来自Bacillusthuringiensis的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白的制作方法

专利名称：：来自Bacillusthuringiensis的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白的制作方法来自5ac/7/wsf力i/r/i3^7e/^/s的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白与相关申请的交叉引用本申请要求提交于2007年4月27日的美国临时专利申请No.60/914，364和提交于2008年4月24日的美国申请No.12/109,122的优先权。联邦资助研究或开发相关的声明不适用附件不适用序列表的包括序列表的纸件和本文提供的序列表的计算机可读形式，其中含有名为"38-21(54839)SEQLIST"的文件，该文件大小为126976字节(在MS-DOS中测量的)并通过引用并入本文。该序列表由SEQIDNOs:1-59构成。
背景技术：
：发明领域一般而言，本发明涉及昆虫抑制性的^C27/m^/i/r//^/e/l^、蛋白，更特别地，涉及抑制半翅目(hemipteran)昆虫的及MwW/^/e刀Ws晶体蛋白。本发明描述了提供来抑制半翅目昆虫的经分离的多核苷酸和蛋白、转基因植物和相关方法。本发明还提供了下述方法，用于将抑制半翅目昆虫的A^yr/z^/e/^h晶体蛋白与另外的昆虫控制试剂组合起来，以获得增加的半翅目昆虫抑制水平、半翅目昆虫抗性管理或扩大的有害昆虫控制谱。相关领域5ac/77wsf力w/ng/e刀s/s晶体蛋白革兰氏阳性土壤细菌"ac/7/MMwr/z^/e/2Ws公知能生产蛋白质性的伴胞晶体或5-内毒素，它们对多种鳞翅目(Lepidopteran)、鞘翅目(Coleopteran)和欢翅目(Dipteran)幼虫有毒。及^^wr/ag/e^s/s在芽孢形成期间产生对某些昆虫物种有特异性毒性的晶体蛋白。AMwW/^/e/7Ws的很多不同菌林已显示能生产杀昆虫晶体蛋白，包含产生具有杀昆虫活性的AMwW/^/ew/s菌林的组合物已被用作为环境可接受的杀昆虫剂，因为它们对特定的靶标昆虫有毒性，而对植物和其它非靶标生物没有毒性。长久以来，天然存在的A^w/z^/e力Ws分离物的商业制剂已用于对农业有害昆虫的生物控制。在商业生产中，从发酵过程获得的芽孢和晶体被浓缩，并被配制，以用于根据传统农业实践的叶片应用。晶体蛋白的命名Hofteetal.，(HofteandWhiteley，Microbiol.Rev.,53:242-255，1989)的综述描述了与已被鉴定的、对鳞翅目的昆虫(即，毛虫类昆虫)具有活性的杀昆虫性的及M盯/i^/eM/s菌林中的大多数相关的领域的一般状况。该论文还描述了具有针对双翅(即，蝇类和蚊类)和鞘翅目(即，甲虫类)的昆虫的杀昆虫活性的A^w2'"g/e7w/s菌才朱。已乂人及Mw/刀g/e/^2V的若干菌才朱克隆出了编码晶体蛋白的多种基因。Hofteetal.(1989)讨论了1990年之前在及^"r/邱iei^h中鉴定出的基因和蛋白，并且展现了传统应用于及MwW7^/e/^/s基因和蛋白的命名和分类体系。Cry1基因编码鳞翅目毒性的Cryl蛋白。Cry2基因编码对鳞翅目和双翅目都有毒性的Cry2蛋白。Cry3基因编码鞘翅目毒性的Cry3蛋白，而Cry4基因编码双翅目毒性的Cry4蛋白，等等。近来，已提出了一种新的命名法，其基于氨基酸序列同源性而非昆虫靶标特异性来对Cry蛋白加以系统分类。该分类体系和昆虫抑制性的及^w&^7e/7s/s基因的全面歹寸表在NeilCrickmore网页(于lifesci.Sussex,ac.uk/home/Neil—Crickmore/Bt/index.html通过互联网上的CambridgeUniversity进入)中的杀昆虫毒性蛋白(InsecticidalToxinProteins)歹'J表中有所概括。晶体蛋白毒性模式所有5-内毒素晶体都通过摄入对昆虫幼虫有毒性。晶体在昆虫中肠中的溶解使得5-内毒素的前毒素形式释放，在大多数情况下，其随后被中肠蛋白酶加工为活性毒素。被活化的毒素能通过受体蛋白识别昆虫中肠上皮的刷状缘(brush-border)并与之结合。已从某些昆虫幼虫分离出了若干可能的晶体蛋白受体(Jurat-FuentesJL,AdangMJ.Biochemistry.45(32):9688，2006;GriffittsJSetal.,Science.307(5711):922，2005;Jurat-FuentesJL，AdangMJ.EurJBiochem.;271(15):3127，2004)。活性蛋白的结合之后是毒素分子的插入(intercalation)和聚集，从而在中肠上皮中形成孔。该过程导致渗透失衡、溶胀(swelling)、中肠上皮中排列的细胞的裂解以及最终导致幼虫死亡。随着分子遗传学技术的出现，已分离出了若干种5-内毒素基因，并且确定了它们的DNA序列。这些基因已被用于枸建某些经遗传工程改造的及M"W/^/e/^/s产物(已被许可用于商业使用)。近来的已开发出了新的5-内毒素递送系统，包含含有并表达经遗传工程改造的5-内毒素基因的植物。已在表达5-内毒素基因的多种转基因作物植物(包括玉米、棉花、马铃薯、番茄和水稻)中良好地建立了对鳞翅目和鞘翅目害虫的控制。与5-内毒素基因在作物植物中表达相关的优点包括增加的产率和化学杀昆虫剂的使用减少。表达昆虫抑制性的5-内毒素基因的转基因的作物的优点已使得在作物(例如玉米和棉花)中广泛使用。不幸的是，目前可获得的5-内毒素基因不能提供对困扰作物生产的所有有害昆虫的控制。特别地，仍必须通过在半翅目昆虫导致损害的作物中使用杀昆虫剂来控制半翅目昆虫。半翅目或"刺吸式(piercing/sucking)"昆虫对植物尤其有害，因为已知它们还传插_损害性植物病毒，其导致植物对细菌和真菌感染更敏感。因此需要能在作物中抑制半翅目有害昆虫的其它材料和方法。还需要获得具有不同作用模式的若干不同类型的半翅目昆虫控制试剂，以作为半翅目昆虫抗性管理工具用于转基因植物中。既然需要半翅目昆虫控制试剂，已公开了多种手段。美国专利No.5,723,440描述了一种CytlBal蛋白，其声称有针对半翅目昆虫的活性。但是Wellman-Desbiens和Cote(J.Econ.Entomol.98(5):1469-1479.，2005)无法用半翅目昆虫力e^erw^验证该活性。美国专利No.5，885，963公开声称及^i/W/^ye/7W、i则e/e腦、Cyt毒素可用于抑制半翅目害虫。更近来，US20060242732公开了具有针对半翅目昆虫Ar《M/i/eo7aWs的活性的及^yr/z^/ei^/5"晶体蛋白。这些蛋白与美国专利Nos.5,723,440和5，885，963中描述的Cyt蛋白无关。
发明内容考虑到上述问题，开发了本发明。本发明首先涉及经分离的多核苷酸，其编码TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段，其中，昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70%序列同一性的多肽序列。本发明的多核苷酸序列还可编码与SEQIDNO:5中含有的相应昆虫抑制性多肽序列具有至少大约80%、90%、95%或100%的序列同一性的多肽序列。在某些实施方式中，多核苦酸编码SEQIDNO:5的多肽序列。本发明的经分离的多核苷酸编码抑制半翅目(Hemipteran)昆虫、17异翅目(Heteropteran)昆虫或同翅目(Homopteran)昆虫的TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段。半翅目昆虫可以是昆虫，同翅目昆虫可以是辨虫、跳虫(hopper)或粉虱。被编码的TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段在4r^/s膳食中至少大约5ppm、50ppm、250ppm或500ppm(百万分之部分数)的TIC807蛋白或蛋白片段的Z^7^膳食浓度下能抑制Z/^/y。多核苷酸编码的TIC807昆虫抑制性蛋白片段包含至少250个氨基酸残基的肽序列。可对编码TIC807的这种经分离的多核苷酸加以修饰，以较之天然编码序列而言改进在植物中的表达。设计来在植物中表达的编码TIC807的多核苷酸的一种实施方式被提供为SEQIDNO:6。用于IDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53。在其它一些实施方式中，设计来在植物中表达的多核苷酸编码具有N-末端叶绿体或质体靶向肽的TIC807蛋白。一种实施方式被提供于SEQIDNO:7中，其包含设计来在植物中表达TIC807毒素的多核苷酸，所述多核苷酸还与编码质体靶向肽的核香酸序列以符合读码框的形式相连。表达后，质体把向肽与TIC807可操作地相连，其功能为指导TIC807毒素插入植物质体。本发明的其它一些经分离的多核苷酸包括在高度严紧条件下与天然Ac/77wsM"W/^/e/w、TIC807基因(SEQIDNO:4)或与i史计来改进TIC807的植物表达的基因(其较之SEQIDNO:4示出的天然编码序列而言具有富集的G+C含量(SEQIDNO:6))杂交的多核苷酸。在严紧条件下杂交的多核苷酸可选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7构成的组。本发明还提供了转基因植物或源于其的植物部分，其中包含TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段，其中，TIC8O7昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70%序列同一性的多肽序列。转基因植物或18植物部分以下述浓度包舍TIC807蛋白或蛋白片段，所述浓度为每克鲜重植物组织至少大约5pg至大约25(VgTIC807蛋白或蛋白片段，或者介于这之间的任何的量。多核普酸编码的TIC807昆虫抑制性蛋白片段包含至少250个氨基酸残基的肽序列。