专利名称：：使用egfr抗体和src抑制剂的治疗方法和相关制剂的制作方法使用EGFR抗体和SRC抑制剂的治疗方法和相关制剂发明领域本发明涉及EGFR介导的疾病，尤其癌症的治疗。提供了使用EGFR调节剂，尤其EGFR抗体和scr抑制剂的联合治疗癌症的方法。提供了MAb806抗体和scr抑制剂的方法和联合制剂。
背景技术：
：靶向癌症治疗设计用于破坏癌症发生和肿瘤生长所需的特定分子的功能，从而杀伤或阻止癌细胞的生长(JiH等人(2006)CellCycle5(18):2072-2076Equb2006年9月15日)。与传统的细胞毒性化疗相对比，此类靶向癌症治疗可能更有效并且对正常细胞损害较小。靶向癌症治疗领域的主要努力方向是靶向表皮生长因子受体(EGFR)的药剂的开发。EGFR是密切相关的受体ErbB家族的成员，该家族包括EGFR(ErbB-l)、Her2/neu(ErbB曙2)、Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB画4)。EGFR的激活导致受体酪氨酸激酶的激活和介导下列过程的一系列下游信号事件细胞增殖、迁移、粘附、侵袭、对化疗的抗性以及凋亡抑制、对癌细胞持续增殖和存活关键的过程。由于EGFRvIII突变体受体的表达受限于肺瘤细胞，它代表了高度特异性的抗体治疗靶标。因此，制备了对独特的肽de2-7EGFR有特异性的多克隆和单克隆抗体。在用独特的de2-7EGFR肽免疫之后分离的一系列小鼠mAb都显示出在棵鼠中对平截受体和靶向的de2-7EGFR阳性异种移植物(xenograft)生长的选择性和特异性(WikstrandCJ等人(l995)CancerRes55:3140-3148，.Okamoto，S等人(1996)BrJCancer73:1366-1372;HillsD等人(199S)IntJCancer63:537-543;ReistCJ等人(1997)CancerRes57:1510-1515;ReistCJ等人(1995)CancerRes55:4375-4382;美国专利5,401,828)。抗EGFRvIII抗体的实例包括ABX-EGF(帕尼单抗(panitumumab))、DH8.3、L8A.4和Y10。MAb806是新的鼠抗体，它最初使用表达EGFRvIII突变体的整个细胞作为免疫原制备以识别独特的平截突变体EGFRvIII。重要的是，mAb806所识别的表位在无活性的野生型(wt)EGFR中不易接近，但是在过量表达EGFR和表达EGFRvIII的细胞中以过渡形式的wtEGFR暴露。MAb806结合EGFRvIII/A2-7EGFR突变体中存在或可用的表位，但是识别与突变体的连接肽LEEKKGNYVVTDH不同的表位。表位研究得到免疫组织化学研究的支持，该研究证明了806抗体结合胶质瘤以及多种表皮癌症中存在的表位，但是不结合正常人组织。这些和其他的临床前期数据表明mAb806可能具有与西妥昔单抗(cetuximab)和其他抗EGFR抗体不同的临床活性镨和副作用特征。在异种移植物模型中，mAb806显示出有效的抗肿瘤活性而不粑向正常组织。因此mAb806独特的耙向能力代表着癌症特异性分子靶向治疗的新范例。非受体蛋白酪氨酸Src是60-kDa蛋白，它是包括Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Hck、Fgr、Blk和Yrk的9基因家族的一个成员，其在一些细胞过程的调节中起关键作用，如增殖、分化、迁移、粘附、侵袭、血管发生和免疫功能(YeatmanYJ.(2004)NatRevCancer4(6):470-80;FrameMC.(2004)JCellSci117:989-98)。Src家族激酶含有一个保守性差的结构域和三个保守的Src同源结构域SH2、SH3和SHI或蛋白酪氨酸激酶结构域。对Src调节很关键的是COOH-末端酪氨酸(Y530),当其在被C末端Src激酶(Csk)磷酸化时会产生更多的无活性Src构象。Src根据输入信号而与许多蛋白相互作用。人们还认为它的活性构象通过Y530的去磷酸化和Y418的自磷酸化达成。Src还与结构和信号传导蛋白结合，所得的复合体对Src在多种细胞过程中的作用很关键。据报道Src在一些癌症中过量表达或异常激活，如结肠癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、胃癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、脑癌和血癌(DehmSM和BonhamK(2004)BiochemCellBiol2004;82:263-74)。有几种已知的src小分子抑制剂，一些已经进入临床试验，例如达沙替尼(dasatinib)(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PPl(4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-^-嗜啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，44卜嗜啶)、PD166326。临床上需要用于EGFR介导的疾病(包括癌症)的增强的、更有效的并且更广泛的有效治疗方案.术。
发明内容本发明涉及如下的发现改变src表达或活性增强抗EGFR治疗的效力。具体地，改变src表达或活性显著增强抗EGFR抗体效力，尤其是mAb806抗体的活性。本发明涉及用于治疗癌症或其他EGFR介导的疾病的EGFR和src抑制剂的联合制剂。本发明还提供在哺乳动物中治疗EGFR介导的癌症的方法，其包括以联合、同时、或一个接另一个的连续方式给予所述哺乳动物src抑制剂和抗EGFR抗体。在一个方面，所述src抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂。在一个方面，抗EGFR抗体是MAb806。在本发明方法的一具体实施方式中，抗EGFR抗体为mAb806抗体或其活性片段。MAb806包括鼠抗体、重组抗体或人源化抗体。EGFR介导的癌症可以选自成胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、神经系统癌症、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮趺癌、肝癌、泌尿生殖系统癌症和膀胱癌。所述癌症还可以选自结肠癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、脑癌和血癌。具体地，所述癌症可以是胶质瘤。本发明提供在哺乳动物中治疗癌症的方法，其包括给予所述哺乳动物src抑制剂和抗EGFR抗体，其中所述src抑制剂和抗EGFR抗体同时、联合或一个接另一个连续给予。在本发明方法的一个方面，所述抗EGFR抗体是识别在肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。在一个具体的这种方面，所述抗EGFR抗体是mAb806或其活性片段。在本发明方法中，src抑制剂可以选自达沙替尼(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PPl(4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d卜嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-(1卜嘧啶)和PD166326。在本发明方法中，所述src抑制剂具体为酪氨酸激酶抑制剂。在本发明方法的具体实施方式中，所述src抑制剂为达沙替尼，抗EGFR抗体为mAb806。所述癌症可以选自成胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、神经系统癌症、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、泌尿生殖系统癌症、膀胱癌、结肠癌、黑素瘤、胃癌、胰腺癌、脑癌和血癌。方法，其包括给予所述哺乳动物src抑制剂和抗EGFR抗体，其中所述src抑制剂和抗EGFR抗体同时、联合或一个接另一个连续给予。在一个具体的此种方法中，所述抗EGFR抗体是识别在肺瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。所述抗EGFR抗体尤其为mAb806或其活性片段。本发明提供在哺乳动物中阻断或降低EGFR介导的癌症的肿瘤生长的方法，其包括给予所述哺乳动物src抑制剂和抗EGFR抗体，其中所述src抑制剂为达沙替尼，所述EGFR抗体为mAb806。EGFR介导的癌症可以选自成胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、神经系统癌症、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、泌尿生殖系统癌症和膀胱癌。本发明还提供在哺乳动物中增强抗EGFR抗体效力或活性的方法，其包括给予所述哺乳动物抗EGFR抗体和src抑制剂的联合制剂。所述src抑制剂可以选自达沙替尼(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PP1(4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d]-嗜啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d卜嘧咬)和PD166326。所述抗EGFR抗体尤其为识别在肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。在一个具体的这种方面，所述抗EGFR抗体为mAb806。本发明还涉及药物组合物，其包含在药物上可接受的载体或稀释剂中的抗EGFR抗体和一种或多种src抑制剂。