无法整合至宿 主的基因组中。来自这些栽体的基因表达是瞬时的，通常在两周内消失。 然而，来自整合的慢病毒的转基因表达是相对稳定的，被认为不会出现 转基因表达的沉默。杆状病毒产生的慢病毒转导可导致有效的GFP表 达，这在转导后43天后仍能观察到(图5A)。在第三天还通过荧光显微 镜在HeLa细胞中检测到了表达。在转导后17天，MOI为100和1000 (在第3天分别位18.7±1.9%和11.5±0.4 % )时杆状病毒介导的GFP表 达消失。
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有复制能力的慢病毒(RCL)的测试是通过p24ELISA测定法进行 的。将H6La细胞以包含慢病毒的培养基转导。通过流式细胞仪确证转导效率。将细胞培养4周，并重复地测量上清液中p24的浓度。p24浓 度升高表明病毒复制的进行，但没有检测到这种升高。将2.5周后收集 自转导的HeLa细胞的培养基进一步用于转导原初HeLa细胞，但用荧 光显微镜或流式细胞仪均未检测到GFP表达。
总之，已证明，使用杂交杆状病毒可成功地生成功能性慢病毒。由 杆状病毒产生的慢病毒的效价与使用常规的四质粒转染方法产生的效价 是相当的。当使用最佳剂量的杆状病毒及延长的转导时间的时候，获得 了良好的慢病毒效价。当使用高剂量的杆状病毒的时候，观察到慢病毒 效价的降低及细胞死亡。这一点可能归因于VSV-G对生产细胞的毒性。 当不使用表达VSV-G的杆状病毒时没有出现问题，杆状病毒颗粒的总数 保持不变。通过以RPMI 1640替换DMEM培养基，最低的杆状病毒剂 量(MOI50)产生最佳的慢病毒效价。这一点与这样的事实是一致的， 即转导培养基可影响杆状病毒介导的基因在脊推动物细胞中的表达。为 了确证所生成慢病毒的功能性，HeLa细胞被转导，持续的GFP表达出 现6周。然而，用对照杆状病毒时，GFP表达在17天内消失。如果通 过不使用BAC-gag-pol、 BAC-Rev或BAC-VSVg来生产慢病毒，则无慢 病毒产生。
虽然杆状病毒是安全的，但是慢病毒制品被杆状病毒污染是不希望 的。在所述慢病毒制品中残留的杆状病毒的量仅为简单慢病毒生产方案 中使用的杆状病毒剂量的0.1-0.5%,所述简单慢病毒生产方案中的293T 细胞在杆状病毒转导后仅被洗涤一次。通过简单地增加额外的洗涤步骤 或者使用合适的下游纯化策略，可进一步降低残留的杆状病毒。
与使用慢病毒载体相关的一个主要关注点是生成人致病性病毒的可 能性。为了避免这一点，将慢病毒基因组分至4个不同的生产质粒中， 目的是使通过重组形成RCL的风险最小。在杆状病毒生成的慢病毒制品 中没有检测到RCL。 p24水平在延长培养后没有增加，在转导后2.5周 内没有检测到GFP表达。
用贴壁细胞进行用于临床研究的病毒规模化生产仍很困难。因此， 使慢病毒生产与悬浮细胞培养物相适应将是有利的。在无血清条件下 HEK293细胞适应的悬浮物中的初步结果显示了十分有效的杆状病毒转 导效率(95.1% GFP阳性细胞)。Delenda, 2004. J. Gene /Wee/. 6 Suppl 1: S125-S138.
Lu, a/. J. Gene Mecf. 6， 963-973 (2004).
Follenzi, & Naldhi Me的octe 346， 454-465 (2002).
Ni， a/. J. G節e /Wed 7， 818-834 (2005).
Cheshenko, 3/, Gene The/", 8， 846-854 (2001).
Makinen， a/. J. Gene Med 8, 433-441 (2006).
Dull,甜a/.丄Wra/. 72, 8463-8471 (1998).
权利要求
1.一种生成慢病毒载体的方法，包括将慢病毒转移构建体、gag、pol、包膜蛋白和rev中的每一种分别地克隆至相同的杆状病毒或不同的杆状病毒中，并且以这些杆状病毒或每种杆状病毒转导生产细胞。
2. 根据权利要求l的方法，其中所述包膜蛋白为VSV-G。
3. 根据权利要求2的方法，其中所述慢病毒转移构建体、gtfg、 /^/、 VSV-G和rev被分别地克隆至BAC-转移体、BAC-gtfg-/w/、 BAC-VSVg 和BAC-rev中。
4. 根据权利要求1的方法，其中所述慢病毒转移构建体、g"g、 /^/、 所述包膜蛋白和"v的每一种均被克隆至所述相同的杆状病毒中。
5. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述生产细胞为293T细 胞、HepG2细胞、CHO细胞、BHK细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、293 细胞、BTI-Tn 5 B 1-4细胞、COS细胞、NIH/3T3细胞、Vero细胞、NSO 细胞或PerC6细胞。
6. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述慢病毒转移构建体为 第3代慢病毒转移构建体。
全文摘要
本发明是一种生成慢病毒载体的方法，包括将慢病毒转移构建体、gag、pol、包膜蛋白和rev的每一种分别地克隆至相同的杆状病毒或不同的杆状病毒中，并且以这些杆状病毒或每种杆状病毒转导生产细胞。
文档编号C12N15/79GK101631863SQ200880004377
公开日2010年1月20日 申请日期2008年2月11日 优先权日2007年2月12日
发明者H·P·莱施, K·J·艾瑞尼, S·艾拉赫图阿拉 申请人:Ark治疗学有限公司