转基因植物部分可以是细胞、叶、茎、花、萼片、果、根或种子。本发明还提供了包含下述多核苷酸的经转化的宿主细胞，所述多核苷酸编码TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段，其中，所述昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70%序列同一性的多肽序列。多核苷酸编码的TIC807昆虫抑制性蛋白片段包含至少250个氨基酸残基的肽序列。经转化的宿主细胞可以是细菌细胞或植物细胞。本发明的经转化的植物细胞可选自大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、草皮草、甘蔗、小麦、紫花苜蓿、香蕉、花椰菜、豆、巻心菜、油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘类、棉花、葫芦、桉树、亚麻、蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、杨树、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、番茄、装饰植物、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、稷、啤酒花(hops)和牧场草植物细胞构成的组。在某些实施方式中，经转化的植物细胞是棉花植物细胞。源于经转化的植物宿主细胞的植物、从源于经转化的宿主细胞的植物产生的种子以及来自该种子的后代植物也包括在本发明内。本发明的经转化的细菌宿主细胞可选自^gr由"er/咖、^3"7/ws、^c力er/c力/a、Sa7/zo/7e/7a、i^ei/t/o/ffo/2as和j力/zo6/"忠细菌细胞构成的组。在某些实施方式中，经转化的细菌细胞是》a"7/MMi/W/^/e/7^V细胞。本发明的另一实施方式涉及带有载体pIC17040的^c力er/c力7s菌林SIC8088的生物上纯的或经分离的培养物，其于2007年3月16日被保藏于AgriculturalResearchCultureCollection,NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRL)，Peoria，IllinoisU.S.A.,检录号为No.NRRLB-50030。本发明还提供了控制A^m的方法，所述方法包括下述步骤(a)19提供m抑制量的TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段，其中，昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70%序列同一性的多肽序列；以及(b)使A^7^与抑制量的多肽序列接触，由此控制A^m昆虫。用于该方法的多肽序列还可与SEQIDNO:5中含有的相应昆虫抑制性多肽序列具有至少大约90%或100%的序列同一性。多核苷酸编码的TIC807昆虫抑制性蛋白片段包含至少250个氨基酸残基的肽序列。在该方法的一种实施方式中，可在步骤(a)中于A^^膳食中提供i;7^^抑制量的多肽序列，可在步骤(b)中通过令Z/^AJ进食该膳食来接触Af^/s。在所述方法的一种更特别的实施方式中，Ar^/s膳食是转基因植物。当该方法的Z/^^膳食是转基因植物时，多肽序列的A^^抑制量为每克转基因植物鲜重组织至少大约5pg至大约250pg。在该方法的其它一些实施方式中，在步骤(a)中通过将包含多肽的组合物喷雾到植物上，提供了Zj^m抑制量的多肽序列。用于所述方法的该实施方式中的组合物包含表达所述多肽的细菌细胞或细菌芽孢。在所述方法的一些特别的实施方式中，细菌细胞或细菌芽孢是A3C_/77m细胞或Aacy77M芽孢。用于该方法中的组合物还包含含有多肽的伴胞晶体。在控制Ap^m的这些方法中的任何中，植物可以是被Z7gM侵害的。本发明还提供了经分离的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:4编码的天然^2c/"m^z/W/^/e/Ly/;TIC807蛋白中含有的或SEQIDNO:4的互补序列中含有的序列的至少12个连续核苷酸。此类经分离的寡核苷酸可用于检测SEQIDNO:4或编码与TIC807相关的昆虫抑制性蛋白的相关多核苷酸。本发明还提供了包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53中含有的或SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的互补序列中含有的序列的连续12个核苷酸的经分离的寡核苷酸。这些经分离的寡核苷酸可用子检测SEQIDNO:6或设计来用于在植物中编码TIC807蛋白的多核苷酸或编码TIC807蛋白的相关多核苷酸。本发明还提供了试剂盒，用于检测样品中的多核苷酸序列，所述试剂盒包含与SEQIDNO:6的多核苷酸序列或其互补序列特异性杂交的寡核苷酸和与所迷寡核苷酸杂交的对照多核苷酸。本发明的其它一些实施方式包括组合物，所述组合物包含至少两条至少12个核苷酸的简并寡核苷酸引物，其中，简并寡核苷酸引物的核苷酸序列源于SEQIDNO:5的多肽序列。这些寡核苷酸引物组合物可用于在植物或细菌样品中检测编码TIC807蛋白的多核苷酸序列。本发明还提供了在样品中检测或分离编码TIC807蛋白或TIC807相关蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括下述步骤(a)选择能产生扩增子的筒并寡核苷酸引物对，其中，筒并寡核苷酸引物对的核普酸序列源于SEQIDNO:5的TIC807多肽序列；(b)从样品中的多核苷酸序列产生扩增子；以及(c)检测或分离扩增子，由此检测或分离样品中编码TIC807蛋白或TIC8O7相关蛋白的多核苷酸。在该方法中，检测或分离的扩增子可编码与TIC807(SEQIDNO:5)具有至少45%、70%或90%的序列同一性的多肽。本发明中还提供了在样品中检测或分离编码TIC807蛋白的多核苷酸的其它一些方法，所述方法包括下述步骤(a)选择简并寡核苷酸或简并寡核苷酸集，其中，筒并寡核苷酸引物的核苷酸序列源于SEQIDNO:5的ITC807多肽序列；(b)将简并寡核苷酸或简并寡核苷酸集与样品杂交；(c)检测样品中与多核苷酸的杂交，由此检测样品中编码TIC807的多核苷酸，以及(d)分离在步骤(c)中通过杂交检测到的多核苷酸。在该方法中，检测的多核苷酸可编码与TIC807(SEQIDNO:5)具有至少45%、70%或90%的序列同一性的多肽。本发明还提供了在植物中表达TIC807蛋白的方法，所述方法包括下述步骤(a)向植物细胞基因组中插入以5，至3，的方向包含下述重组双链DNA分子的核酸序列，其中，所述重组双链DNA分子包含i.在植物细胞中发挥功能的启动子；ii.编码包含TIC807昆虫抑制性蛋自或源于其的昆虫抑制性蛋白片段的多肽的多核苷酸序列，其中所述昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70°/序列同一性的多肽序列；以及iii.3，非翻译.核.举酸序列，其在植物细胞中发挥功能以产生聚腺苦化，其中，所述启动子、所述多核苷酸序列和所述3，非翻译核苷酸序列可操作相连；(b)获得含有步骤(a)的核酸序列的经转化的植物细胞，以及(c)从经转化的植物细胞再生表达TIC807蛋白的经转化的植物。在该方法中，步骤(a)的多核苷酸序列可编码与SEQIDNO:5具有至少90%序列同一性的TIC807蛋白或可编码SEQIDNO:5的TIC807蛋白。该多核苷酸序列可以是SEQIDNO:6或设计来在植物中表达的编码TIC807蛋白的另外的序列。设计来在植物中表达的多核苷酸序列包括^f旦不限于SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53。多核苷酸编码的TIC807昆虫抑制性蛋白片段包含至少250个氨基酸残基的肽序列。在该方法的其它一些实施方式中，步骤(a)的编码TIC807蛋白的多核苷酸序列与编码质体靶向多肽的多核苷酸序列可操作地相连。SEQIDNO:8的多肽包含与质体靶向多肽(可用于本方法的某些实施方式)可操作相连的TIC807蛋白。本发明还提供了重组DNA载体，其以5，至3，的方向包含i.在植物细胞中发挥功能的启动子；ii.编码包含TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段的多肽的多核苷酸序列，其中所述昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70%序列同一性的多肽序列；以及iii.3，非翻译核苷酸序列，其在植物细胞中发挥功能以产生聚腺苷化，其中，所述启动子、所述多核苷酸序列和所述3，非翻译核苷酸序列可操作相连。在这些载体中，多核苷酸序列还可编码与SEQIDNO:5具有至少90%序列同一性的TIC807蛋白或者可编码SEQIDNO:5的TIC807蛋白。多核苷酸编码的TIC807昆虫抑制性蛋白片段包含至少250个氨基酸残基的肽序列。编码TIC807蛋白的多核苷酸序列可以是设计来在植物中表达的序列。设计来在植物中表达的多核苷酸序列包括但不限于SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:WseqIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53。在其它一些实施方式中，编码TIC807蛋白的多核苷酸序列与编码质体靶向多肽的多核苷酸序列可操作地相连。本发明的载体可包含编码SEQIDNO:8的多肽的多核苷酸序列，例如，所述多核苷酸序列是SEQIDNO:7。本发明的载体还可包含编码可选择标志物基因的多核苷酸。赋予对AMPA、莠去津、溴苯腈、茅草枯、麦草畏、草甘膦、潮霉素、曱氨蝶呤、新霉素、草铵膦、磺酰脲或2，4-D或其组合的抗性的可选择标志物基因可用于本发明的载体。本发明还提供了从植物或种子生产的商品，其中，所述商品含有可检测到的量的TIC807蛋白或编码TIC807蛋白的多核苷酸。