所包括的组合物为其中抗EGFR抗体为识别在肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。在一个具体的这种方面，所述抗EGFR抗体为mAb806。对本领域的技术人员来说，其他目的和优点可以从参考下列例示性附图进行的下列说明综述将显而易见。附图筒述图1:EGFR的示意性代表图。de2-7EGFR中缺失的胞外区域用括号标记。de2-7EGFR的死亡激酶形式在721位处含有单个点突变(K—M)。de2-7EGFR的DY2形式在残基1068和1173处具有Y—F突变，而DY5变体也具有这些取代基以及992、1086和1148取代基。图2:不同异种移植物对EGFR特异性抗体的敏感性。通过在BALB/c棵鼠的两侧腹注射3xl(^细胞而建立异种移植物。当异种移植物达到约100mm3的平均体积时开始抗体治疗。用1mgmAb528(左栏)或mAb806(右栏)处理小鼠2周，每周3次(即，共6次注射)。数据表示为平均肺瘤体积土SE。图3:U87MG基细胞系的异种移植物生长曲线。通过在BALB/c棵鼠的两侧腹注射3xl(^细胞建立异种移植物以确定生长曲线。数据表示为平均肿瘤体积+SE。图4A和4B:U87MG.A2國7、U87MG.DK和U87MG.DY5细胞中de2國7EGFR变体的体外磷酸化。A、用mAb806、mAb528或不相关的同型匹配对照抗体免疫沉淀de2-7EGFR蛋白，并对所得样品进4亍免疫印迹。所有de2-7EGFR变体在Y1045处的磷酸化均为阳性，Y1045是与泛素化和降解相关的主要位点(上栏)。如所预测，de2-7EGFR在Y1173位处祐:组成性磷酸化，而DK和DY5变体在此位点均为磷酸化阴性(中栏)。用EGFR的兔c末端多克隆抗体确定EGFR的存在(下栏)。这种c末端抗体不识别DY5变体，因为DY5变体含有Y1068F突变，Y1068F证明是抗体结合的关键残基。因此，在(B)中总DY5蛋白的存在通过用mAb806免疫印迹来确定。图5A-5D:表达高水平de2-7EGFR的U87MG细胞。将U87MG.厶2國7用FACS分选为低(L)、中(M)、和高(H)表达群体。A、在血清饥饿36小时后裂解细胞，通过免疫印迹分析de2-7表达(C13)和de2-7EGFR的酪氨酸磷酸化(4G10)。磷酸化水平与de2-7EGFR相关。B、通过在BALB/c棵鼠的两侧腹注射lxl()6细胞建立亲代U87MG、U87MG-L、U87MG-M和U87MG-H异种移植物以确定生长曲线。数据表示为平均肿瘤体积士SE。C、通过免疫印迹分析来自(B)的肿瘤的de2-7EGFR(C13)表达。D、用1mgmAb528或mAb806处理具有U87MG-H异种移植物的小鼠2周，每周三次(第4、6、8、11、13和15天)。数据表示为平均肿瘤体积士SE。图6A-6C:用EGFR特异性抗体处理NR6.A2-7异种移植物。通过在BALB/c棵鼠的两侧腹注射3xl(^细胞而建立异种移植物。当异种移植物达到约100inmS的平均体积时开始抗体治疗。用1mgmAb806(A)或mAb528(B)处理小鼠2周，每周3次(第22、25、29、32、36和39天)，或用mAb528(C)处理3周，每周2次(第27、30、34、37、41和44天)。数据表示为平均肿瘤体积士SE。图7A-7C:de2-7EGFR和Src之间的相互作用。(A)4吏细胞血清饥饿过夜，然后用10jiMPP1或PP2或溶媒(DMSO)处理30分钟或24h，然后用mAb528、mAb806或不相关的同型对照进4亍免疫沉淀。用EGFR的Y845特异性抗体进行免疫印迹，而总de2-7EGFR用兔c末端多克隆抗体呈现。所示结果代表4次独立实验。(B)通过在BALB/c棵鼠的两侧腹注射lxl06细胞建立U87MG.A2-7载体对照和U87MG.A2-7j)NSrc异种移植物以确定生长曲线。数据表示为平均肿瘤体积士SE。(C)通过在BALB/c棵鼠的两侧腹注射3xl(^细胞建立U87MG.A2-7oNSrc异种移植物。当异种移植物达到约100mii^的平均体积时开始抗体治疗。用lmgmAb806处理小鼠2周，每周3次(第18、20、22、25、27和29天)。数据表示为平均肿瘤体积土SE。图8A和8B:U87MG.A2-7细万包中内化的mAb806-Cy3和EEA1或lgp-120的共定位。(A)在4。C用mAb806-Cy3(红)预孵育接种在玻璃盖玻片上的细胞(0分钟)。通过在37'C孵育10、20和30分钟来刺激内化。将细胞固定和透化，然后先后用抗EEA1、Cy2结合的驴抗小鼠抗体(绿)染色。共定位在融合图像中用黄色指示(箭头)。比例尺=20nm。(B)用GFP标记的lgp-120(lgp-120-GFP;绿)瞬时转染细胞。阳性转染细胞显示在lgp-120-GFP栏并由绿色箭头显示。转染后，在4。C用mAb806-cy3(红)孵育细胞(红；0分钟)，然后通过在37。C孵育30、60和120分钟来诱导内化。接着，固定样品，mAb806-Cy3和lgp-120-GFP的共定位由融合图像中黄色的存在来指示(白色箭头)。比例尺-10nm。图9A-9F:在U87MG.A2-7细胞中mAb806结合de2-7EGFR后网格蛋白介导的内呑作用和胞内mAb806运输的电子显微镜分析。诱导内化5分钟后，在网格蛋白包被的凹陷(A-B)和小泡(C)中容易地检测出了金粒(mAb806-Au;箭头)。在类似膜小内陷(caveolae)(空心箭头)的结构内不存在金粒(D)。内化10-15分钟后，在类似早期内体(E)的管状嚢泡结构中检测到了金粒。在内化较长时间后，在多泡体中看到了金粒(F)。比例尺=100mn。图10:NR6A2-7细胞中mAb806和mAb528的内化。在4。C用mAb806-Cy3(左栏)或mAb528-Cy3(右栏)预孵育细胞(0分钟)，然后在37。C孵育不同的时间段诱导内化。示出了表示在37'C下15、30和60分钟孵育的图像。在内化前用两种抗体染色与细胞间的膜连接(蓝色箭头)和黏着斑(红色箭头)有关，而一些细胞显示很少的膜染色(红色箭头)。较晚时间点内化的抗体用白色箭头指示。比例尺-20nm。图11:de2-7EGFR变体与其他细胞組分相互作用的示意性代表图。de2-7EGFR具有活性激酶，因此可以自磷酸化、磷酸根转移或为其他激酶磷酸化的靶标。相反，死亡激酶de2-7EGFR仅可以为磷酸化的靶标。最后，DY5构建体可以为磷酸化的靶标并且磷酸根转移其他细胞靶标，如wtEGFR。考虑到mAb528和806都抑制U87MG.DY5异种移植物，但是不抑制U87MG.DK异种移植物，表明这些抗体阻止其他细胞组分磷酸化的能力对它们的抗肺瘤活性是很关键的。图12:用单独的mAb806和达沙替尼或它们的联合制剂进行的U87MG.A2-7src异种移植物治疗。通过在BALB/c棵鼠的两侧腹注射"106细胞而建立U87MG.A2-7src异种移植物，当异种移植物达到约80mm3的平均体积时开始治疗。用溶媒(在dH20中的4%DMSO)、PBS中的1mgmAb806、在4%DMSO(在dH20中)中的10mg/kg"达沙替尼或它们的联合制剂处理小鼠2周，每周三次，在所指定的日期进行。数据表示为平均肿瘤体积士SE。在第33天，联合处理组明显小于仅用mAb806处理的组(p〈0.0076)。图13:用单独的mAb806和达沙替尼或它们的联合制剂进行的U87MG.A2-7src异种移植物治疗。将来自上面实验的数据转化成kaplan-meier存活曲线，4吏用临死或肿瘤体积>1500mn^时的两个端点通过Wilcoxon分析来进行分析。联合组比其他组存活时间长，LogRankp<0.0001。具体实施例方式根据本发明，可以采用本领域技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有完整的解释。参见，例如，Sambrook等人,"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology，，第I國III巻[Ausubel，R.M.，编辑(1994)；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"第I-III巻[J.E.Celis，编辑(1994)；"CurrentProtocolsinImmunology"第I-III巻[Coligan，J.E.，编辑(1994)1;"OligonucleotideSynthesis"(M.J.Gait编辑1984);"NucleicAcidHybridization"[B.D.Haines&S.J.Higgins编辑(1985)];"TranscriptionAndTranslation"[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984)；"AnimalCellCulture"[R.I.Freshney，编辑(1986)；"ImmobilizedCellsAndEnzymes"[IRLPress,(1986)J;B，Perbal，"APracticalGuideToMolecularCloning"(1984)。因此，如果在本文中出现，则下列术语应具有下列定义。术语"抗体"描述天然或部分或完全合成制备的免疫球蛋白。抗体包括结合特异性表位的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语涵盖多克隆、单克隆、重组、人源化和嵌合抗体。该术语还涵盖具有为抗体结合结构域或与其同源的结合结构域的任何多肽或蛋白。此术语还涵盖CDR移植抗体。由于抗体可以多种方式修饰，所以术语"抗体"应理解为涵盖含有具有所需特异性的结合结构域的任何特异性结合部分或物质。因此，此术语涵盖抗体片段、衍生物、抗体的功能性等同物和同源物，其包括含有免疫球蛋白结合结构域的天然或完全或部分合成的任何多肽。