专利名称：用于产生3-羧基黏康酸内酯的基因被破坏的菌株、重组质粒、转化体和方法
技术领域：
本发明涉及原儿茶酸酯(protocatechuate ) 4,5-环-切割酶基因-被破 坏的菌抹、包含编码参与从对苯二曱酸经由原儿茶酸发酵生产3-羧基-顺,顺-黏康酸和/或3-羧基翁康酸内酯的多级反应过程的酶的基因的重组 质粒、将重组质粒整合在被破坏的菌株中的转化体以及使用所述转化体 工业化生产3-羧基-顺,顺-黏康酸和/或3-羧基黏康酸内酯的方法。
背景技术：
对笨二甲酸是从石油组分分离的芳香族化合物，其作为PET的起始 材料被便宜地大量生产。使用对苯二曱酸作为起始材料进行的新型生物 可降解功能性塑料的开发使得能够与基于石油的聚合物材料例如PET进 行共聚反应，从而允许开发具有优良的生物可降解性的聚合物材料。
本发明的发明人已发现降解对苯二甲酸的微生物丛毛单胞菌 (Comamonas sp. ) E6可在首先将对苯二甲酸转化成原儿茶酸后,经由 2H-吡喃-2-酮-4,6-二羧酸来完全降解其(专利文件l)。也已报导通过重组 载体，其包括包含编码对苯二酸酯双加氧酶(terephthalate dioxygenase ) (TPA-DOX)、 1,2-二羟基-3,5-环己二烯-l,4-二羧酸酯脱氢酶(DCD-脱氬 酶)、对苯二酸酯转运体(transporter) (TPA转运体)和正调节蛋白的基因 从微生物的染色体DNA除去编码原儿茶酸-4,5-双加氧酶和4-羧基-2-羟 基-6-半醛黏康酸酯脱氢酶，包含所述重组载体的转化体，以及使用所述 转化体从对苯二甲酸产生2H-吡喃-2-酮-4， 6-二羧酸的方法(日本专利申 请号2005-298242)。
本发明的发明人也已报导用于通过多级酶反应从植物组分例如香 草醛、香草酸和原儿茶酸发酵生产3-羧基-顺,顺-黏康酸和/或3-羧基黏康 酸内酯的方法(日本专利申请2006-218524)。
在该方法中，经由l,2-二羟基-3,5-环己二烯-l,4-二羧酸酯和进一步 经由原儿茶酸将对苯二甲酸转化成3-羧基-顺和顺-黏康酸，取决于微生 物的类型，原儿茶酸的2,3-键、3,4-键和4,5-键被切割(在下文中，原儿茶酸的2,3-键切割、3,4-键切割和4,5-键切割将分别称为"2,3-环切割"、
"3,4-环切割"和"4,5-环切割，，)。在某些微生物存在的情况下，作为 原儿茶酸的3,4-键切割产物的3-羧基-顺,顺-黏康酸经由3-羧基黏康酸内 酯或4-羧基黏康酸内酯而被进一步代谢。
迄今为止还未有用于使用对苯二甲酸作为起始材料发酵生产3-羧基 -顺,顺-翁康酸的方法。
本发明的公开内容
本发明的目的是提供用于从对苯二曱酸经由原儿茶酸工业规模发 酵生产3-羧基-顺,顺-黏康酸的方法和/或从对苯二甲酸经由原儿茶酸和 其酸处理发酵生产3-羧基-顺,顺-黏康酸以在工业规模上获得3-羧基黏康 酸内酯的方法。
为了有效地获得3-羧基-顺,顺-黏康酸，必需破坏具有2,3-环切割功 能、3,4-环切割功能或4,5-环切割功能的基因，或破坏进一步代谢3-羧基 -顺,顺-黏康酸的基因。
本发明者已对该主题进行了深入(ardent)研究，结果认识到破坏 原儿茶酸酯4,5-环-切割酶的切割活性可完全破坏从原儿茶酸至2H-吡喃 _2-酮-4,6-二羧酸的转化过程，从而产生了其中原儿茶酸酯4,5-环-切割酶 的切割活性被破坏的原儿茶酸酯4,5-环-切割酶基因被破坏的菌抹。还发 现，通过使用所述被破坏的菌抹，可能以高得率并且价廉地从对苯二曱 酸生产3-羧基-顺,顺-黏康酸和/或其酸处理产物3-羧基黏康酸内酯。