该商品可源于棉花植物或棉花植物种子，或者类似地，源于玉米、水稻、小麦、大豆、鹰嘴豆、木豆、甘蔗、甜菜等。例如，当所述商品源于棉花植物或棉花植物种子时，商品可以是棉绒、油、粗粉或外壳(hulls)。本发明还提供了控制至少一种有害昆虫的方法，所述方法包括下述步骤(a)在组合物中提供至少两种不同的有害昆虫抑制性试剂，所述组合物包含(i)昆虫抑制量的TIC807蛋白和昆虫抑制量的(ii)有害昆虫摄入后发挥功能以抑制有害昆虫内的生物学功能的至少一种核糖核苷酸序列和/或(iii)昆虫抑制量的并非TIC807蛋白的至少一种昆虫抑制性蛋白；和(b)令有害昆虫或害虫与抑制量的组合物接触。在该方法中，被控制的有害昆虫可以是半翅目昆虫、异翅目昆虫或同翅目昆虫。被该方法控制的一种半翅目昆虫是Af^/s昆虫。被该方法控制的同翅目昆虫可以是蚜虫、跳虫或粉虱。在该方法中，TIC807昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70%序列同一性的多肽序列。用于该方法的TIC807蛋白还可包含长度为至少250个氨基酸残基的TIC807昆虫抑制性蛋白片段。当生物学功能被核糖核苷酸抑制时，ii)中有害昆虫内的生物学23功能可以是必要生物学功能。被该方法抑制的必要生物学功能可以是有害昆虫的必要蛋白或核糖核酸提供的，其预测功能选自肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素调控，离子调控和运输，消化酶的合成，细胞膜势能保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素传感，触角形成，翅膀形成，腿形成、发育和分化，卵形成，幼虫成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神经传递，细胞分裂，能量代谢，呼吸和凋亡构成的组。Ar^/s中，必要生物学功能可被下述核糖核苷酸序列抑制，所述核糖核苷酸序列包含展示出与选自SEQIDNO:24至SEQIDNO:39构成的组的核苷酸编码序列大约80至大约100%序列同一性的大约21至大约5000个连续的核苷酸。在该方法的其它一些实施方式中，并非TIC807蛋白的一种昆虫抑制性蛋白可源于&"77mMw//^ie/^/s。并非TIC807蛋白的该昆虫抑制性蛋白可选自AXMI-027、AXMI-036、AXMI-038、AXMI-018、AXMI-020、AXMI-021、AXMI-010、AXMI-003、AXMI-008、AXMI-006、AXMI-007、AXMI-009、AXMI-014、ET29、ET37、AXMI-004、AXMI-028、AXMI-029、AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127和TIC128构成的组。在其它一些实施方式中，在植物中表达并非TIC807蛋白的两种A^ws抑制性蛋白，所述两种ij^"s抑制性蛋白可包含TIC809和TIC810。在该方法的其它一些实施方式中，第一和第二有害昆虫可被组合物控制。在所述方法的这些实施方式中，笫二有害昆虫可被组合物的核糖核苷酸序列或被组合物中并非TIC807的蛋白抑制。该笫二有害昆虫可以是鳞翅目有害昆虫。第二有害昆虫可被选自CrylA蛋白、CrylB蛋白、CrylC、CrylA/CrylF嵌合蛋白和Cry2Ab蛋白构成的组的蛋白抑制。在控制至少一种有害昆虫的方法的某些实施方式中，组合物提供了协同性的昆虫抑制效果。在控制至少一种有害昆虫的方法的其它一些实施方式中，组合物提供了加合性的昆虫抑制效果。在控制至少一种有害昆虫的方法中，组合物可以是转基因植物。本发明还提供了保护植物抵挡A^^侵害的方法，所述方法包括在植物中表达力7^/s抑制量的至少两种不同的A^m抑制性试剂，其中，所述A^"s抑制性试剂包含(i)Lygus抑制量的TIC807蛋白；(ii)Lygus抑制量的、并非TIC807蛋白的至少一种Lygus抑制性蛋白和/或(iii)Lygus抑制量的至少一种核糖核普酸序列，其被Lygus摄入后发挥功能以抑制Lygus内的生物学功能。A^z^中的该必要生物学功能可由Z/^^的必要蛋白或核糖核酸提供，其预测功能选自肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素调控，离子调控和运输，消化酶的合成，细胞膜势能保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素传感，触角形成，翅膀形成，腿形成、发育和分化，卵形成，幼虫成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神经传递，细胞分裂，能量代i射，呼吸和凋亡构成的组。Z/《z^中的该必要生物学功能可被下述核糖核苷酸序列抑制，所述核糖核苷酸序列包含展示出与选自SEQIDNO:24至SEQIDNO:39构成的组的核苷酸编码序列大约80至大约100%序列同一性的大约21至大约5000个连续的核苷酸。在该方法的某些实施方式中，并非TIC807蛋白的抑制性蛋白可源于》a"7/m^wrii^j'e/^is。并非TIC807蛋白的A^m抑制性蛋白可选自AXMI-027、AXMI-036、AXMI-038、AXMI-018、AXMI-020、AXMI-021、AXMI-010、AXMI-003、AXMI-008、AXMI-006、AXMI-007、AXMI-009、AXMI—014、ET29、ET37、AXMI-004、AXMI—028、AXMI-029、AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127和TIC128构成的组。在其它一些实施方式中，在植物中表达并非TIC807蛋白的两种Zj^/s抑制性蛋白，所述两种Af^a抑制性蛋白可包含TIC809和TIC810。在该方法中，TIC807昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70%序列同一性的多肽序列。用于本方法的TIC807蛋白还可包含长度为至少250个氨基酸残基的TIC807昆虫抑制性蛋白片段。在该方法的某些实施方式中，A^m抑制性试剂的表达提供了协同性的A^m抑制效果。在该方法的其它一些实施方式中，Ar^/s抑制性试剂的表达提供了加合性的At^aj抑制效果。通过使用"i亥方、法，可^f呆护;f直if勿^氐挡Af^us力esj5ei"i/5"或Z7gys7//7eo7ar/s。本发明还提供了经分离的蛋白，其中所述经分离的蛋白包含SEQIDNO:5中含有的、长度为至少9个氨基酸的多肽序列。所述经分离的蛋白可具有长度为至少12、16、32或250个氨基酸的多肽序列。长度为至少32个氨基酸的经分离的蛋白可具有与SEQIDNO:5内含有的相应多肽序列具有至少大约80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。长度为至少250个氨基酸时，本发明的经分离的蛋白可以是昆虫抑制性蛋白。至少250个氨基酸的经分离的昆虫抑制性蛋白可抑制Zj^z/a在某些实施方式中，至少250个氨基酸的经分离的昆虫抑制性蛋白以至少大约5ppm、50ppm、250ppm或500ppm蛋白的Z，s膳食浓度抑制A^m。经分离的蛋白还可以是SEQIDNO:5的蛋白。经分离的蛋白还可包含载剂蛋白。该载剂蛋白可以是清蛋白或KLH蛋白。本发明的经分离的蛋白还可包含选自指示剂、氨基酸间隔、氨基酸接头、信号序列、叶绿体转运肽序列、液泡靶向序列、停止转移序列、跨膜结构域、蛋白纯化配体或其组合构成的组的共价修饰。本发明还提供了与TIC807蛋白或源于其的肽表位特异性结合的抗体，其中，TIC807蛋白或表位包含SEQIDNO:5的至少9个连续氨基酸。本发明还提供了用于在样品中检测TIC807蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含a)与TIC807蛋白或源于其的肽表位特异性结合的抗体，所述蛋白或表位包含SEQIDNO:5的至少9个连续氨基酸；和b)包含SEQIDNO:5的至少9个连续氨基酸的对照TIC807蛋白或肽表位。下面参考附图，详细描述本发明的其它特征和优点以及本发明的多种实施方式的结构和操作。附图简述本发明的附图被包括进申请文件并作为其一部分，阐释了本发明的实施方式，并和说明书一起解释了本发明的原则。在附图中图1阐释了TIC807(SEQIDNO:5)和Cryl5Aa(SEQIDNO:264丄)之间的Needleman—Wunsch全局t匕对。图2阐释了J^n^sc"r/咖介导的植物转化载体pMONl05863，其含有靶向质体的TIC807植物表达盒和新霉素选择盒(位于"r由"er/u迈边界序歹U之内)。图3阐释了J^ro6ac&W咖介导的植物转化载体pMON105864，其含有靶向质体的TIC807植物表达盒和新霉素选择盒(位于々i"c^"eW咖边界序歹'J之内)。优选实施方式详述I.定义在本文中使用时，提到昆虫抑制时，短语"加合性效果"指通过组合至少两种不同的昆虫抑制性试剂获得的下述抑制效果，其a)定量上等于两种试剂的组合的预期加合效果，和/或b)定性上等于每种试剂自身施用获得的效果的组合。定量效果的例子包括但不限于指示两种昆虫抑制性试剂针对已知昆虫革巴标的增加的昆虫抑制活性的LC5。、EC5。、IC5。、百分比死亡率或百分比发育迟緩值的改变。加合性定性效果的例子包括但不限于反映出每种昆虫抑制性试剂展示的谱(即，一种试剂提供的半翅目昆虫抑制和另一试剂提供的鳞翅目昆虫抑制的组合)的简单组合的扩展的昆虫抑制镨(即，半翅目和鳞翅目昆虫)。短语"共有序列"在本文中使用时表示这样氨基酸、DM或RM序列它们是通过比对两条或多条同源序列以及得到代表共同的氨基酸、DNA或RNA序列的新的序列而制造出的。术语"构建体"在本文中使用时表示源于任何来源的、能基因组整合或自主复制的任何重组多核苷酸分子，例如，质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RM多核苷酸分子，其中包含这样的多核苷酸分子，其中，一个或多个多核苷酸分子已以功能可操作的方式相连(即，可操作地相连)。