因此，包括融合至另一多肽的含有免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023和美国专利No.4,816,397和4,816,567。据显示，整个抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由VL、VH、CL和CH1结构域构成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域构成的Fv片段；(iv)由VH结构域构成的dAb片段(Ward,E.S等人，Nature341，544-546(1989));(v)分离的CDR区；(vi)F(ab，)2片段，包含两个相连的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv),其中VH结构域和VL结构域通过肽连接子连接，所述肽连接字使两个结构域连接以形成抗原结合位点(Bird等人，Science,242，423-426，1988;Huston等人，PNASUSA，85,5879-5883,1988);(viii)多价抗体片段(scFv二聚体、三聚体和/或四聚体(Power和Hudson,JImmunol.Methods242:193-2049(2000));(ix)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965);和(x)通过基因融合构建的"双功能抗体Uiabody)，，、多价或多特异性片段(WO94/13804;P.Holliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,(1993))。"抗体结合位点"是由特异性结合抗原的轻链或重链和轻链可变和高变区构成的抗体分子结构部分。如本文所用的各种语法形式的短语"抗体分子"涵盖完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。示例性的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子含有互补位的那些部分，包括本领域内已知的那些部分，如Fab、Fab，、F(ab，)2和F(v),这些部分优选用于本文所述的治疗方法。抗体可以是双特异性的，其中抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合部分，另一结合结构域具有不同的特异性，如募集效应子的功能等。本发明的双特异性抗体包括其中抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合部分，包括其片段，另一结合结构域是不同的抗体或其片段，包括不同的抗EGFR抗体，例如抗体528(美国专利No.4,943,533)、嵌合和人源化225抗体(美国专利No.4,943,533和WO/9640210)、抗de2-7抗体(如DH8.3)(Hills，D.等人(1995)Int.J.Cancer63(4):537-543)、抗体L8A4和Y10(Reist，CJ等人(1995)CancerRes.55(19):4375-4382;FoulonCF等人(2000)CancerRes.60(16):4453國4460)、ICR62(ModjtahediH等人(1993)CellBiophys.1月國7月；22(1-3):129-46;Modjtahedi等人(2002)P.A.A.C.R.55(14):3140画3148、或Wikstrand等人的抗体(WikstandC.等人(1995)CancerRes.55(14):3140-3148)。另一结合结构域可以是识别或靶向特定细胞类型的抗体，如神经或胶质细胞特异性抗体。在本发明的双特异性抗体中，本发明抗体的一个结合结构域可以与识别特定细胞受体和/或以特定方式调节细胞的其他结合结构域或分子组合，如免疫调节因子(如，白细胞介素)、生长调节因子或细胞因子(如，肿瘤坏死因子(TNF),尤其是2002年2月13日提交的U.S.S.N,60/355，838(其全文并入本文)中所展示的TNF双特异性形式)或毒素(如，蓖麻毒蛋白)或抗有丝分裂或凋亡的药剂或因子。抗体分子的Fab和F(ab，)2部分可以通过熟知的方法对基本上完整的抗体分子分别进行木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白水解反应来制备。参见，例如授予Theofilopolous等人的美国专利No.4，342，566。Fab，抗体分子部分也是熟知的，它由F(ab，)2部分如下制备如用巯基乙醇还原连接两个重链部分的二硫键，接着用诸如碘代乙酰胺等试剂将所得蛋白硫醇烷基化。含有完整抗体分子的抗体在本文中是优选的。各种语法形式的短语"单克隆抗体，，是指仅具有一种能够与特定抗原发生免疫反应的抗体结合位点的抗体。因此单克隆抗体通常表现出对与其发生免疫反应的任何抗原的单一结合亲和力。单克隆抗体还可以含有具有多个抗体结合位点的抗体分子，每个抗体结合位点对不同抗原具有免疫特异性；例如，双特异性(嵌合)单克隆抗体。术语"抗原结合结构域"描述含有特异性结合部分或整体的抗原并与其互补的区域的抗体部分。当抗原很大时，抗体可以仅结合抗原的特定部分，该部分称为表位。抗原结合结构域可以有一个或多个抗体可变结构域。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。术语"mAb806，，、"806抗体"、"单克隆抗体806"、"ch806，，、"人源化806"以及没有特别列出的任何变体在本文中可以互换使用，并且如在整个本申请和权利要求提到中所用。因此，还涵盖了显示出基本上等同的或改变的活性的抗体，包括重组的、嵌合的、遗传修饰的或其他抗体。这些修饰可以是特意的，例如，通过定点突变获得的修饰；或可以是偶然的，如通过在为抗体或其片段的制造者的宿主中突变而获得的那些。术语"mAb806，，、"806抗体"、"单克隆抗体806"、"ch806，，、"人源化806，，还旨在包括本文具体记载的以及技术人员已知的、公开揭示的在它们范围内的蛋白和免疫球蛋白，以及所有基本上同源的类似物和等位变体。mAb806抗体(包括其制备、具体活性、氨基酸和核酸序列、抗原结合结构域、可变区序列)已公开并且是技术人员已知的，包括下列文献中所提供的WO02/092771;LuworRB等人(2001)CancerRes61:5355-5361;MishimaK等人(2001)CancerRes61:5349-5354;JohnsTG等人(2002)IntJCancer98:398-408;JungbluthAA等人(2003)ProcNatlAcadSci100(2):639-644，其每一篇的全文以引用方式并入本文。应了解还在用于本发明方法的组合物范围内的是编码和/或有效表达抗EGFR抗体(尤其包括mAb806和ch806)的DNA序列，该DNA序列编码抗EGFR抗体、其抗原结合结构域、或其具有与mAb806抗体(如所公开的和技术人员已知的)相同的氨基酸序列的活性片段，但该序列简并成已知的mAb806序列。所谓"筒并"意指不同的三字母密码子用来指定特定的氨基酸。短语"src抑制剂"涵盖并且包括降低src表达或活性、降低src磷酸化位点(尤其是EGFR上的)的磷酸化、或降低src激酶级联信号的任何调节因子。调节因子可以包括化学基团(chemicalentity)、肽、抗体或其他此类药剂等。调节因子可以包括激酶抑制剂、磷酸酶等。已有几种已知的小分子src抑制剂，一些已经进入临床试验，例如达沙替尼(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PP1(4國氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3,4-d!-嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-嘧咬)、PD166326。短语"药物上可接受的"是指分子基团和组合物，其在给予人时为生理上可耐受的，并且通常不产生过敏或类似的不利反应，如心嘈、眩暈等。短语"治疗有效量"在本文中意指足以防止，优选降低至少约20%，更优选至少30%，仍然更优选至少50%，更优选至少70%,更优选至少90%的下列现象的量在S期靶细胞团活性的临床显著改变；或靶细胞团或肿瘤的大小或体积的显著改变；或可能与其存在和活性有关的其他病理特征。抗体或活性片段可以配制成治疗组合物，为中和的药物上可接受的盐形式。药物上可接受的盐包括酸加成盐(与具有多肽或抗体分子的游离氨基一起形成)以及与诸如盐酸、磷酸等无机酸或诸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等有机酸一起形成的那些。由游离羧基形成的盐也可以由诸如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物等无机碱以及诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等有机碱衍生。含有治疗抗体或活性片段的组合物通过例如注射单位剂量而进行常规的静脉内给予。术语"单位剂量"当指示本发明的治疗组合物时是指适合用作人的单位剂量的生理上离散的单元，各单元含有经计算能与所需稀释剂(即，载体或溶媒)一起产生所需的治疗效果的预定量的活性材料。组合物以与剂量、制剂相匹配的方式以治疗有效量给予。要给予的量取决于要治疗的受试者、受试者的免疫系统利用活性成分的能力、所需的抑制程度或靶向的肿瘤质量。需要给予的活性成分的精确量取决于执业医生的判断，并且每个个体都是独特的。然而，适宜的剂量可以介于约0.1至20，优选约0.5至约10，更优选1至若干毫克活性成分/千克个体体重/天，并且视给药途径而定。对于初始给药和加强注射的适宜方案也不同，但典型的是初始给药之后是以一个或多个小时间隔进行重复剂量的后续注射或另行给药。或者，构思足以维持血液中IO纳摩尔至IO微摩尔的浓度的连续静脉内输注。