具体地，(l)本发明提供了原儿茶酸酯4,5-环-切割酶基因被破坏的菌 株，其中存在于微生物细胞的染色体DNA中的编码下列的基因已被破 坏
(a) SEQIDNO: l或3中所示的氨基酸序列,或
(b) 具有一个或多个氨基酸的缺失、置换、添加和/或插入并且展示 原儿茶酸酯4,5-环-切割活性的SEQ ID NO: 1或3中所示的氨基酸序列。
(2)本发明还提供了原儿茶酸酯4,5-环-切割酶基因被破坏的菌抹，
(a) SEQIDNO:2或4中所示的核苷酸序列；或
(b) 在严格条件下与由与(a)的核苷酸序列互补的核普酸序列组成的 DNA杂交，并且编码具有原儿茶酸酯4,5-环-切割活性的酶的核香酸序列。
(3) 本发明还提供了根据(1)或(2)的基因被破坏的菌株，其中原儿茶
酸酯4,5-环-切割酶基因已通过存在于微生物细胞的染色体DNA中的基 因和同源重组DNA之间的同源重组而被破坏，所述基因编码
(a) SEQIDNO: l或3中所示的氨基酸序列，或
(b) 具有一个或多个氨基酸的缺失、置换、添加和/或插入并且展示 原儿茶酸酯4,5-环-切割活性的SEQ ID NO: 1或3中所示的的氨基酸序列，
其中，所迷同源重组DNA具有可与所述基因进行同源重组的DNA 序列并且缺乏原儿茶酸酯4,5-环-切割活性。
(4) 本发明还提供了根据(1)至(3)的任一项的基因被破坏的菌株，其 中原儿茶酸酯4,5-环-切割酶基因被破坏的菌抹的亲本菌抹是丛毛单胞 菌纟田菌(Comamonas sp.)。
(5) 本发明还提供了根据(4)的基因被破坏的菌林，其中丛毛单胞菌属 (Comamonas)纟田菌是丛毛单胞菌(Comamonas sp.) E6。
(6) 本发明还提供了包含对苯二酸酯双加氧酶基因(TPA-DOX基因)、 NADPH-还原酶基因、1，2-二羟基-3,5-环己二烯-l,4-二羧酸酯脱氲酶基因 (DCD脱氬酶基因)、正调节蛋白基因、对苯二酸酯转运体基因(TPA转运 体基因)和原儿茶酸-3,4-双加氧酶基因(pcaHG基因)的重组质粒。
(7) 本发明还提供了通过将根据(6)的重组质粒导入根据(1)至(5)的任 一项的基因被破坏的菌林而获得的转化体。
(8) 本发明还提供了用于生产3-羧基-顺,顺-黏康酸和/或3-羧基黏康 酸内酯的方法，其特征在于在对苯二甲酸存在的情况下培养根据(7)的转 化体。
根据本发明，可能实现从对苯二甲酸高得率并且廉价地发酵生产3-羧基-顺,顺-黏康酸和/或3-羧基黏康酸内酯。
附图简述
图1是5.1-kbSalI-XhoI限制性内切酶和ORF的图镨。
图2显示pCS18 10-kb SacI片段和pPVlO 10-kb Sacl片段之间的位置关系。
图3显示来自丛毛单胞菌(Comamonas sp.) E6的原儿茶酸酯4，5-切
割酶基因群。图4显示pmdB 1被破坏的菌林的质粒pDBKM 。
图5显示丛毛单胞菌(Comamonas sp.) E6中进行的对pmdBl基因的 破坏。5(A)是构建E6pmdBl基因被破坏的菌抹的方法的举例说明，5(B) 显示pmdB l基因被破坏的菌林的Southern杂交分析的结果。
图6是显示重组质粒pKHG的构建的举例说明。
图7是显示重组质粒pKHG/C的构建的举例说明。
图8是显示重组质粒pKTphHG/C的构建的举例说明。
实施本发明的最佳片莫式
本发明的基因被破坏的菌株可以是其中2,3-环切割功能、3,4-环切割 功能和4,5-环切割功能中的至少一个功能被破坏的菌林。备选地，本发 明的基因被破坏的菌林可保留3，4-环切割功能，在该情况下，必须破坏 进一步代谢3-羧基-顺，顺-黏康酸的功能。为了破坏代谢羧基-顺,顺-黏康 酸的活性，可破坏3-羧基黏康酸内酯化酶或4-羧基黏康酸内酯化酶。