短语"生物功能等同物"在本文中使用时表示这样的肽、多肽和蛋白，它们含有与本发明的TIC807蛋白相似的序列或结构特征，并且展示出与本发明的TIC807蛋白相同或相似的昆虫抑制活性。生物功能fR物还包括这样的肽、多肽和蛋白，它们能与针对TIC807蛋白产生的单克隆/或多克隆抗体反应(即，特异性结合)，并且展示出与TIC807蛋白相同或相似的昆虫抑制活性。短语"DNA构建体"在本文中使用时表示任何下述DNA分子，其中，已共价相连了两条或多条一般不同的DNA序列。DNA构建体的例子包括但不限于源于任何来源的、能基因组整合或自主复制的质粒、粘粒、病毒、BACs(细菌人工染色体)、YACs(酵母人工染色体)、植物微型染色体、自主复制序列、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA序列。可通过多种方法来装配DNA构建体，所述方法包括但不限于重组DM技术、DNA合成技术、PCR(聚合酶链式反应)技术或者技术的任何组合。有关DNA构建体的上下文中，短语"异源启动子，，在本文中使用时指i)源于与可操作相连的结构基因不同的来源的启动子，或ii)源于与可操作相连的结构基因相同的来源的启动子，但是启动子的序列较之其最初形式有所修饰。短语"高度严紧杂交条件"指这样的核酸杂交条件，所述条件包含大约1XSSC的盐浓度、大约0.1%SDS的去垢剂浓度和大约50。C的温度或者其等同条件。术语"同源体，，在本文中使用时表示通过DM序列或被编码的蛋白序列的同一性而与第二基因相关的基因。是同源体的基因可以是通过物种形成事件分开的基因(见"直向同源体")。是同源体的基因还可以是通过遗传复制事件分开的基因(见"平行同源体")。同源体可来自相同或不同的生物，其可在相同或不同的生物中执行相同的生物学功能。术语"昆虫"在本文中使用时表示Arachnid、鞘翅目、Ctenophalides、双翅目、半翅目、同翅目、异翅目、膜翅目或鳞翅目昆虫的任何胚胎、幼虫、蛹或成年形式。术语"昆虫抑制量"表示导致对昆虫生长、昆虫发育、昆虫生殖、昆虫进食行为、昆虫交配行为的任何可测量到的抑制和/或昆虫在植物上进食导致的负面影响的任何可测量到的减少的TIC807多肽、核糖核苷酸或并非TIC807蛋白的蛋白的量。类似地，"A^7^抑制量"指导致对Af5""s生长、Ar^/s发育、Ar^/s生殖、Ar^/s进食行为、Z/^ta交配行为的任何可测量到的抑制和/或Arg^在植物上进食导致的负面影响的任何可测量到的减少的TIC807多肽、核糖核苷酸或并非TIC807蛋白的蛋白的量。在本文中使用时，提到"经分离的DNA分子"时，这表示，DNA分子是单独或与其它组合物组合存在的，但并非在其天然环境中。例如，只要在植物基因组的DNA中天然发现的编码序列、内含子序列、非翻译引导序列、启动子序列、转录终止序列等处于其天然状态下被观察到的植物基因组中，它们就不被认为是与植物基因组分离的。但是，只要结构和组分并不在植物基因组中，在本公开文本中，这些组分中的每种或者这些组分的亚部分就是"经分离的，，。类似地，只要核苷酸序列不在结构最初纟皮观察到的^c277m^wri/^2'e/w、细菌的MA中，编码Ac/77ws^iyr/i^/e/^2'51杀昆虫蛋白或者该蛋白的任何杀昆虫变体的核苷酸序列就将是经分离的核苷酸序列。就本公开文本的目的而言，编码与天然及""/\'/7^'<5/^/<核苷酸序列所编码的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的人工核苷酸序列将被认为是经分离的。就本公开文本的目的而言，任何转^^因核苷酸序列，即，插入植物细胞基因组中的DM的核苷酸序列将被认为是经分离的核苷酸，无论其是否存在于用于转化转基因事件发生的植物细胞的质粒中，还是在转基因事件的基因组中，以可被检测到的量存在于源于转基因事件的组织、后代、生物样品或商品中。如果DNA分子可从细胞或组织或勻浆(来自植物或种子或植物器官)提取，或者可从提取自细胞或組织或匀浆(来自植物或种子或植物器官)的DNA或RNA作为扩增子产生，那么核苷酸序列或源于其的任何片段将因此被认为是经分离的或可分离的，其中任何植物或种子或植物器官都源于从转基因事件29获得的一类材料。短语"有害昆虫摄入后发挥功能以抑制生物学功能的核糖核苷酸序列"指这样的RNA序列，其包含与昆虫基因组内的核苷酸序列编码的RNA分子基本同源的序列，其提供对昆虫的抑制。在本文中使用时，提到核酸或多肽序列时，术语"基本同源，，或"基本同源性"指这样的核酸或多肽序列，其与另一核苷酸或多肽序列具有大约65%至大约70%的序列同一性，或者更优选大约80%至大约85°/。的序列同一性或最优选大约90%至大约95%的序列同一性，至大约99°/。或100%的序列同一性。在本文中使用时，在提到昆虫抑制时，短语"协同性效果，，指通定量上大于两种试剂的组合的预期加合效果，和/或b)定性上不同于各试剂单独施用获得的任何效果。定量效果的例子包括但不限于指示两种昆虫抑制性试剂针对已知昆虫靶标的增加的昆虫抑制活性的LC5。、EC5Q、IC5Q、百分比死亡率或百分比发育迟緩值的改变。协同性定性效果的例子包括但不限于不反映每种昆虫抑制性试剂单独展示的镨(即，一种试剂提供的半翅目昆虫抑制和另一试剂提供的鳞翅目昆虫抑制的组合)的简单組合的扩展的昆虫抑制语(即，半翅目、同翅目和鳞翅目昆虫抑制)。在本文中使用时，短语"TIC807蛋白"表示展示出与SEQIDNO:5含有的相应多肽序列有至少70%的序列同一性的至少250个氨基酸的昆虫抑制性蛋白。在本文中使用时，短语"TIC807相关蛋白"表示展示出与SEQIDN0:5含有的相应多肽序列有至少45%的序列同一性的至少250个氨基酸的昆虫抑制性蛋白。在本文中使用时，短语"可操作相连"表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在启动子的上下文中，"可操作相连"表示，启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时，"可操作相连，，表示启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物将高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5，非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以可操作相连的核酸序列包括但不限于提供基因表达功能的序列(即，基因表达元件，例如启动子、5，非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3，非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)，提供DNA转移和/或整合功能的序列(即，T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)，提供选择性功能的序列(即，抗生素抗性标志物、生物合成基因)，提供可计分标志物功能的序列(即，报道子基因)，体外或体内协助序列操作的序列(即，多接头序列，位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即，细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。在本文中使用时，短语或术语"序列同一性，，、"序列相似性，，或"同源性"用于描述两条或多条核苷酸序列之间的关系。两条序列之间的"序列同一性"百分比是通过在比较窗上对两条被最优对齐的序列加以比较来测定的，其中，为了对两条序列进行最优对齐，比较窗中序列的部分较之参照序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即，缺口)。通过这样来计算百分比测定两条序列中出现的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗中总位置数再用结果乘以100,产生序列同一性百分比。较之参照序列而言在每个位置都相同的序列被认为与参照序列相同，反之亦然。如果第一核苷酸序列展示出与第二序列或参照序列的完全互补性，那么第一核苷酸序列(当以5，至3，观察时)就被认为是第二或参照核苷酸序列(当以3，至5，观察时)的"互补序列"或与之互补。在本文中使用时，当序列之一以5，至3，读出的每个核苷酸与另一序列以3，至5，读出的每个核苷酸互补时，核酸序列分子就被认为展示出"完全互补性"。与参照核苷酸序列互补的核苷酸序列将展示出与参照序列的反向互补序列相同的序列。在本文中使用时，短语"SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列"指SEQIDNO:5中与另一多肽序列比对时产生最高百分比同一性的多肽序列。在本文中使用时,"比较窗"表示至少6个连续位置(通常大约50至大约100，更通常大约IOO至大约150个)的概念片断，其中，在两条序列被最优对齐后，将序列与同样连续位置数的参照序列相比较。为了对两条序列最优对齐，比较窗较之参照序列(不包含添加或缺失)可包含大约20%或更少的添加或缺失(即，缺口)。关于序列分析的详纟田讨论，本领域技术人员应参照用于WisconsinGenetics软件包7.0版，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,Wis.，USA中的序列比对的详细方法或参照Ausubeletal.(1998)。在本文中使用时，术语"再生"指从植物种子、植物细胞、植物细胞组、植物愈伤组织或植物切片中的任何一种获得整抹植物的任何方法。在本文中使用时，术语"转化"表示将外源DNA序列(例如载体、重组DM分子)引入细胞或原生质体的工艺，其中，外源DNA被引入染色体或能自主复制。短语"转基因植物"表示源于经转化的植物细胞或原生质体的植物或其后代，其中，植物DNA含有引入的外源DNA分子(在同一物种的天然、非转基因植物上本来并不存在)。