如本文所用，"pg"意指皮克，"ng"意指纳克，"ug"或"fig"意指微克，2"mg"意指毫克，"ul"或"nl"意指微升，"ml"意指毫升，"1"意指升。因此通过证明抗EGFR抗体，尤其mAb806的抗肿瘤活性提供并提出(raised)了治疗和诊断应用和方法。如之前所显示和本文所进一步改进，本发明构思了EGFR所参与的反应和信号传导级联中的药物千扰以调节与EGFR突变(包括激酶结构域突变，原发和继发耐性突变)相关的肿瘤发生能力。本发明还提供在哺乳动物中治疗EGFR介导的癌症的方法，其包括给予所述哺乳动物src抑制剂和抗EGFR抗体。在一个方面，src抑制剂和抗EGFR抗体同时给予。在一个方面，src抑制剂和抗EGFR抗体在传统化疗之前或之后同时或连续且重复给予。所述抗EGFR抗体，尤其mAb806可以在该方法中单独给予或与其他抗EGFR抗体联合给予。MAb806也可以连续或与包括下列的其他抗EGFRvIII抗体联合给予西妥昔单抗、ABX-EGF(帕尼单抗)、DH8.3、L8A4和/或它们的活性片段。src抑制剂可以在该方法中单独给予或可以与一种或多种抗EGFR抗体和任选地一种或多种src抑制剂联合给予。所述抗EGFR抗体可以与适宜的载体一起以能通过各种方法有效给予患者的强度制备成药物组合物。可以采用各种给药技术，尤其是肠胃外技术，如皮下、静脉内和腹膜内注射、导管插入等。抗体或其活性片段的量可以不同，具体应根据执业医师或兽医的建议和药方而定，包括对本文所提供的结果和数据的考虑。src抑制剂可以与适宜的载体一起以能通过各种方法有效给予患者的强度制备成药物组合物。可以采用各种给药技术，尤其是肠胃外技术，如皮下、肌内、静脉内和腹膜内注射、导管插入等；和/或口服给药或经皮给药或涂覆。src抑制剂的量可以不同，具体应根据执业医师或兽医的建议和药方而定，包括对本文所提供的结果和数据的考虑。还可制备适于给药的为一种或多种抗EGFR抗体和一种或多种src抑制剂的联合的药物组合物。本发明的抗体可以用可检测的或功能标签标记。可检测的标记包括但不限于放射性标记，如同位素311、"C、32P、35S、36C1、slCr、57Co、58Co、59Fe、90Y、mI、124I、125I、131I、mIn、211At、198An、67Cu、225Ac、213Bi、"Tc和^Re，它们可以使用抗体成像领域内已知的常规化学方法与本发明的抗体相连。标记还包括荧光标记和MRI-CT图像领域内常规使用的标记。它们还包括酶标记，如辣根过氧化物酶。标记还包括化学部分，如生物素，其可以通过结合特定同源可检测部分(如，标记的亲和素)而,皮检测到。功能标记包括经设计靶向肿瘤部位引起肿瘤组织破坏的物质。这种功能标记包括细胞毒性药物，如5-氟尿嘧啶或荒麻毒蛋白和诸如细菌羧肽酶或硝基还原酶等能够在胂瘤部位将前体药物转化成活性药物的酶。放射性标记的抗EGFR抗体及其片段可用于体外诊断技术和体内放射成像技术以及放射免疫治疗。在体内成像的情况下，本发明的特异性结合部分可以与成像剂而非放射性同位素结合，成像剂包括但不限于磁共振成像增强剂，其中，例如抗体分子用大量顺磁离子通过螯和基团加载。螯和基团的实例包括EDTA、p卜啉、聚胺冠醚和聚肟。顺磁离子的实例包括轧、铁、锰、铼、铕、镧(lanthanium)、钬和铽(ferbium)。在本发明另一方面中，放射性标记的特异性结合部分，尤其抗体及其片段，尤其是放射免疫结合物，可用于放射免疫治疗，尤其是作为放射性标记的抗体用于癌症治疗。在又一方面中，放射性标记的特异性结合部分，尤其抗体及其片段，可用于放射免疫引导的手术技术，其中它们可以在手术之前、之中或之后辨别并说明癌细胞、癌前细胞、肿瘤细胞和过度增殖细胞的存在和/或定位以清除这些细胞。其中本发明的特异性结合部分(尤其抗体及其片段)结合或连接到其他分子或药剂上的本发明免疫结合物或抗体融合蛋白还包括但不限于结合至化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性药剂、化疗剂或药物的结合部分。使用多种抗体免疫结合物的放射免疫治疗(RAIT)已经进入临床并且证明是有效的。已经在结肠直肠癌中评价131I标记的抗癌胚抗原(抗CEA)抗体hMN-14(BehrTM等人(2002)Cancer94(4Suppl):1373-81),评估了在甲状腺髓样癌中具有90Y标记的相同抗体(SteinR等人(2002)Cancer94(1):51-61)。还评估和报道了非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)和胰腺癌使用单克隆抗体的放射免疫治疗(GoldenbergDM(2001)CritRevOncolHematol39(1-2):195-201;GoldDV等人(2001)CritRevOncolHematol39(1-2)147-54)。使用特定抗体的放射免疫治疗法还描述于美国专利6,306,393和6,331,175。放射免疫引导的手术(RIGS)也已经进入临床并且证明有效和有用，它们包括4吏用抗CEA抗体和针对肺瘤相关抗原的抗体(KimJC等人(2002)IntJCancer97(4):542-7;SchneebaumS等人(2001)WorldJSurg25(12):1495-8;AvitalS等人(2000)Cancer89(8):1692-8;McintoshDG等人(1997)CancerBiotherRadiopharm12(4):187-94)。本发明的抗体可以经由任何适宜的途径给予需要治疗的患者，通常通过注射进血流或CSF，或直接注射进肿瘤部位。精确的剂量取决于许多因素，包括抗体是用于诊断还是治疗、肿瘤的大小和位置、抗体的确切性质(是否完整抗体、片段、双功能抗体等)、以及连接到抗体的可检测的或功能标记的性质。在使用放射性核素治疗时，适宜的最大单剂量为约45mCi/m2至最多约250mCi/m2。优选的剂量介于15至40mCi，更优选的剂量介于20至30mCi,或10至30mCi。这种治疗可能需要骨髓或干细胞替代。用于肿瘤成像或肿瘤治疗的通常抗体剂量介于0.5至40mg，优选l至4mgF(ab，)2形式的抗体。棵抗体的优选给予剂量为20至1000mg蛋白/剂量、或20至500mg蛋白/剂量、或20至100mg蛋白/剂量。这是用于成年患者单一治疗的剂量，它可以按比例调节用于儿童和婴儿，还可以分子量比例调节用于其他抗体形式。治疗可以按医师的判斯以每天一次、每周两次、每周一次或每月一次的间隔重复。src抑制剂的剂量和给药可以由医师或本领域内其他技术人员确定和变化。参考下列非限制性实施例可以更好地理解本发明，这些实施例作为本发明的示例提供。下列实施例的列举是为了更充分的例示本发明的优选实施方式，然而，它们不应该以任何方式理解为是对本发明范围广度的限制。实例1SRC失活或抑制后EGFR特异性抗体的效力增强影响针对EGFR的治疗性单克隆抗体(mAb)效力的因素仍然不够了解，尤其在胶质瘤中。检测了两种EFGR特异性mAb(mAb806和528)抗U87MG源胶质瘤异种移植物的效力，这种异种移植物表达EGFR变体。使用这种方法使得能够在改变EGFR形式的同时保持遗传背景恒定。这些变体包括在胶质瘤中表达的EGFR组成性活性突变体de2-7EGFR(或EGFRvIII)。mAb的效力与EGFR数目相关，然而最重要的因素是受体激活。尽管表达de2-7EGFR的U87MG异种移植物对治疗有反应，但展示死亡激酶de2-7EGFR的那些是不反应的。具有激酶活性但是自磷酸化缺陷型的经修饰的de2-7EGFR也有反应，这表明这些mAb在表达de2-7EGFR的异种移植物中通过阻断磷酸根转移起作用。由于表达de2-7EGFR的U87MG还共表达wtEGFR，所以还在分离物中测试了mAv抗表达de2-7EGFR的NR6异种移植物的效力。尽管mAb806表现出对NR6异种移植物的抗肿瘤活性，但mAb528治疗是无效的，这表明mAb528通过破坏de2-7和wtEGFR之间的相互作用介导其抗肺瘤活性。最后，表达de2-7EGFR的U87MG异种移植物中的基因破坏显著增强了mAb806的效力。在胶质瘤中EGFR特异性抗体的有效使用依赖于具有活化EGFR的肺瘤的鉴别。EGFR和Src抑制剂的联合制剂提供了治疗胶质瘤的新且有效的策略。背景表皮生长因子受体(EGFR)是具有内在酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。在许多表皮肿瘤中都观察到EGFR的过量表达，它通常与较差的临床预后有关(l-3)。EGFR的过量表达可能由EGFR基因扩增导致，尤其在胶质瘤中(4)。在胶质瘤中，基因扩增与最常见的突变EGFR重排有关，该突变de2-7EGFR(或EGFRvIII)的特征在于跨越编码序列的外显子2至7的801个碱基对框内缺失(4-6)。这种重排导致来自胞外结构域的267个氨基酸缺失和在融合位点一个新的甘氨酸插入，所有这些产生了独特的连接肽。尽管de2-7EGFR不能结合任何已知的配体，但是受体表现出低水平的组成性激活并且能够增强胶质瘤和乳腺癌异种移植物的生长(7，8)。抑制EGFR是开发新的癌症治疗法的合理策略。可能的治疗法包括针对EGFR的单克隆抗体(mAb)(例如，C225、ABX-EGF、EMD55900)(9-ll)和EGFR的小分子量酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(例如，ZD1839、OSI774)(12)。事实上，这些治疗法的一些已在肺癌(ZD1839,Iressa)和结肠癌(C225，Erbitux)的有限临床应用中得到批准。从这些临床试验很清楚的是并非所有EGFR阳性的患者对这些靶向治疗法都有反应(表1)。从患者的福利和经济观点来看，确定引起患者对EGFR治疗法易感的因素是重要的目标。同样理解耐EGFR治疗法的性质可以有助于确定克服它的方法。表1与对EGFR治疗法敏感性相关的细胞方面<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>水平的EGFR表达。