根据本发明的3-羧基-顺,顺-黏康酸的生产通过将本发明的基因被破 坏的菌株导入宿主微生物来进行，所述宿主微生物是例如i)具有将对苯 二甲酸代谢成原儿茶酸(对苯二酸酯同化作用(terephthalate assimilation )) 的功能并且缺乏对笨二酸酯2,3-环切割功能但具有对苯二曱酸3,4-环切 割功能或4,5-环切割功能的宿主微生物，或ii)缺乏对苯二酸酯同化作用 但具有因原儿茶酸酯2,3-环切割功能、原儿茶酸酯3,4-环切割功能或原儿 茶酸酯4,5-环切割功能而产生的"原儿茶酸酯同化作用"的宿主微生物。
现将使用原儿茶酸酯4,5-环切割功能被破坏的基因被破坏的菌林为 例来详细地解释本发明。
(I)获得编码原儿茶酸酯4,5-环-切割酶(原儿茶酸4,5-双加氧酶)的 基因。
为了本发明的目的，原儿茶酸酯4,5-环-切割酶基因群将称为"pmd 基因群，，。在pmd基因群中，编码具有切割原儿茶酸酯4，5-环以将其转化 成4-羧基-2-羟基-6-半醛黏康酸酯的双加氧酶活性的酶的a-亚基的基因 将称为"pmdAl"(氨基酸序列示于SEQ ID NO: 3 ，核苦酸序列示于SEQ ID NO: 4),编码所述酶的|3-亚基的基因将称为"pmdBl"(氨基酸序列示于 SEQ ID NO: 1 ，核苷酸序列示于SEQ ID NO: 2)。
同样，编码具有切割4-羧基-2-羟基-6-半醛黏康酸酯以将其转化成2H-吡喃-2-酮-4,6-二羧酸的脱氳酶活性的酶的基因将被称为"pmdC"。 获得编码原儿茶酸酯4,5-环-切割酶的基因的方法不受特别的限制， 例如，可通过基于基因的核苷酸序列的数据制备适当的探针或引物，然 后使用所述探针或引物筛选菌林的cDNA文库或基因组DNA文库来获得
所述基因。
原儿茶酸酯4，5-环-切割酶的基因还可通过PCR来获得。可将菌抹的 染色体DNA或cDNA文库用作模板，使用 一对经设计用以扩增基因的核 苷酸序列的引物来进行PCR。可视具体情况来设置PCR反应条件，例如， 可在这样的条件下进行PCR反应，在所述条件中将在94。C下进行30秒(变 性)、在55。C下进行30秒至1分钟(退火)和在72。C下进行2分钟(延伸)作为 一个循环的反应进行30个循环，然后进行在72。C下进4于7分钟的反应。 然后将所扩增的DNA片段克隆入适当的载体。载体优选被选择为在大肠 杆菌(E. coli)中自主复制(autoreplicating)但在丛毛单胞菌中不能进 行染色体外自主复制的载体。
用于制备探针或引物、构建cDNA文库、筛选cDNA文库和克隆耙基 因的方法对于本领域技术人员来说可以是已知的，例如，可按照 Molecular Cloning: A laboratory Manual, 第2版,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989和Current Protocols in Molecular Biology, Supplement pp. 1-38, John Wiley & Sons (1987画1997)中 所述的方法进行所述方法。
(II)构建基因被破坏的菌林
本发明的基因被破坏的菌林是其中原儿茶酸酯4,5-环切割已被选择 性破坏的被破坏的菌株。更具体地，存在于微生物细胞的染色体DNA中 的编码下列的基因已被破坏(a)SEQIDNO: l或3中所示的氨基酸序列， 或(b)具有一个或多个氨基酸的缺失、置换、添加和/或插入并且展示原 儿茶酸酯4,5-环切割活性的SEQIDNO: l或3中所示的氨基酸序列。