短语"稳定的RNA"、"稳定的dsRNA"和"稳定的siRNA"指正义向和反义向的、被短序列(允许RNA分子中形成发卡或茎环结构)分开的经转录的RNA的组合。在本文中使用时，短语"维管组织"指植物维管束中含有的任何纽织或细胞，其包括但不限于韧皮部、原生韧皮部、次生韧皮部、木质部、原生木质部或次生木质部细胞或组织。在本文中使用时，术语"载体"指可用于转化(即，向宿主细胞中引入异源DNA)目的的任何重组多核苷酸构建体。II.本发明的多核苷酸本发明包括编码TIC807昆虫抑制性蛋白的多种多核苷酸。当与合适的启动子、转录终止和/或聚腺苷化序列可操作地相连时，此类多核苷酸可用于在宿主细胞中生产TIC807昆虫抑制性蛋白。此类多核苷酸还可用作为探针，以分离编码TIC807蛋白的同源或基本同源的多核苷酸。编码TIC807的多核苷酸的一种来源是"acW/i^MwW/^/e/2s/s菌林，其含有SEQIDNO:4的TIC807多核苷酸，这编码SEQIDNO:5的TIC807多肽。该多核苷酸序列最初分离自Mwi/^/e/^"宿主，因此适于在其它细菌宿主中表达编码的TIC807多肽。例如，可用SEQIDNO:4来在细菌宿主(包括但不限于爿^To6acfer/w/w、Asci7/ws、^sc力er/c力/a、5^/fflo/ze/7a、jPsei/^/o迈OQ351和y力/zoW咖细菌宿主细胞)中表达TIC80蛋白。SEQIDNO:4探针也可用作为探针，以分离编码TIC807蛋白的同源或基本同源的多核苷酸。此类探针可用于鉴定源于^c/"^菌林的同源或基本同源的多核苷酸。还可从TIC807多肽序列从头合成编码TIC807蛋白的多核苷酸。可通过使用遗传密码从TIC807多肽序列推导出多核苷酸基因的序列。可使用计算机程序，例如"BackTranslate，，(GCGPackage,Acclerys，Inc.SanDiego，CA),将肽序列转化为编码肽的相应核苷酸序列，可用于获得相应核苷酸编码序列的TIC807多肽序列的例子包括但不限于SEQIDNO:5的TIC807多肽序列。此外，可设计本发明的合成TIC807多核苷酸序列，使得它们将在植物中表达。美国专利No.5,500，365描述了一种方法，用于合成植物基因，以改善合成的基因编码的蛋白的表达水平。该方法涉及对外来转基因的结构基因序列的修饰，以使得它们能更高效地被植物转录、加工、翻译和表达。在植物中良好表达的基因的特征包括可能导致不想要的内含子剪接或聚腺苷化(基因转录物编码区域中)的序列的消失，但同时基本保留杀昆虫蛋白的毒性部分的氨基酸序列。美国专利No.5,689,052中公开了一种类似的方法用于获得转基因在单子叶植物中的增加的表达。设计来在植物中表达TIC807蛋白的示例性多核苷酸序列包括4旦不限于SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53。III.用于分离和/或检测编码TIC807蛋白的多核苷酸的经分离的寡核苷酸、试剂盒和方法
技术领域：
：本发明还提供了用于鉴定、检测或分离编码TIC807蛋白的多核苷酸的经分离的寡核苷酸。在一种实施方式中，经分离的寡核苷酸包含在SEQIDNO:4的MwW/^ye/LsisTIC807编码基因中含有的或SEQIDNO:4的互补序列中含有的序列的至少12个连续核苷酸。此类寡核苷酸可用于基于杂交或PCR的方法，以从"ac/W"i^力wiv'力《/e/^/s的菌林鉴定或分离编码TIC807蛋白的多核苷酸。此类寡核苷酸还可用于验证编码TIC807的多核苷酸在宿主细胞中的存在与否。还应认识到，当其包含与SEQIDNO:4错配的其他序列时，寡核苷酸还可用于诱变SEQIDNO:4。此类"诱变"寡核苷酸可用于鉴定具有增强的昆虫抑制活性的TIC807变体。在另一实施方式中，经分离的寡核苷酸包含在SEQIDNO:6的多核普酸中含有的或SEQIDNO:6的互补序列中含有的序列的至少12个连续核苷酸。SEQIDNO:6的多核苷酸是特别设计来在转基因植物中表达的，且编码SEQIDNO:5的TIC80蛋白。在还一些实施方式中，经分离的寡核苷酸包含SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQID34NO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的多核苷酸中含有的或SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的互补序列中含有的序列的至少12个连续核苷酸。此类寡核苷酸可用于基于杂交或PCR的方法，以在源于转基因植物的样品中检测SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53多核苷酸。当样品是核糖核酸样品时，寡核苷酸可用于基于杂交或PCR的方法，以对TIC807转基因表达加以定量。当样品是脱氧核糖核酸样品时，寡核苷酸可用于基于杂交或PCR的方法，以测定样品中TIC807转基因的存在与否。预计，源于SEQIDNO:6的寡核苷酸可用于测定TIC807转基因在源于商品的脱氧核糖核酸样品中存在与否。鉴于利用寡核苷酸的某些核酸检验方法的敏感性极高，预计可使用源于SEQIDNO:6的寡核苷酸来检验源于下述库来源的商品中的TIC807转基因，所述库来源中，仅商品的一部分源于含有SEQIDNO:6的转基因植物。还应认识到，当其包含与SEQIDNO:6错配的其他序列时，寡核苷酸可用于诱变SEQIDNO:6。此类"诱变"寡核香酸可用于鉴定具有增强的昆虫抑制活性和/或增强的在转基因植物宿主细胞中的表达的TIC807变体。当然应当理解，本发明的寡核苷酸还可包含与编码TIC807蛋白的多核苷酸序列不相同或互补的其它序列。其它序列可包括但不限于用作为协助克隆、诱变或检测的适配子(adapter)的序列。本发明的寡核苷酸还可包含其它共价修饰。共价修饰将包括但不限于可检测的标记，例如同位素、荧光团和半抗原。生物素是一种特别有用的半抗原。本发明还包括用于检测样品中TIC807多核苷酸序列的试剂盒，其中包含与SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:35M、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的多核苷酸序列或其互补序列特异性杂交的至少一种寡核苷酸。在本发明的试剂盒的上下文中，术语"特异性杂交"表示寡核苷酸将能杂交和检测来自经SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的一个或多个拷贝转化的转基因植物的样品中的SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53，但不特异性杂交和检测不含SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的对照非转基因植物中的任何序列。这些试剂盒还可包含与所述寡核苷酸杂交的对照多核苷酸、使用指导和/或用于将寡核苷酸与SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53杂交或检测杂交的试剂。在某些应用(包括但不限于使用聚合酶链式反应的那些应用)中，试剂盒将天然包含多于一种的、与SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸。IV.简并寡核苷酸、简并寡核苷酸组合物和使用方法本发明还包括简并寡核苷酸、包含筒并寡核苷酸的引物和使用此类寡核苷酸以鉴定、检测或分离编码TIC807蛋白的多核苷酸的方法。虽然此类简并寡核苷酸源于SEQIDNO:5,但本领域技术人员知道，此类寡核苷酸可用于鉴定多种TIC807蛋白以及TIC807相关蛋白。此类TIC807蛋白预计与SEQIDNO:5具有至少70%、80%、90%、95%、98°/。或100%的氨基酸同一性,并且具有昆虫抑制活性。TIC807相关蛋36白与SfiQIDNO:5具有至少45%的序列同一性，并且具有昆虫抑制活性。从肽序列设计简并寡核苷酸引物是通过使用遗传密码来完成的，其中，合成对应于每种被编码的氨基酸的密码子。简并寡核苷酸可包含寡核苷酸的下述库，所述库含编码给定肽序列的所有可能的序列。备选地，简并寡核苷酸还可包含含有中性碱基(即，在给定位置足以与所有核苷酸进行碱基配对的碱基)的序列。中性碱基包括但不限于^ti。在简并寡核苷酸引物或探针的设计和使用中的相关考虑是本领域技术人员公知的(见MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition)，SambrookandRussel1，ColdSpringHarborPress2001)。本发明公开了并要求保护下述组合物，所述组合物包含至少两条来自SEQIDNO:5的多核苷酸序列的至少12个核苷酸的简并寡核苷酸引物。此类组合物可用于基于杂交或聚合酶链式反应的方法，用于分离或检测编码TIC807蛋白或TIC807相关蛋白的多核苷酸。该组合物的简并寡核苷酸还可包含与编码TIC807蛋白的多核苷酸序列不相同或互补的其它序列。其它序列可包括但不限于用作为协助克隆、诱变或检测的适配子的序列。本发明的筒并寡核苷酸还可包含其它共价修饰。共价修饰将包括但不限于可检测的标记，例如同位素、荧光团和半抗原。生物素是一种特别有用的半抗原。本发明特别包括简并寡核苷酸引物在分离或检测样品中编码TIC807蛋白或TIC807相关蛋白的多核苷酸的基于PCR的方法中的用途。简言之，选择能产生扩增子的简并寡核苷酸引物对，将其与含有编码TIC807蛋白或TIC807相关蛋白的多核苷酸的样品一起用于聚合酶链式反应。用于该方法的样品的合适来源包括但不限于多种^3C2'/7w51MyWi^/e/Ly/s菌林。当寡核苷酸对应于预测的正义和反义链序列，并且处于5，至3，的方向(将引导DNA聚合酶介导的对与另一相反寡核苷酸互补的DM链的合成)，简并寡核苷酸能产生扩增子。筒并寡核苷酸引物源于SEQIDNO:5的TIC807多肽序列。可通过使用插入型染料，产生扩增子，来检测该扩增子。还可通过将经分离的扩增子片段克隆进质粒、粘粒、噬菌体或其它克隆载体来分离扩增子。