其次，在EGFR失活后，维持通过PI3激酶/Akt通路的信号传导的能力降低TKI的效力(表l)。这些研究大部分在体外进行，因此不知道这些观察结果在体内环境中是否仍然正确。最近，一些研究分析了用易瑞沙(Iressa)(ZD1839)治疗的肺癌患者中EGFR基因的状态，发现对治疗反应的患者通常获得了激酶结构域的功能突变(表l)。此外，还描述了导致易瑞沙抗性的继发性激酶突变(表1)。然而最初的研究表明，这些现象并不普遍，而且肺癌患者中所述的突变并没有在其他类型的肿瘤中观察到。使用抗EGFR抗体的研究的有限数量使得很难得出任何关于对这些药剂易感性的概括(表1)。除了缺乏体内研究之外，这些易感性研究中的一些是用细胞板进行的，考虑到细胞系之间信号通路以及是否存在其他ErbB家族成员不同，使得很难确定与EGFR敏感性或抗性相关的单独因素。为了解决这些问题中的一些，我们检测了体内U87MG胶质瘤细胞系对两种EGFR特异性抗体的易感性，该细胞系表达适中水平的野生型(wt)EGFR。然后，我们用一些wt和de2-7EGFR构建体转染U87MG细胞以确定受体的数目和活化对抗体治疗易感性有何影响。此研究中所用的两种抗体为mAb806和528。MAb806是针对表达de2-7EGFR的细胞产生的新型抗EGFR特异性抗体(13)。有趣的是，尽管mAb806清楚地结合de2-7EGFR,但是它还结合wtEGFR的一个亚型(约10%)，该亚型在过量表达该受体的细胞表面上表达(13)。最近的分析表明所述mAb806表位仅在受体由其失活状态向活性状态转化时过渡存在的EGFR构象形式中暴露(14)。与wtEGFR不同，de2-7EGFR在此过渡构象中是组成性的，因此可用于mAb806结合。我们先前的研究已显示用mAb806处理表达de2-7或过量表达wtEGFR的异种移植物会引起肿瘤生长的显著抑制(15-17)。同时，制备和分离了528抗体作为鼠源C225抗体(Erbitux)，其表现出了类似的性质(18)。MAb528用作配体拮抗剂，抑制体外和体内作为异种移植物生长的表达EGFR的细胞生长(18)。材料和方法细胞系和单克隆抗体U87MG转染的细胞系U87MG.A2-7、U87MG.DK、U87MG.wt、U87MG.DY5和U87MG.DY2已在其他地方有详细描述(16，19)。A431细胞系之前也已有所描述(20)。所有细胞系都保持在含有下列物质的DMEM(DMEM/F12;LifeTechnologies,Inc，GrandIsland,NY)或RPMI中10%FCS(CSL，Melbourne,Victoria,Australia),2mM谷氨酰胺(SigmaChemicalCo,St.Louis,MO)、和青霉素/链霉素(LifeTechnologies,Inc，GrandIsland,NY)。此外，转染的细胞系保持在400mg/ml的遗传霉素(LifeTechnologies,Inc，Melbourne,Victoria,Australia)中。mAb806和528在生物制备机构(澳大利亚墨尔本的路德维格研究所)制备。抗EGFR特异性酪氨酸磷酸化位点的抗体和兔多克隆抗EGFR抗体得自CellSignalingTechnology(Danvers，MA)。用小鼠单克隆抗体v-src327(OncogeneResearchProducts,CA，USA)或c-SrcH-12(SantaCruzBiotechnology,Inc，CA，USA)检测src。兔多克隆抗体PY418(BioSouceInternational,Inc"CA，USA)用于检测磷酸國Src。抗磷酸酪氨酸抗体4G10购自UpstateBiotechnology(LakePlacid,NY)。C13用于检测野生型和平截的EGFR，其得自BDTransductionLaboratory(SanDiego,Ca)。U87MG.A2-7DNSrc细胞系的制备显性负相(dominantnegative,DN)激酶死亡Src构建体(K296R/Y528F)得自UpstateBiotechnology(LakePlacid,NY,USA)。将含有DNSrc的HindIII片段亚克隆到得自InvitrogenLifeTechnologies(Carlsvad,CA)的pcDNA3.1/Hygro(+)栽体中，所得构建体通过电穿孔转染到U87MG.A2-7细胞。还制备仅用pcDNA3.1/Hygro栽体转染的第二细胞系。将lml等分试样中的细胞铺到96孔板上，密度为约2xl(^细胞/孔，在37'C下醉育48小时，然后添加100ng/ml潮霉素(RocheDiagnostic,Mannheim，Germany)。获得克隆后(约两周)，将细胞放回400照/ml遗传霉素以及潮霉素中。转染的细胞首先通过FACS分析筛选以确定其保持de2-7EGFR的表达。然后将克隆进行全细胞裂解或免疫沉淀，之后用Src特异性抗体(v-Src327、c-SrcH-12)进行western印迹。鉴别并扩增表现出显著增高水平的总src(Src水平在原始细胞系中极低)的几个克隆。然后通过用v-Src327抗体免疫沉淀35S标记的细胞裂解物，对所得沉淀进行SDS-PAGE和定量放射自显影来进一步确定增加的Src水平。选择表达最高水平DNSrc的克隆，据显示DNSrc在Y418位处磷酸化，这表明它净皮正确折叠。体外生长分析按照以前的详细描述检测体外mAb806和528的抗增殖效果。简言之，将细胞以lxl04细胞/孔接种在24孔板上，细胞在含有0.5%FCS的培养基中。4天后用胰蛋白酶移除细胞并用血细胞计数器计数。抗体以100ng/ml的终浓度使用，该浓度与异种移植物中所得到的一致。异种移植物模型将在100plPBS中的肿瘤细胞(3xl0M皮下接种至4至6周龄的雌性棵鼠(AnimalResearchCentre,Perth,Australia)两侧腹。所有研究都4吏用如先前报道建立的肿瘤模型来进行(15，16)。当肿瘤达到约100mm3的平均体积时开始处理。使用公式(长x宽"/2来确定肺瘤体积(mm3),其中长为最长的轴，宽为与长呈直角的尺寸。每个处理组数据表示为平均肿瘤体积士SE。所有数据通过学生t检验分析显著性。每个研究中每组最少使用IO个异种移植物。免疫印迹将细胞在冷裂解緩冲液(30mMHEPES、150mMNaCl;10mMNaF;1%TritonX-100;200Na03V;0.4%H202和含有500AEBSF、150nM抑肽酶、1fiME-64蛋白酶抑制剂、0.5mMEDTA和1jiM亮肽酶素的蛋白酶抑制剂混合物1(Calbiochem，SanDiego,CA)，pH7.4)。用mAb806或528免疫沉淀裂解物，通过我们详细描述的免疫印迹分析所得沉淀物(21)。免疫荧光显微术使用花青素3(Cy3)单克隆抗体标记试剂盒(AmershamPharmaciaBiotechUKLtd，Buckinghamshire,England)根据厂家的说明用Cy3直接标记Mab806和528。通过结合U87MG.A2-7细胞的流式细胞术分析来确定成功标记的抗体。早期内体特异性的抗小鼠早期内体自身抗原1(EEA1)单克隆抗体购自Transduction实验室(SanDiego,CA,U.S.A.)。Cy2结合的AffiniPureF(ab，)2片段驴抗小鼠IgG二抗和未标记的AffiniPureFab片段羊抗小鼠IgG封闭抗体购自JacksonImmimoResearch实验室(WestGrove,PA，U.S.A.)。在37。C下在补充有10%FBS、青霉素/链霉素和谷氨酸盐的MEM(GibcoBRLGrandIsland,NY，U.S.A.)中使U87MG.A2-7或NR6.A2-7细胞在12mm玻璃盖玻片或12mmBiocoat细胞环境聚-D-赖氨酸盖玻片(BectonDickinsonLabware，Bedford,MA，U.S.A.)上生长。在存在0.25。/。牛血清白蛋白(BSA)(SigmaChemicalCo"StLouis,MO，U.S.A.)的条件下进行抗体与细胞的结合。Cy3结合的mAb806和528分別以5ng/ml和2jig/ml的浓度4吏用，表面标记在加湿条件下在4'C下进行20分钟。将细胞在冰冷的0.25y。牛血清白蛋白(BSA)/PBS中洗涤3次。表面结合抗体的内化通过在37。C下孵育各盖玻片而开始。在内化不同时间段之后，将各盖玻片从37。C移出，在水冷的BSA/PBS中洗涤3次终止内化，将其在室温下在4。/。PFA中固定20分钟。然后将盖玻片在BSA/PBS中洗涤，之后在双蒸水(DDW)中洗涤，用fluoromountG封固剂(SouthernBiotechnology,Birmingham,AL，U.S.A.)将其封固在玻璃栽玻片上。用共聚焦显微镜(MkonInstechCo.,Ltd.,Kanagawa，Japan)使用适当的波长设置分析样品。对于共定位研究，用0.1。/。tritonX-100将细胞透化l分钟。然后，洗涤样品，在室温下用未标记的山羊抗小鼠Fab片段孵育20分钟以封闭所有存在的小鼠结合位点(即，内化的mAb806或528)。然后在BSA/PBS中洗涤样品，之后在室温下用抗EEA1孵育20分钟。最后洗涤细胞，用Cy2结合的驴抗小鼠F(ab，)2二抗片段孵育。绿色荧光蛋白(GFP)标记的溶酶体糖蛋白120(lgp-120國GFP)的DNA载体由IraMellman教授和来自耶鲁大学医学院(NewHaven，CT，U.S.A.)的细胞生物学系的教授友情提供。细胞生长在含有包埋的14mm玻璃盖玻片的mat-tek玻璃底微孔皿(MatTekCorp.Ashland，MA，U.S.A.)中，使用LipofectAMINE试剂(InvitrogenLifeTechnologies,Mulgrave，Vie,Australia)按照厂家的说明对这些细胞转染过夜。转染24小时后进行阳性转染细胞的共聚焦成像，阳性转染细胞在用488nm波长的光激发时发绿色荧光。结果体外和体内敏感性之间的相关性表l中所述的许多研究已在体外进行。