基因可以是包含下列的基因(a)SEQ ID NO: 2或4中所示的核苷酸 序列；或(b)在严格条件下与由与(a)的核苦酸序列互补的核苷酸序列 组成的DNA杂交并且编码具有原儿茶酸酯4,5-环切割活性的酶的核普酸 序列。
特别地，待被破坏的基因可以是SEQ ID NO: 2中所示的pmdB 1基因， SEQIDNO: 4中所示的pmdAl基因，或是这两个基因。在整个本申请说明书中对于所使用的短语"具有一个或多个氨基酸 的缺失、置换、添加和/或插入的氨基酸序列"中的"一个或多个"的范 围没有具体的限制，其可以是例如1至20个，优选1至10个，更优选l至
7个和最优选1至3个。
用于本申请说明书中的术语"严格杂交条件"是指"高严格条件"， 在"高严格条件，，下，DNA链可与与该DNA链高度互补的DNA杂交的另 一个DNA链杂交，并且该条件被设计用以排除大量错配，或指"中等严 格条件"，在"中等严格条件"下，可以比在"高度严格条件"下可能 的碱基对错配程度更大的碱基对错配程度形成DNA双链。作为"高严格 条件"的具体实例，可以提及65-68。C下的0.015 M氯化钠和0.0015柠檬 酸钠，或42。C下的0.015 M氯化钠、0.0015 M柠檬酸钠和50。/。的曱酰胺。 作为"中度严格条件"的具体实例，可以提及50-65。C下的0.015 M氯化 钠和0.0015 M柠檬酸钠,或37-50。C下的0.015 M氯化钠、0.0015柠檬酸 钠以及20%的曱酰胺。
作为特定的杂交DNA,可提及具有与包含SEQ ID NO: 2或4中所示 的核苷酸序列的多核苷酸至少60%,优选至少70%,更优选至少80%， 更加优选至少90%,更加优选至少95%和最优选至少97%的同源性(如 使用分析软件例如BLAST[J.Mol. Biol., 215, 403 (1990)]或FAST[Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)]所计算的)的DNA。
在整个本申请说明书中，"具有原儿茶酸酯4，5-环切割活性"是指 等同于切割原儿茶酸酯4,5-环以将原儿茶酸转化为4-羧基-2-羟基-6-半醛 黏康酸酯的酶的活性。
本发明的基因被破坏的菌林可通过下列获得将突变和/或选择标记 导入通过PCR或克隆获得的编码原儿茶酸酯4,5-环-切割酶的基因以获得 缺乏原儿茶酸酯4,5-环切割活性的DNA，然后使用该DNA进行同源重组。
用于将选择标记导入编码原儿茶酸酯4,5-环-切割酶的基因的方法 可以是例如这样的方法，在该方法中用适当的限制性内切酶切割基因， 然后插入不相关基因，优选使得能够选择已经历同源重组的菌林的选择 标记基因。当不存在适当的限制性内切酶位点时，可通过PCR等导入适 当的限制性内切酶位点。作为选择标记，存在优选的抗药性标记，例如 可提及卡那霉素抗性基因、氨节青霉素抗性基因和四环素抗性基因。
用于将突变导入编码原儿茶酸酯4,5-环-切割酶的基因的方法可以是许多已知方法中的任何方法，例如用于操作DNA核苷酸序列的重组 DNA技术(Sambruck, J., Fritsch, E. F.和Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)以及应用PCR的技术(Ling M.M.和Robinson BH., Anal. Biochem. 254(2): 157-78, 1997)。