一旦被克隆，还可通过测序，以测定扩增子编码的蛋白与TIC807(SEQIDNO:5)的百分比同一性，来对该扩增子进行进一步分析。预计，可通过这些方法检测或分离编码与SEQIDNO:5至少70%或者至少90%相同的TIC807蛋白或与SEQIDNO:5至少45%相同的TIC807相关蛋白的多核苷酸。随后可针对昆虫抑制活性来筛选此类TIC807蛋白或TIC807相关蛋白。简并TIC807寡核苷酸还可用作为探针，用于基于杂交的方法，所述方法检测或分离编码TIC807蛋白或TIC807相关蛋白的多核苷酸。用于检测样品中编码TIC807蛋白的多核苷酸的方法首先包括选择源于SEQIDNO:5的TIC807多肽序列的筒并寡核苷酸或简并寡核苷酸集。这些简并寡核苷酸还可包含可检测的标记，例如，同位素、荧光团和半抗原。生物素是一种特别有用的半抗原。样品包括但不限于，源于多种^c/〃M^wi"/i^/e/^h菌林的样品。样品可以是源于一种或多种Asc//7^Mw/z^/e/^/s菌林的质粒、粘粒或噬菌体克隆的文库。可在合适的杂交严紧度条件下将简并寡核苷酸或简并寡核苷酸集与样品杂交。这些条件与简并寡核苷酸长度、简并程度、它们的G+C含量、想要的或计划的样品中靶序列的百分比序列同一性以及其它因子相关。通过包括但不限于放射测量、荧光测量、发光测量和/或基于ELISA的方法的方法来检测与多核苷酸的杂交。检测之后，可通过系列稀释和再杂交来分离多核苷酸。上文列出的关于简并寡核苷酸设计、寡核苷酸标记、文库制备、杂交、检测和分离的所有步骤都是本领域技术人员公知的(见MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition)，SambrookandRussel1，ColdSpringHarborPress,2001)。预计，可通过这些方法检测或分离编码与SEQIDNO:5至少70%或者至少90%相同的TIC807蛋白或与SEQIDNO:5至少45%相同的TIC807相关蛋白的多核苷酸。在无晶体突变型(acrystallifeorus)"ac2'/7M^^/力^^/^2、菌林中表达之后，随后可针对昆虫抑制活性来篩选此类TIC807蛋白或TIC807相关蛋白。TIC8O7或TIC807相关蛋白可抑制半翅目害虫，例如丄/^/s。备选地，TIC807或TIC807相关蛋白可抑制其它有害昆虫，包括Arachnid、鞘翅目、Ctenophalides、双翅目、膜翅目或鳞翅目害虫，或可既抑制半翅目害虫又抑制其它家族的有害昆虫。V.包含TIC807细菌表达盒的DM构建体为在细菌宿主中表达TIC807蛋白，可将编码TIC807的多核苷酸与合适的启动子和转录终止序列(在细菌宿主中有功能的)可操作相连，以产生细菌表达盒。在细菌细胞中有功能的启动子和终止信号可源于细菌基因、噬菌体基因或合成方法。然后可通过标准的重组DNA技术，将这些表达盒转到包含复制起点和可选择标志物(或称"可选择标记")的合适的细菌载体中。在本发明的实践中，在^ci^^宿主中发挥功能的细菌启动子、终止信号和载体特别有用于TIC807多肽的表达。在很多情况下，包含其内源启动子和终止序列的TIC807基因可用于在Ac/77^宿主细胞(包括但不限于》aci/7M"w/z^/e/w/s宿主)中表达TIC807蛋白。对于此类实验而言，使用在Aco7/和、ci/7^宿主中都有功能的穿梭载体是特别有用的。此类穿梭载体的例子包括但不限于下述载体，例如美国专利No.5，650，308中的描述的pEG854。这些穿梭载体包括允许转化^"77m宿主的抗生素抗性标志物基因。优选的5sc277mMwW/z^'e/^2宿主包括但不限于，无晶体突变型(acrystalliferous)(Cry蛋白缺卩备型)及^^wr/ag/eDs/s宿主菌林，例如EG10368和EG10650(在美国专利No.5，759，538中描述)。当TIC807蛋白在无晶体突变型(Cry蛋白缺陷型)AM盯2'/^/ei^y^宿主菌林中表达时，在宿主细胞中诱导芽胞形成后，TIC807蛋白易于作为伴胞晶体分离。因此这种易用的^c/"z^""r/i^/e/Ly"表达系统可用于针对昆虫抑制活性对大量TIC807蛋白变体加以测试。VI.包含TIC807植物表达盒的DNA构建体已良好建立起了用于单子叶植物或双子叶植物的表达盒。表达盒是DNA构建体，其中多种启动子序列、编码序列和聚腺苷化序列可操作地相连。通常，典型地，表达盒包含与感兴趣的序列(与聚腺苷化或终止子区域可操作相连)可操作相连的启动子。在某些情况下(包括但不限于在单子叶植物中表达转基因)，包括内含子序列也可能是有用的。当包括内含子序列时，其典型地放在转基因的5，非翻译引导区域中。在某些情况下，在转基因中并入特定的5，非翻译序列以增强转录物稳定性或促进转录物高效翻译也可能是有用的。多种启动子可用于本发明的实践。一类宽范围的有用的启动子被称为"组成型，，启动子,因为在植物整个发育期间在大多数植物器官中都有活性。例如，启动子可以是病毒启动子，例如，CaMV35S或FMV35S启动子。CaMV35S和FMV35S启动子在多种经转化的植物组织和大多数植物器官(例如，愈伤組织、叶、种子和根)中都有活性。CaMV35S和FMV35S的增强的版本或复制版本在本发明的实践中特别有用(美国专利No.5,378，619)。其它有用的胭脂氨酸合酶(NOS)和章鱼碱(OCS)启动子(在A.tumefaciens的肿瘤诱导质粒上进行)，花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子、玉米泛素启动子、水稻Actl启动子和Figwort花叶病毒(FMV)35S启动子(见，例如，美国专利No.5，463，175)。应当理解，这组示例性的启动子是非限制性的，本发明的实践中，本领域技术人员能利用并非本文明确提到的其它启动子。在某些植物组织中具有活性的启动子(即，组织特异性启动子)还可用于驱动TIC807蛋白或其它昆虫抑制性试剂的表达。鉴于某些半翅目有害昆虫是"刺吸式"昆虫，其典型地通过将其吸管插入宿主植物的维管组织来进食，指导昆虫抑制性试剂在转基因植物的维管组织中表达的启动子特别有用于本发明的实践。多种花椰菜花叶病毒(包括但不限于CaMV35S、CaMV19S、FMV35S启动子及其增强的版本或复制版本)典型地在维管组织中递送高水平的表达，因此可用于TIC807蛋白或其它昆虫抑制性试剂的表达。限于韧皮部的病毒，例如，水稻东格鲁病毒(Bhattacharyya-Pakrasietal-，PlantJ.4[1]71-79，1993)和鸭跖草黄斑驳病毒(Medberryetal.,PlantCell4:185-192，1992)，也含有在维管组织中具有活性的有用启动子。为控制在韧皮部上进食的半翅目昆虫，可使用韧皮部细胞特异性或韧皮部优先的启动子来在转基因植物的韧皮部表达TIC807蛋白或其它昆虫抑制性试剂。有用的韧皮部特异性启动子的例子包括但不限于，PP2型基因启动子(美国专利No.5，495,007)、蔗糖合酶启动子(YangandRussell,Proc.Natl.Acad.Sci,USA87:4144-4148，1990)、谷氨酰胺合成酶启动子(Edwardsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3459-3463，1990)和韧皮部特异性质膜H+-ATP酶启动子(DeWittetal.，PlantJ.l[l]:121-128，1991)、野黑樱苷水解酶启动子(美国专利No.6,797,859)和水稻蔗糖转运蛋白(美国专利No.7,186,821)。为控制在木质部组织上进食的半翅目害虫，可使用多种在木质部组织(包括但不限于原生木质部或次生木质部)上具有活性的启动子。在木质部组织中具有活性的启动子包括但不限于与类苯基丙烷生物合成途径相关的启动子，例如苯丙氨酸解氨酶(PAL)启动子、肉桂酸酯4-羟化酶(C4H)启动子、香豆酸酯3-羟化酶启动子、0-曱基转移酶(OMT)启动子、4-香豆酸酯CoA连接酶(4CL)启动子(美国专利No.6,831,208)、肉桂酰-CoA还原酶(CCR)启动子和肉桂基醇脱氢酶(CAD)启动子。转录增强子元件也可与在植物细胞中有活性的任何启动子或为了在植物细胞中的活性而需要增强子的任何基础启动子组合使用。转录增强子元件可在多种植物细胞中活化转录，其长度通常为100-200个碱基对。可通过化学合成活通过从包括此类元件的调控元件分离来获得增强子元件，其可包含额外的侧翼核苷酸，其中含有协助随后操作的有用限制性酶位点。典型地，增强子元件可放置于与启动子相连的mRNAcap位点的5，的区域，其也可位于cap位点的3，的区域(即，在5，非翻译区域、内含子中，或在3，聚腺苷化位点的3，)，以提41供可操作相连的基因的增加的表达水平。增强子也可被多聚化(以有限的相连拷贝存在)以提供可操作连接的增加的表达。多聚化的增强子包括但不限于，增强子以任何方向或方向组合的二聚、三聚或四聚拷贝。增强子通常源于植物病毒启动子，特别是双链DNACulimoviridae组(包含花椰菜花叶病毒和badnaviruses)的那些。植物病毒启动子或衍生的植物病毒增强子可提供转基因植物中可操作相连的基因的强组成型表达。源于这些启动子的片段的增强子已显示出能有效增强启动子驱动转基因在植物中的表达的性能。可用于分离增强子的植物病毒的例子包括但不限于花椰茱花叶病毒(CaMV)(见例如Odeletal.，Nature313:810,1985)、玄参花叶病毒(美国专利No.5，378，619)、康乃馨风化环病毒(CERV)(Hulletai.，(1986)EMBOJournal5:3083-3090)、木薯脉花叶病毒(CsVMV)(Calvertetal.(1995)J.Gen.Virol.76:1271—1278和美国专利No.6,963,021)、紫茉莉花叶病毒(固V)(Deyetal.(1999)PlantMolBiol.40:771-82)、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)(Stavoloneetal.(2003)PlantMolBiol.53:663-73)、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)(Xieetal.