我们用靶向EGFR治疗的mAb和TKI进行实验均清楚地表明体外敏感性与体内反应不完全相关。事实上，我们最近公开的一个实施例中，两种细胞系在体外表现出对EGFR特异性TKIAG1478类似的敏感性，但它们对相同药剂的体内反应则显著不同(22)。使用先前所述的用于C225的标准体外生长抑制分析和与异种移植物部位所达到的浓度一致的抗体浓度，我们在体外抗体抑制和体内抗肿瘤活性之间看到了很小的相关性(参见表2)。mAb528或806在体外均不抑制U87MG.A2-7细胞的生长，^f旦是两种抗体在体内都显示出很强的抗肿瘤活性，该活性不依赖于免疫效应子功能(参见图2)。并且，即使一种耙向EGFR的抗体在特定细胞系显示出体外与体内的相关性(例如，mAb528在A431细胞和异种移植物中，表2)，这也不一定表明另一EGFR特异性抗体在相同的细胞系中是相关的(例如，mAb806在A431细胞和异种移植物中，表2)。此样品分析与我们之前的观察结果一起清楚地表明体外分析在确定对EGFR治疗法敏感性中价值有限。表2对EGFR治疗法敏感性的体外和体内比较细胞系U87MG.A2-7A431mAb528mAb806mAb528mAb806体外--++体外*+++++*A431异种移植物的体外数据来自我们最近的论文(16)表达不同形式EGFR的U87MG胶质瘤异种移植物的抗体治疗将表达中等水平的wtEGFR的亲本U87MG细胞、或用额外wtEGFR、de2-7EGFR或各种《奮饰形式的de2-7EGFR(图1)转染的相同细胞系皮下注射到棵鼠中以建立肿瘤异种移植物。在异种移植物达到约100mmS时开始用抗体处理。用1mgmAb528或806处理所有肿瘤2周，每周3次。选择这样的抗体治疗剂量和方案其在我们的标准U87MG.A2-7异种移植物模型中引起强的抗肺瘤反应，但是不足以有效以致于在其他U87MG源细胞系(含有不同EGFR变体)中可能看到的任何抗肿瘤活性增加不明显。如下面所详细讨论，mAb806和528的抗肿瘤效力在所有的U87MG源胶质瘤异种移植物中是类似的(图2)。1、亲本细胞(U87MG):尽管事实上U87MG异种移植物表达中等水平的EGFR(约5xl0"受体/细胞)，但两种抗体都不抑制U87MG异种移植物的生长(13)。2、过量表达wtEGFR的细胞(U87MG.wt):用wtEGFR转染U87MG细胞来增加表达(约"106受体/细胞)并不改变异种移植物的体内生长速率(图3A)但是确实引起肿瘤变得对两种抗体都敏感。这对于mAb806来说并不奇怪，因为它优先结合过量表达wtEGFR的细胞，而对于mAb528来说则有些出乎意料，因为这表明即使在不存在表型改变的条件下受体数目的增加也能诱导对抗体治疗的反应。在第31天，当处死对照组时，mAb528诱导的抑制是显著的(p〈0.01),溶媒组中异种移植物的平均肿瘤体积为950mm3,相比之下在mAb528处理組中的为450mm3。在第39天mAb806实验的分析表明抗体处理显著抑制异种移植物生长(p〈0.001)，其中PBS和mAb806组的肺瘤体积分别为960mm3和470mm3。3、表达de2-7EGFR的细胞(U87MG.A2-7):用组成活性的但不依赖于配体的de2-7EGFR转染的U87MG异种移植物的生长也^L两种抗体抑制(图2)。与wtEGFR过量表达不同，在内源wtEGFR的存在下共表达de2-7EGFR会对U87MG异种移植物产生显著的生长优势(图3B)。该受体的组成性磷酸化用免疫印迹来确定(图4)。用mAb528处理显著抑制肿瘤生长(p〈0.005),其中在接种后第20天溶媒组的平均肿瘤体积为1170mm3，相比之下mAb528组为510mm3。考虑到mAb528的主要功能祐:认为是配体拮抗，其对表达不依赖配体的de2-7EGFR的异种移植物的抗肺瘤活性是意料之外的。因此，mAb528可能通过其阻断配体能力之外的其他机制破坏EGFR信号传导。同样，在这些细胞中仅结合de2-7EGFR而不结合wtEGFR的mAb806—定不依赖于对配体相互作用的任何影响而介导其抗肿瘤活性，因为它抑制表达de2-7EGFR的异种移植物生长的水平与mAb528类似。在第21天，当挑出溶媒组时，对照异种移植物的平均肿瘤体积为1500mm3,相比之下mAb806处理组中则显著较低，为390mm3(p<0.0001)。因此两种抗体都可以抑制表达不依赖配体4旦是为组成性活性形式的EGFR的胶质瘤异种移植物。4、表达de2-7EGFR死亡激酶形式的细胞(U87MG.DK):用de2-7EGFR死亡激酶(DK)形式转染的U87MG细胞作为异种移植物以类似于亲本细胞的速率生长(图3B),并且生长不被任一抗体显著抑制(图2)。这种受体缺乏与信号传导相关的主要位点的磷酸化，但是保留着与受体内化和降解相关的位点的磷酸化(图4)。两种抗体与这些细胞的结合在体外和体内都与表达de2-7EGFR的细胞中所看到的类似(16)。此外，由于de2-7EGFR的DK变体仅含有单个胞内点突变，结合胞外结构域的mAb806和528的亲和力不应有变化。这个结果表明在体外由这些抗体介导的任何免疫效应子功能不足以启动抗肿瘤反应。此外，这表明抗EGFR抗体的抗肺瘤活性需要具有功能激酶结构域的受体。5、表达2个自磷酸化主要位点缺失形式的de2-7EGFR的细胞(U87MG.DY2):表达在两个主要的自磷酸化位点不能自磷酸化的de2-7EGFR构建体(酪氨酸1068和1173变为苯丙氨酸)的U87MG异种移植物在作为肿瘤异种移植物生长时被两种抗体显著抑制(对于mAb528和806分别为p<0.01和0.006)(图2)。这种观察结果结合缺乏抗U87MG.DK异种移植物的活性表明，与自磷酸化相对的激酶活性与抗体治疗的反应性相关。6、表达不能自磷酸化形式的de2-7EGFR的细胞(U87MG.DY5):表达在与信号传导相关的所有5个主要自磷酸化位点都不能自磷酸化的de2-7EGFR构建体(酪氨酸1173、1148、1086、1068和992变为苯丙氨酸)的U87MG细胞作为肿瘤异种移植物生长。这种受体缺乏在与信号传导相关的主要位点的磷酸化，但是保持在与受体内化和降解相关的位点的磷酸化(图4)。与用DY2异种移植物所获得的结果一致，两种抗体都显著抑制表达DY5de2-7EGFR构建体的异种移植物的生长(对两种抗体均为p〈0.0001)(图2)。考虑到这个有些出乎意料的结果，我们用两种抗体在较低的剂量(0.5与lmg/注射)重复了此实验，又一次在两种情况下都得到了肿瘤生长的显著抑制(数据未显示)。由于de2-7EGFR的DY5形式不能够直接结合对下游信号传导很关键的衔接分子，这表明活性激酶结特征。表达高水平的de2-7EGFR的U87MG异种移植物的处理图2中的数据表明异种移植物对EGFR信号传导变得越依赖，其越可能对EGFR特异性抗体治疗反应。因此，我们使用FACS分选分离了表达极高水平de2-7EGFR的细胞(U87MG.A2陽7高)(图5A)。U87MG.A2-7高异种移植物比原始U87MG.A2-7异种移植物生长得快(图5B),这表明这些异种移植物的快速生长依赖于高水平的de2-7EGFR。由异种移植物裂解物的免疫印迹测定体内保持de2-7EGFR表达水平(图5C)。用mAb806或mAb528处理引起显著的U87MG.A2-7高异种移植物抑制，该抑制比任何其他U87MG源细胞系所观察到的都强(图5D)。在第18天，当由于伦理原因处死对照组时，溶媒、mAb806和mAb528组的平均肿瘤体积分别为1760、卯和90mm3(p〈0.001)。显著的是，虽然在任何之前的U87MG源治疗研究中没有完全的消退(图2)，40°/。的mAb806处理的和20%的mAb528处理的U87MG.A2-7高异种移植物完全消退。mAb肿瘤中的一个在接种后第46天复发而其他的肿瘤直到第126天小鼠被处死时都没有复发。因此通过过量表达組成活性形式的EGFR而得到的异种移植物对EGFR特异性抗体更加敏感。所建立的NR6源异种移植物的mAb806和528治疗NR6鼠成纤维细胞系不内源表达任何ErbB家族成员(23)，我们用EGFR、ErbB2和ErbB3的FACS确定该现象(数据未显示)。然后用人de2-7EGFR稳、定转染这些细胞(NR6.A2-7)。由于用于测试mAb806和528抗de2-7EGFR效力的所有U87MG源细胞系还共表达wtEGFR,所以我们估计它们在具有所建立的NR6.A2-7异种移植物的小鼠中的治疗效力。mAb806处理导致总体肿瘤生长速率与溶媒相比降低，该降低在接种后第42天特别显著(p0.003)(图6)。治疗最后一天(第39天)溶媒和mAb806处理组的平均肿瘤体积分别为1520和670mm3(图6A)。还用mAb528处理具有所建立的NR6.A2-7异种移植物的小鼠。在接种后第56天，当由于伦理原因处死动物时，用mAb528处理的肺瘤大小与溶媒处理的异种移植物不同(图6B)。我们用略微不同的程序用mAb528进行了第二种治疗实验，其中小鼠接受抗体3周，每周2次。在这些条件下，mAb528还是不能抑制所建立的NR6.A2-7异种移植物的生长(图6C)。因此，与mAb806不同，mAb528在不存在wtEGFR的条件下不能抑制表达de2-7EGFR的异种移植物。Src活性调节表达de2-7EGFR的异种移植物对抗体治疗的反应性由于mAb806和528抑制表达DY5形式的de2-7EGFR的异种移植物，并且由于两种抗体在体内作为单独药剂都不减少de2-7EGFR磷酸化(16)，所以4艮可能这些抗体通过破坏de2-7EGFR下游把标的磷酸才艮转移而介导它们的抗肿瘤活性。我们用NR6.A2-7异种移植物的观察结果表明mAb528的抗肺瘤活性取决于de2-7EGFR与另一ErbB家族成员的共表达，而mAb806活性则不依赖这种相互作用。因此，我们检测de2-7EGFR是否能与src相互作用、wtEGFR的情况下如何、以及这种可能的相互作用是否与mAb806效力有关。wtEGFR的激活导致Src激酶瞬时活化。