用于产生本发明的基因被破坏的菌抹的不具有原儿茶酸酯4,5-环切 割活性的DNA可以是在生理条件下(即在微生物细胞中)与染色体上的 编码相应的原儿茶酸酯4,5-环-切割酶的基因进行同源重组的任何DNA, 所述DNA具有足够的同源性，从而使得能够破坏原儿茶酸酯4,5-环-切割 酶基因。同源性优选为80%或更大，更优选90%或更大，最优选95°/0或 更大。用于同源重组的DNA还可以是原儿茶酸酯4,5-环-切割酶基因的一 部分，只要其在生理条件下(即在微生物细胞中)与染色体上的编码相 应的原儿茶酸酯4,5-环-切割酶的基因进行同源重組，从而使得能够破坏 原儿茶酸酯4,5-环-切割酶基因。本文中提及的一部分可以是优选50或更 多个核苷酸的长度，更优选100或更多个核普酸的长度。
为了通过同源重组产生基因被破坏的菌株，首先构建包含原儿茶酸 酯4，5-环-切割酶基因的核普酸序列的DNA或重組DNA,所迷重组DNA 包含使适当的选择标记插入其中的突变的DNA。当抗药性标记用作选择 标记时，必需选择针对在同源重组之前野生型菌林对其敏感的药物的抗 药性基因。这将使得能够基于在抗生素存在的情况下的生长来区分已经 历同源重组的菌抹和未经历同源重组的菌林。然后，通过电穿孔等将具 有插入基因序列的选择标记的DNA导入菌林，然后使用标记进行选择， 从而通过重源重组将靶基因整合入宿主微生物的染色体。
原儿茶酸酯4,5-环-切割酶基因被破坏的菌抹的亲本菌抹不受特别 的限制，只要其是丛毛单胞菌属(Comamonas)、假单胞菌属 (Pseudomonas )、 芽月包才干菌属(Bacillus )、 乳^干菌(Lactobacillus )、 链球菌属(Stret)tococcus )、酵母菌(Saccharomvces )、念珠菌属(Candida) 等的土壤细菌。亲本菌抹可以是衍生自能够进行"对苯二酸酯同化作用，， 的微生物的菌林，或衍生自能够进行"对苯二酸酯同化作用"但不能进 行"原儿茶酸酯同化作用"的微生物的菌株。
能够进行对苯二酸酯同化作用的微生物能 将对苯二甲酸代谢成 原儿茶酸。能够进行对苯二酸酯同化作用的菌林的实例可以是丛毛单胞菌(Comamonas sp. ) E6 、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ) PPY1100、 華丸酉同丛毛单月包菌(Comamonas testosteroni) (C. testosteroni) T-2、華丸 酮丛毛单胞菌(C. testosteroni) YZW-D、 Derftia tsuruhatensis T7、红球 菌(Rhodococcus sp.) DK17和Rhodococcus jostii RHA1。在此类微生物 当中，丛毛单胞菌(Comamonas sp.) E6是保留将对苯二甲酸代谢成原 儿茶酸的能力和将原儿茶酸代谢成2H-吡喃-2-酮-4,6-二羧酸(4,5-环切割 功能)的能力，但不保留2,3-环切割功能和3,4-环切割功能的菌抹。当丛 毛单胞菌(Comamonas sp.) E6用作亲本菌林时，3-羧基-顺,顺-l占康酸 的生产效率与从香草酸至2H-吡喃-2-酮-4,6-二羧酸的发酵生产系统(日 本未经审查的专利
发明者下俊久, 中村雅哉, 大原诚资, 大塚祐一郎, 政井英司, 片山义博, 福田雅夫, 重原淳孝, 间濑浩平 申请人:株式会社丰田自动织机;国立大学法人东京农工大学;国立大学法人长冈技术科学大学;独立行政法人森林综合研究所