(2003)PlantMolBiol.53:1-14)、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)(美国专利No.6，963，021)和花生褪绿线条花叶病毒(PCLSV)(美国专利No.5，850，019)。双份重复的增强子被用于CaMV35S和FMV35S启动子的增强版本。还可将多种5，非翻译引导序列与感兴趣的编码序列在植物表达盒中可操作相连。因此，植物表达盒可含有一条或多条5，非翻译引导序列(作用于增加可操作相连的、编码TIC807或其它感兴趣蛋白的核酸编码序列的表达)。在不被理论束缚的情况下，此类5，非翻译引导序列可增加得到的mRNA的翻译效率和/或增加得到的mRNA的稳定性，以提供可操作相连的被编码的感兴趣蛋白在转基因植物的增加的水平。其它可用的5，引导序列的例子包括但不限于，dSSU、PetHSP705'和GmHSP17.95'非翻译引导序列。源于非翻译引导序列(来自紫花苜蓿花叶病毒衣壳蛋白基因的衣壳蛋白基因mRNA)的翻译增强子序列可被放到启动子和感兴趣的基因之间，以增强可操作相连的感兴趣的基因的翻译效率(美国专利No.6,037,527)。内含子也可被包括进DNA表达构建体，尤其是感兴趣的序列要在单子叶植物中表达的情况下。对于单子叶植物应用而言，可使用下述内含子，例如，玉米hsp70内含子(美国专利No.5，424，412)、玉米泛素内含子、Adh内含子l(Callisetal.，1987)、蔗糖合酶内含子(Vasiletal.，1989)或7JC稻Actl内含子(McElroyetal.,1990)。可使用的双子叶植物内含子包括已可操作整合进转基因的下述内含子，例如，CAT-1内含子(CazzonnelliandVelten，2003)、pKANNIBAL内含子(Wesleyetal.，2001;Collieretal.，2005)、PIV2内含子(Mankinetal.，1997)和"超级泛素"内含子(美国专利No.6，596，925;Collieretal.，2005)。应当理解，该组示例性内含子是非限制性的，本发明的实践中，本领域技术人员可利用本文没有明确提到的其它内含子。在本发明的其它一些实施方式中，编码提供TIC807蛋白在亚细胞细胞器中的定位的肽的序列可与编码TIC807多肽的序列可操作相连。预期，与信号序列可操作相连的TIC807多肽能进入分泌途径，并被细胞器(例如，内质网(ER))保留或者靶向液泡，这通过将合适的驻留或靼向肽与TIC807多肽C-末端可操作相连来实现。液泡靶向肽的例子包括但不限于来自大麦植物凝集素基因的CTPP液泡靶向信号。ER草巴向肽的例子包括但不限于包含KDEL氨基酸序列的肽。不被理论束縛的情况下，TIC807多肽在内质网或液泡中的定位可提供想要的性质，例如，在转基因植物中的增加的表达和/或在转基因植物中抑制昆虫的增加的效果。TIC807蛋白向植物质体(包括但不限于叶绿体)的定位也特别包括在本发明内。典型地，通过将叶绿体转运肽序列与TIC807蛋白的N-末端可操作相连来实现质体定位。可用于在转基因植物中定位TIC807蛋白的叶绿体转运肽(或CTPs)可源于核编码的、靶向质体的植物蛋白。核编码的、靶向质体的植物蛋白包括但不限于涉及脂质、淀粉或氨基酸生物合成的蛋白以及光合作用的蛋白。可使用的特定的叶绿体转运肽包括但不限于来自核编码的颗粒结合型淀粉合酶基因、质体脂肪酸去饱和酶基因、EPSPS基因和RUBISCO小亚基基因的CTPs。一种示例性的CTP是Jra62V0;^/sEPSPSCTP。本文提供了与TIC807蛋白可操作相连的、编码haW^jw"EPSPSCTP的示例性核酸(SEQIDNO:7)。不被理论束縛的情况下，TIC807多肽在质体中的定位可提供想要的性质，例如，在转基因植物中的增加的表达和/或在转基因植物中抑制昆虫的增加的效果。有文献提出，通过使用叶绿体靶向肽，例如，CrylBb(美国专利申请No.10/525318)、Cry2Ab(美国专利No.6,489,542)和Cry3Bb(美国专利No.6,501,009),增加其它》ac^7M^wr/i7^'e;7;y/;y蛋白的表达。不被理论束绰的情况下，TIC807多肽在转基因植物中的增加的表达可提供增加的昆虫抑制水平、扩大的有害昆虫抑制谱和/或增加的有害昆虫抗性管理程度。如上文所述，感兴趣的序列还可与含有聚腺苷化信号的3，非翻译区域可操作相连。该聚腺苷化信号提供了聚腺苷酸序列向RNA3，末端的添加。J^ro6ac&r/咖才艮瘤诱导(Ti)质粒胭脂氨酸合酶(N0S)基因3，和豌豆ssRUBISC0E9基因3，非翻译区域含有聚腺苷酸信号，它们代表了可用于本发明实践的此类3，非翻译区域的非限制性例子。应当理解，该组示例性聚腺苷化区域是非限制性的，本发明的实践中，本领域技术人员可利用本文没有明确提到的其它聚腺苷化区域。典型地，包含上文所述的植物表达盒的DM构建体保持在多种栽体中。载体含有提供载体复制的序列和宿主细胞中共价相连的序列。例如，细菌载体将含有允许载体在一种或多种细菌宿主中复制的复制起点。^i7^aWeWM7介导的植物转化载体典型包含允许在Aco7/和^^ro&c,er/咖两者中均能复制的序列以及定位于允许表达盒整合进植物染色体的位置一条或多条"边界，，序列。此类J^o^c"r/咖载体可^皮文造,以用于」^ro6ac^er/wz7fw/ze/ac/e力s或」g/o6acfer2'"/zr力/么^e刀(^中。典型地，载体中还包括编码赋予对抗生素的抗性的可选择标志物的基因，以提供它们在细菌宿主中的保持。VII.昆虫抑制性转基因植物和获得昆虫抑制性转基因植物的方法本发明还提供了获得能抑制昆虫的转基因植物的方法。首先，使用本文所述的转化技术，将适于在多种双子叶和单子叶植物中表达TIC807蛋白的表达载体引入植物、植物细胞或植物组织。接着，通过从获得了表达载体的植物、植物细胞或植物组织再生转基因植物，来获得含有或包含TIC807表达载体的转基因植物。最后的步骤是获得表达昆虫抑制量的TIC807多肽的转基因植物。本发明包括的、表达昆虫抑制量的TIC807蛋白的转基因植物包括但不限于，大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、草皮草、甘蔗、小麦、紫花苜蓿、香蕉、花椰菜、豆、巻心菜、油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘类、棉花、葫芦、桉树、亚麻、蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、杨树、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、番茄、装饰植物、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、稷、啤酒花和牧场草植物。可通过例:i。J^ro6a"eriM7介导的转^:、A力/么oWw/B介导的專争4匕、W/20r力h062'咖介导的转化、颗粒介导的转化、DNA转染、DNA电穿孔或"晶须(whiskers)，，介导的转化等方法将TIC807表达载体引入宿主植物的染色体。用于转化植物的合适方法包括可通过其将DM引入细胞的任何方法，例如，美国专利No.5，384，253中阐释的电穿孔；美国专利Nos.5，015,580、5，550，318、5，538，880、6,160,208、6,399,861和6，403，865中阐释的微粒轰击；美国专利Nos.5，635，055、5,824,877、5,591,616、5,981，840和6，384，301中阐释的J^ro6a"er/咖介导的转化；以及美国专利No.5，508，184中阐释的原生质体转化等。上面提到的引入转基因的方法都是本领域技术人员公知的，它们被描述于美国专利No.20050289673(J^ro6a"er/咖介导的对玉米的转化)、美国专利No.7，002，058(」^ro&c&W咖介导的对大豆的转化)、美国专利No.6，365,807(颗粒介导的对水稻的转化)和美国专利No.5，004，863(J^ro&c"r/咖介导的对棉花的转化)。通过应用例如这些技术，基本上任何植物物种的细胞都可被稳定转化，并且这些细胞可发育成转基因植物。特别有用于棉花转化范畴的其它技术被描述于美国专利Nos.5,846.797、5，159，135和6，624,344中；特别公开了用于转化"ra^/cs植物的技术，例如，在美国专利No.5，750，871中；以及公开了用于转化大豆的技术，例如，在Zhangetal.，1999和美国专利No.6,384，301中；以及W09506722中公开了用于转化玉米的技术。在Broothaerts，etal.，Nature.2005，10;433:629-33中描述使用细菌(例如W力j'zo6/咖或i7/7or力y^W咖)来转化植物的方法。还应当理解，TIC807表达栽体可包含被位点特异性重组酶(包括Cre、Flp、Gin、Pin、Sre、pinD、Int-B13和R)识别的顺式作用位点特异性重组位点。然后可使用通过用位点特异性重组酶将DNA分子在特定位置整合进转基因植物基因组的方法(美国专利No.7，102，055)。本领域技术人员还将知道，这些基因转移技术中的任何都可用于将表达载体引入植物细胞、植物组织或植物的染色体中。本发明还包括使用包含两种分离的T-DM分子的植物转化载体，其中一种T-DNA含有感兴趣的一种或多种基因(即，感兴趣的一种或多种昆虫抑制性基因)，另一T-DNA含有可选择和/或可计分标志物基因。在这两种T-DNA载体中，包含感兴趣的一种或多种基因的一种或多种植物表达盒被含有在一组T-DNA边界序列内，包含可选择和/或可计分标志物基因的一种或多种植物表达盒被含有在另一组T-DNA边界序列内。在一些优选的实施方式中，植物表达盒侧翼的T-DNA边界序列包含左和右T-DNA边界序列，它们被可操作地定向，以提供植物表达盒向植物基因组的转移和整合。当在^ro6ac"W咖介导的植物转化中用合适的^ro6ac"W咖宿主时，两种T-DNA载体提供了含有感兴趣的一种或多种基因的一种T-DM分子在一处染色体位置上的整合以及含有可选择和/或可计分标志物的另一T-DNA在另一染色体位置上的整合。