Src活化以协同方式导致EGFR上的酪氨酸845(Y845)磷酸化，该位点不是自磷酸化位点而是src磷酸化的靶标(24)。我们用Y845特异性的抗体检测了de2-7EGFR中Y845的磷酸化。当在U87MG胶质瘤细胞中表达时，de2-7EGFR显示出Y845的强磷酸化(图7A)。通过用src家族激酶的抑制剂PP1和PP2孵育细胞快速阻断Y845位的磷酸化，而Y1173位的自磷酸化位点则相对不受影响(图7A)。考虑到de2-7EGFR似乎是Src激酶磷酸化的靶标，其方式与wtEGFR类似，我们试图确定这种相互作用是否是mAb806活性的关键。首先，我们构建了含有Y845F取代基的de2-7EGFR,然而此蛋白在多个位点显示出降低的磷酸化(Johns,未公开的观察结果)，因此认为不适于这些研究。因此，如材料方法中所述，我们开发了共表达de2-7EGFR和DNSrc的U87MG细胞系(U87MG.A2-7oNSrc)。U87MG.A2國7丽src异种移植物在棵鼠中作为肿瘤异种移植物生长，但是速率比用载体对照转染的U87MG.△2-7慢(图7B)。用mAb806处理U87MG.A2-7丽^导致肿瘤生长的强烈抑制(图7C)。在接种后第34天，溶媒组的平均异种移植物体积为1220mm3,而mAb806处理组为100mm3(p<0.001)(图7C)。此外，在mAb806处理组中所有U87MG.A2-7dn^异种移植物的60%完全消退，并且到接种后第50天尚未复发。因此抑制Src信号传导增加了mAb806治疗的效力(图7Ccf图2)。U87MG.A2-7细胞中mAb806的内化。mAb806在结合U87MG.△2-7细胞中表达的de2-7EGFR后的胞内运输通过共聚焦显微镜来研究。在4'C下mAb806Cy3孵育之后和在37。C下示踪之前，结合至de2-7EGFR的mAb806沿原生质膜定位(图8A;0分钟，mAb806-Cy3)。37。C下孵育之后，观察到mAb806易位至小的、点状胞质嚢泡上。然后用鉴别早期内体的抗早期内体自身抗原1(EEA1)进行免疫染色，如由黄色荧光的存在所呈现的，其显示出与mAb806的部分共定位(图84;融合)。在37°C下示踪60分钟后，共定位最少(图8A;融合，60分钟)，这表明大部分抗体已经移出了早期胞吞区室。这些观察结果表明mAb806在内化后立即定位在早期胞吞区室上，然后移动到另外的位置，之后进入其胞内运输循环。通过在用lgp-120-GFP瞬时转染的细胞中的共定位分析，在U87MG.△2-7细胞中进行了de2-7EGFR结合和内化后mAb806的溶酶体共定位(图8B)。阳性转染lgp-120-GFP的细胞显示出胞质核周绿色荧光，这与预期的定位到溶酶体区室一致(图8B;lgp-120-GFP)。在诱导内化之前，mAb806-Cy3仅在细胞表面检测到(图8B,0分钟，mAb806-Cy3)，其不与lgp-120-GFP共定位(图8B;0分钟，融合)。在升温至37。C达30分钟后，观察到了对应于内化mAb806的小胞内嚢泡结构(图8B;30分钟后，mAb806-Cy3)。这些结构中的一些与lgp-120-GFP共定位，然而大部分的红色和绿色信号仍然是分开的(图8B;30分钟后，融合)。在37C进行60和120分钟后的较长时间孵育引起内化的mAb806-Cy3与lgp-120-GFP共定位增加(图8B;60-120分钟后，融合)。这些观察结果与如下的假说一致mAb806最初穿过早期内吞区室，但长时间后移入其在此聚集的溶酶体区室。在结合87MG.A2-7细胞上所表达的de2-7EGFR之后的mAb806内化也用电子显微镜分析。在37。C孵育5分钟后，在类似网格蛋白包被的凹陷结构中观察到了对应于mAb806的金粒(图9A和B)。还在位于胞质内的游离的网格蛋白包被的嚢泡中检测到金粒(图9C)。在类似膜小内陷的结构中没有观察到金粒(图9D)。在37'C示踪IO分钟后，mAb806定位至类似早期内吞区室的大的管状嚢泡结构(图9E)。30分钟的较长示踪阶段引起抗体定位在类似多泡体的结构中(图9F)。这些观察结果与表明mAb806与lgp-120在30与60分钟之间共定位的免疫荧光显微镜数据一致。MAb806和528在NR6.A2-7细胞中的内化考虑到mAb806和528抗NR6.A2-7异种移植物的治疗效力不同，在这个细胞系中研究了每一抗体的内化特征。此外，由于NR6.A2-7细胞不表达任何内源的ErbB家族成员，这个细胞系可以测定这些抗体内化是否需要wtEGFR的存在。如所预期，在4。C下用mAb806-Cy3孵育细胞显示出膜染色没有胞内荧光(图10;mAb806,0分钟)。与U87MG.A2-7细胞相反(图8)膜染色不均匀。更强的染色与细胞间的膜连接(图10;mAb806，0分钟)和翁着斑(图10;mAb806，0分钟)有关。一些细胞显示极少的膜染色(图10;mAb806，0分钟)。将温度增至37'C诱导内化后，观察到了特征性胞内点状嚢泡结构。这些以核周形式的聚集(图10;mAb52815至60分钟)与迅速的溶酶体定位一致。mAb528的初始定位(图10;mAb528，0分钟)和随后的内化(图10;mAb528，1-60分钟)与mAb806相同。因此，两种抗体在结合至de2-7EGFR后即4吏在不存在wtEGFR的条件下也都迅速内化到溶酶体区室。讨论mAb528,许多但并非所有的先前研究表明细胞表面的EGFR数目是影响靶向EGFR的治疗法(尤其TKI)效力的一个因素(表l)。然而，这些实验通常比较了使用不同细胞系的抗肿瘤活性，因此没有关于下列方面的对照遗传背景、其他ErbB家族成员的存在和能够调节EGFR信号通路的其他功能受体/激酶的出现。此外，这些研究中的许多在体外进行，而我们已经表明体外与体内活性并不相关。将wtEGFR数目增加IO倍能将U87MG胶质瘤异种移植物由mAb528抗性转化为抗体反应性。由于wtEGFR数目增加并不改变U87MG异种移植物的生长速率，所以抗肿瘤活性的获得并不简单地是mAb528抑制所诱导的生长优势的结果。U87MG.wtEGFR异种移植物中更多wtEGFR的存在几乎一定会引起抗体在肿瘤部位定位增加。考虑到mAb528具有低、但是可检测的免疫效应子功能(25),抗体在肿瘤部位的水平增加可以增加补体沉积和促进肿瘤生长抑制的免疫细胞募集。然而，根据我们关于U87MG.DK异种移植物的数据，mAb528在启动抗肺瘤活性中的免疫效应子功能的作用似乎是不可能的。这些异种移植物具有与U87MG.wtEGFR异种移植物一样多的mAb528结合位点，但是不被抗体抑制。一个有趣的可能性是wtEGFR过量表达引起了不依赖于配体的EGFR信号传导(亲本U87MG似乎不具有强的自分泌-配体环)，这继而使细胞变得对EGFR信号传导系统更加依赖。因此，U87MG.wtEGFR异种移植物对mAb528治疗反应，因为与亲本细胞系不同，EGFR信号传导通路是活性且有功能的。因此，wtEGFR的过量表达是依赖EGFR信号传导的细胞的代表性标记，因此这些细胞更可能但并非一定对EGFR治疗反应(26)。据i/^为抗体(如mAb528)的抗肺瘤活性主要是由它们拮抗EGFR配体激活的能力介导。考虑到mAb528在不存在显著的配体表达的情况下抑制U87MG.wtEGFR异种移植物的生长，这表明其他机制可能作用于抗肿瘤效应。此外，mAb528显示出抗表达不依赖配体的de2-7EGFR的异种移植物的显著效力。这种抗肿瘤活性可能不直接由mAb528结合这些异种移植物中共表达的内源wtEGFR而引起，因为它不抑制亲本U87MG或U87MG.DK异种移植物的生长，U87MG或U87MG.DK都表达相同水平的wtEGFR。除了免疫效应子功能之外，其他的抗肿瘤机制可能包括受体下调、不适当信号传导的诱导、受体向不适宜的膜结构域转移、以及受体二聚化和/或寡聚化的干扰。事实上，一些针对EGFR的TKI不仅通过抑制激酶活性起作用，而且还诱导能够"扫"除过量配体的失活二聚体，这是意料之外的抗肿瘤机制(27)。有趣的是，近期在结肠患者中分析EGFR表达的免疫组织化学研究表明对C225的不同反应，其才艮道几个EGFR"阴性"患者对这种EGFR特异性抗体具有临床反应(26)。推测这些患者具有低于免疫组织化学检测敏感性的EGFR水平，但是所存在的EGFR被激活并促进肺瘤生长/存活。这种观察结果表明EGFR激活如果不比筒单的EGFR表达水平重要的话，至少也与其同样重要。我们的数据显示mAb528不抑制表达死亡激酶形式的这种平截受体(U87MG.DK)的U87MG异种移植物生长，这支持EGFR特异性抗体的效力与激酶活性受体密切相关的观点。如上所建议，EGFR过量表达代表这种激活可以产生的一种机制；组成活性突变体(如de2-7EGFR)的表达则代表了另一种。这种连续的EGFR激活使得细胞变得"陷入"EGFR信号传导，这继而使得它们对抗EGFR治疗易感。这种概念与肺癌患者中的情况类似，其中大部分患者对EGFR特异性TKI反应，该TKI携带着EGFR激酶结构域中的激活性突变(28)。mAb528抑制U87MG.DY2或DY5异种移植物生长的能力强调了与自磷酸化相对的活性激酶结构域作为效力决定因素的重要性。因此，是活性激酶决定了对抗体治疗的反应，而不是磷酸化酪氨酸与衔接蛋白或信号传导分子的直接相互作用。对这种结果的一个推论是mAb528似乎通过阻止下游靶标的磷酸根转移来抑制U87MG.A2-7/DY2/DY5异种移植物生长(图11)。由于所有这些U87MG源细胞系共表达wtEGFR,并且考虑到我们最近证明了de2-7EGFR可以形成二聚体和磷酸化wtEGFR(29)，wtEGFR很可能是这种二级靶标的候选者。这种主张得到了如下事实的支持表达de2-7EGFR的NR6细胞在不存在wtEGFR的条件下完全难以控制mAb528的抗肿瘤效应。这些研究综合起来表明，连同其配体阻断性质一起，mAb528部分是通过阻止过量表达的wtEGFR的同源二聚体化和wt与de2-7EGFR之间的异源二聚体化起作用。有趣的是，C225(与mAb528极其类似的抗体)与EGFR的复合体结构表明除了配体阻断外，这种抗体还可以通过部分抑制EGFR释放而阻止EGFR二聚体化(30)。mAb806。体内U87MG源细胞系对mAb806的反应性完全对映于用mAb528所观察到的，这表明上述原理中的一些是适用的，但存在一些重要的差异。此研究确定并延伸了我们之前证明mAb806反应性与EGFR激活有关的研究(16)。与mAb528和临床评定中所有当前的抗体不同，mAb806不靶向正常组织，如肝，因为EGFR激活在诸如肝等器官中极低或不可检测。很多因素可以刺激肺瘤内的EGFR激活(参见综述(31))。我们已经确定了这些可以引起mAb806的反应性因素中的至少三个EGFR过量表达(15)、自分泌环(Johns等人，在准备中)的突变(17)和存在。WtEGFR过量表达与mAb806抗肿瘤活性的关系与其独特的特异性密切相关，因为过量表达通过多种机制(如不依赖于配体的激活和EGFR糖基化的改变)增加被mAb806识别的瞬时的、游离形式的EGFR(21)。考虑到此处所述的工作与用EGFR特异性TKI所获得的临床数据一起表明EGFR抑制剂抵抗具有激活的EGFR的肿瘤最为有效，mAb806特异性识别激活形式的EGFR的独特能力使得其成为有利的治疗法。分子模型表明mAb806结合能组止活性wtEGFR二聚体的形成(4),我们已通过解答mAb806与其表位的复合体的晶体结构确定了该假说(Johns等人，准备中)。尽管这种mAb806在异种移植物模型中不显著抑制de2-7或wtEGFR的磷酸化，仍强烈地表明除阻断自磷酸化之外，还包括一些提出的mAb806作用机制。此外，已知的EGFR信号传导下游靶标(如Akt和MAPK)也不受mAb806抑制(T.G.Johns,未公开观察结果)。与此假说一致的是，mAb806显示出抗U87MG.DY2/DY5的强抗肿瘤活性，在这两个模型中自磷酸化不相关。mAb806缺乏抗U87MG.DK异种移植物的效力强调了活性激酶和磷酸根转移事件的存在(图11)是导致敏感性的关键因素。与mAb528相反，mAb806能够在不存在其他ErbB家族成员的条件下抑制表达de2-7EGFR的NR6细胞的生长。这个结果表明mAb806可能破坏wtEGFR之外的de2-7EGFR磷酸根转移的其他靶标。有趣的是，在NR6细胞中任一抗体与表面de2-7EGFR结合后，mAb806和528的内化和胞内运输没有明显不同，这表明抗体运输不引起此异种移植物模型中效力的不同。我们在此首次才艮道了de2-7EGFR上的Y845以Src依赖性方式被磷酸化。因此，我们检测了de2-7EGFR与Src之间的相互作用是否是mAb806活性的可能耙标。如果mAb806是通过抑制这种相互作用介导其部分抗肿瘤活性，则使用DNSrc从基因上破坏这种相互作用应能够降低mAb806的效力。与这种可能性相反的是，DNSrc的存在显著增强了mAb806的抗胖瘤活性。这表明Src在限制EGFR治疗的效力方面起作用，并且为使用Src与EGFR抑制剂的联合制剂提供了基本原理。结论这些研究展示了用于分析细胞系对EGFR治疗的敏感性的体内研究相关性。与先前的研究不同，我们能够在相同的遗传背景下进行我们大部分的分析，使得主要的变量为EGFR的性质。我们使用这种方法最终显示出了受体数目对效力的重要性。尽管EGFR数目与EGFR治疗易感性相关，但仅仅这种因素是不够的，因为受体还需要含有功能激酶。事实上，尽管有些直观，但此工作从形式上显示通过wtEGFR过量表达或組成性活性突变体表达"迫使"细胞系使用EGFR信号传导，可以将其由非反应性转化为反应性。因此EGFR必须不仅存在于细胞表面，它必须对细胞的生长和存活显著起作用。因此，选择对EGFR治疗法反应的患者的策略应针对鉴别高度依赖于EGFR的肿瘤，而不仅仅是受体蛋白的存在与否。此任务在一些情况下(如，当存在de2-7EGFR、EGFR基因扩增或激酶激活性突变体时)是相当容易的，但是很清楚的是在wtEGFR在遗传上正常的时候较困难。在这些情况下，多种受体激酶的相互影响使得难以鉴别真正依赖于EGFR信号传导的那些肿瘤。要鉴别对各受体激酶独特的靶基因的长期、详细表达特征可能是解决此问题的仅有的可行方法。参考文献1.ArteagaCL.Overviewofepidermalgrowthfactorreceptorbiologyanditsroleasatherapeutictargetinhumanneoplasia.SeminarsinOncology2002;29:3画9.2.BaselgaJ.WhytheepidermalgrowthfactorreceptorTherationaleforcancertherapy.Oncologist2002;4:2-8.3.MendelsohnJ.Targetingtheepidermalgrowthfactorreceptorforcancertherapy.JournalofClinicalOncology2002;20:1S-13S.4.FrederickL，WangXY,EleyG，JamesCD.Diversityandfrequencyofepidermalgrowthfactorreceptormutationsinhumanglioblastomas.CancerRes2000;60:1383-7.5.WongAJ，RuppertJM,BignerSH，等人.Structuralalterationsoftheepidermalgrowthfactorreceptorgeneinhumangliomas.ProcNatlAcadSciUSA1992;89:2965-9.6.SugawaN,EkstrandAJ，JamesCD,CollinsVP.Identicalsplicingofaberrantepidermalgrowthfactorreceptortranscriptsfromamplifiedrearrangedgenesinhumanglioblastomas.ProcNatlAcadSciUSA1990;87:8602-6.7.TangCK，GongXQ，MoscatelloDK，WongAJ,LippmanME.EpidermalgrowthfactorreceptorvIIIenhancestumorigenicityinhumanbreastcancer.CancerRes2000;60:3081-7.8.NishikawaR,JiXD,HarmonRC,等人.Amutantepidermalgrowthfactorreceptorcommoninhumangliomaconfersenhancedtumorigenicity.ProcNatlAcadSciUSA1994;91:7727-31.9.BaselgaJ，PfisterD，CooperMR,等人.PhaseIstudiesofanti-epidermalgrowthfactorreceptorchimericantibodyC225aloneandincombinationwithcisplatin.JClinOncol2000;18:904-14.10.StragliottoG，VegaF，StasieckiP，GroppP，PoissonM，DelattreJY.Multipleinfusionsofanti-epidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)monoclonalantibody(EMD55，900)inpatientswithrecurrentmalignantgliomas.EurJ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所述src抑制剂选自达沙替尼(BMS354825)、AZD國0530、SKI-606、PP1(4-氨基-5-(4國甲基苯基)-7國(叔丁基)吡唑并[3，4-d-嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3,4-(1-嘧啶)和PD166326。15、如权利要求13所述的方法，其中，所述抗EGFR抗体是识别在肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。16、如权利要求15所述的方法，其中，所述抗EGFR抗体为mAb806或其活性片段。17、药物组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的抗EGFR抗体和一种或多种src抑制剂。18、如权利要求17所述的组合物，所述抗EGFR抗体是识别在肺瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。19、如权利要求18所述的方法，其中，所述抗EGFR抗体为mAb806或其活性片段。20、如权利要求17所述的组合物，其中，所述src抑制剂选自达沙替尼(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PP1(4-氨基-5-(4-曱基苯基)-7画(叔丁基)吡唑并[3，4-d卜嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，44-嘧啶)和PD166326.21、如权利要求17所述的组合物，其中，所述src抑制剂为酪氨酸激酶抑制剂。全文摘要本发明涉及EGFR介导的疾病，尤其是癌症的治疗，其通过以联合或同时方式抑制或阻断EGFR和src来进行。本发明涉及癌症，尤其是EGFR介导的疾病的治疗、预防或调节，其用一种或多种EGFR调节剂和src抑制剂的联合进行。本发明还涉及用抗EGFR抗体和src抑制剂进行的癌症治疗。描述了用抗体抗EGFRmAb806与一种或多种src抑制剂以联合或连续方式进行癌症治疗的方法和组合物。文档编号C12P21/08GK101688229SQ200880016152公开日2010年3月31日申请日期2008年3月14日优先权日2007年3月15日发明者A·斯科特,F·福尔纳里,T·G·约翰斯,W·卡夫尼申请人:路德维格癌症研究所