首先通过针对标志物基因加以选择和/或计分以及针对感兴趣基因的表达进行筛选，获得既含有感兴趣的基因又含有可选择和/或可计分标志物基因的转基因植物。含有标志物基因和感兴趣基因两者的不同的转基因植物品系随后被异型杂交，获得标志物基因和感兴趣基因分隔的后代转基因植物群。可通过DM、RM或蛋白分析技术的组合鉴定出仅含感兴趣基因的后代植物。使用两种T-DNA载体的方法被描述于美国专利No.6,265,638、美国专利No.5，731，179、美国专利申请/〉开文本No.2003110532A1和美国专利申请公开文本No.20050183170A1中。还可将引入植物微型染色体(包含植物着丝粒，提供了重组微型染色体在转基因植物中的保持)的方法用于实践本发明(美国专利No.6,972,197)。在本发明的这些实施方式中，转基因植物具有作为染色体外元件的微型染色体，其并不整合进宿主植物的染色体。典型地，转基因植物通过下述方法获得将感兴趣的基因(本情况下，TIC807表达盒)与可选择标志物基因相连，通过上文所述的方法中的任何一种将连接的转基因引入植物细胞、植物组织或植物，以及在植物生长需要所述可选择标志物基因表达的条件下再生或者回收转基因植物。可选择标志物基因可以是编码新霉素磷酸转移酶蛋白、草胺膦乙酰基转移酶蛋白、草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸酯合酶(EPSPS)蛋白、潮霉素磷酸转移酶蛋白、二氢蝶酸合酶蛋白、磺酰脲不敏感的乙酰乳酸合酶蛋白、莠去津不敏感的Q蛋白、能降解溴苯腈的腈水解酶蛋白、能降解茅草枯的脱面酶蛋白、2，4-氯苯氧乙酸酯单氧合酶蛋白、曱氨蝶呤不敏感的二氢叶酸酯还原酶蛋白和氨基乙基半胱氨酸不敏感的章鱼碱合酶蛋白的基因。用于与每种基因组合使用的相应的选择性试剂可以是新霉素(用于新霉素磷酸转移酶蛋白选择)、草胺膦(用于草胺膦乙酰基转移酶蛋白选择)、草甘膦(用于草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸酯合酶(EPSPS)蛋白选择)、潮霉素(用于潮霉素磷酸转移酶蛋白选择)、磺胺嘧啶(用于二氬蝶酸合酶蛋白选择)、氯磺隆(用于磺酰脲不敏感的乙酰乳酸合酶蛋白选择)、莠去津(用于莠去津不敏感的Q蛋白选择)、溴苯腈47(用于腈水解酶蛋白选择)、茅草枯(用于脱卤酶蛋白选择)、2，4-氯苯氧乙酸(用于2,4-氯苯氧乙酸酯单氧合酶蛋白选择)、曱氨蝶呤(用于甲氨蝶呤不敏感的二氢叶酸酯还原酶蛋白选择)或氨基乙基半胱氨酸(用于氨基乙基半胱氨酸不敏感的章鱼碱合酶蛋白选择)。转基因植物还可这样获得将感兴趣的基因(即，在本情况下，TIC807表达盒)与可计分标志物基因相连，通过上文所述的方法中的任何一种将连接的转基因引入植物细胞，以及从针对可计分标志物基因的表达测试为阳性的经转化的植物细胞再生转基因植物。可计分标志物基因可以是编码p-葡糖苷酸酶蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、P-半乳糖苷酶蛋白、源于luc基因的荧光素酶蛋白、源于lux基因的荧光素酶蛋白、唾液酸酶蛋白、链霉素磷酸转移酶蛋白、胭脂氨酸合酶蛋白、章鱼碱合酶蛋白或氯霉素乙酰转移霉蛋白的基因。当表达载体被引入植物细胞或植物组织中时，典型地，通过在促进整抹植物形成的条件下，培养经转化的细胞或组织，来将这些细胞或组织再生为整林植物(即，再生叶、茎、根，以及在某些植物中，生殖组织的过程)。从单个植物原生质体或多种外植体来发育或再生转基因植物是本领域7>知的(Horsch，R.B.etal.1985)。典型地，这种再生和生长过程包括下述步骤选择经转化的细胞，以及在能产生生根幼植物的条件下培养选择的细胞。之后，在合适的植物生长培养基(例如土壤)中栽种得到的转基因生根嫩枝(或嫩芽)。备选地，可将转基因引入分离的植物嫩枝分生组织，不经历愈伤组织阶段组织培养物即再生植物(美国专利No.7,002,058)。当转基因直接引入植物，或者更特异性地，引入植物的分生组织中时，可从植物收获种子，并针对转基因的存在进行选择或计分。在有性生殖的转基因植物物种的情况下，可从经自交(自花授粉)或异型杂交(即，用作为花粉供体或受体)的植物收集种子，以建立和保持转基因植物品系。并非有性生殖的转基因植物可被营养繁殖，以建立和保持转基因植物品系。在本文中使用时，转基因植物品系表示源于转化事件(其中转基48因插入植物基因组中的一处或多处位置)的转基因植物。在一个相关子、来自此类种子的后代以及最初的转基因植物的后代的种子。此类后代和种子将具有稳定并入其基因组中的编码TIC807蛋白的转基因，此类后代植物将以Mendelian方式遗传稳定转基因引入所提供的性状。具有并入其基因组中的编码一种或多种TIC807蛋白或多肽的转基因DNA片断的所有此类转基因植物都是本发明的方面。还应认识到，可通过使用PCR或可特异性检测DNA构建体中序列的其它方法，来鉴定含有本文所述的DNA构建体的转基因植物以及源于其的材料。一旦再生或回收了转基因植物，可使用多种方法来鉴定或获得表达昆虫抑制量的TIC807的转基因植物。一种通常的方法组是进行检^^,以测量产生的TIC807的量。例如，利用了识别TIC807的抗体的多种基于抗体的检验方法可用于对产生的TIC807的量加以定量。此类基于抗体的检验的例子包括但不限于ELISAs、RIAs或下述其它方法，其中，用酶、同位素、荧光团、镧系元素等对识别TIC807的抗体进行可检测标记。通过在此类检验中使用经纯化或经分离的TIC807蛋白作为参照标准(即，提供已知量的TIC807),可测定植物组织中存在的TIC807的量(相对每克植物材料的摩尔或相对每克植物材料的质量)。典型地，TIC807蛋白将以"百分比之部分"或"ppm"上的水平在转基因植物中表达，其中，以克计的量的鲜重植物组织中存在微克水平的TIC807蛋白。在这种情况下，相对每1g鲜重植物组织而言1微克的TIC807将代表1ppm的TIC807浓度。TIC807蛋白的昆虫抑制量是至少5ppm(即，每克鲜重植物组织5pgTIC807蛋白)。在一些优选的实施方式中，TIC807蛋白的昆虫抑制量是至少50ppm(即，每克鲜重植物组织50pgTIC807蛋白)。在一些更优选的实施方式中，TIC807蛋白的昆虫抑制量是至少250ppm(即，每克鲜重植物组织50jugTIC807蛋白)。备选地，可测定转基因植物产生的TIC807mRNA的量，以鉴定出表达昆虫抑制量的TIC807蛋白的植物。用于将产生的蛋白的量与产生的RNA的量关联起来的技术是本领域技术人员已知的，其包括下述方法，例如，构建标准曲线，将特定的RNA水平(即，TIC807mRNA)与TIC807蛋白(通过免疫方法或其它方法测定的)关联起来。典型地，用于对TIC807mRNA进行定量的方法包括将多核苷酸与TIC807mRNA特异性杂交，或与源于TIC807RNA的PCR产物或cDNA(互补DNA)特异性杂交。此类多核苷酸探针可源于编码TIC807蛋白的转基因的正义和/或反义链核苷酸序列。可通过下述方法来检测多核苷酸探针与TIC807mRM或cDNA的杂交，所述方法包括但不限于使用经同位素、荧光团、镧系元素或半抗原(例如生物素或地高辛)标记的探针。当TIC807RNA处于溶液中或者被固定于例如膜的固体支持物上时，可检测经标记探针的杂交。当通过使用定量性的逆转录酶聚合酶链式反应(qRT-PCR)对TIC807RNA加以定量时，可通过使用上述任何经标记的多核苷酸探针，通过使用插入型染料(例如溴化乙碇或SYBR绿)，或使用含有荧光团和淬灭剂的杂交探针(使得当通过用于PCR反应(艮卩，TaqMan反应；AppliedBiosystems,FosterCity,CA)中的聚合酶的5，核酸酶活性释放荧光团时，或者当荧光团和淬灭剂被聚合酶介导的互补链合成代替(即Scorpion或MolecularBeacon探针)时，仅检测到来自荧光团的发射)，来检测源于TIC807的PCR产物。用于进4亍qRT-PCR分4斤以对mRNA水平加以定量的多种方法被良好表征(Bustin，S.A.;JournalofMolecularEndocrinology29,23，2002)。还可用能被识别错配核酸复合体的酶活性活化的荧光探针(即，Invader，ThirdWave，Technologies,Madison,WI)来对RNA加以定量。本领域:技术人员还将理解，RNA定量技术，例如QuantitativeNucleicAcidSequenceBasedAmplification(Q-NASBATM)可用于对编码TIC807蛋白的mRNA加以定量并对表达植物加以鉴定。还可通过直接针对昆虫抑制对植物加以检验，来鉴定出表达昆虫抑制量的TIC807的转基因植物。鉴于Z/^/s是食植物类的、刺吸式昆虫，必须以允许昆虫从植物或其相关组织进食的方式，对毒素蛋白进行植物内表达和测试。在对用于转化的植物物种(将允许对毒素蛋白加以测试)的选择中，若干因素是关键的。植物应当须易于转化，源于植物的组织应当是有害昆虫偏好的类型。就此目的而言，优选使用具有叶或足够大的表面积(足以加上障碍，抑制有害昆虫的运动，并且使得生物体从植物器官进食)的其它器官的植物。此外，植物器官的维管组织相对器官表面来说必须足够近，以允许有害昆虫探测到、穿透并且随后进食。还优选地，用于转化中的植物是易于被诱导以从未分化愈伤组织发育的类型。有害昆虫(例如Aj^m)在棉花植物上进食时，典型地，主要在花芽或棉桃上进食。棉花转化是本领域公知的，但是，从植物细胞的转化到完全发育的棉花植物所需的时间太长，对于筛选目的来说没有实用性。因此，当在经TIC807蛋白转化的棉花细胞上研究Z;^m的进食时，未分化的棉花愈伤组织将是优选的初始转基因植物测试材料。用含有编码TIC807蛋白的基周的构建体来转化棉花细胞。在Petri皿中，转化后令愈伤组织在组织培养物中发育。然后将Z/^Ay蛹放进含有愈伤组织的Petri皿中。Petri皿的封闭盖阻止了Zj^^蛹的逃逸。将阻止Z/^/;y逃逸但允许Petri皿中气体交换的任何材料，例如Parafilm,可用于封闭Petri亚盖。一定百分比的A^^蛹将发现愈伤组织并进食。然后在考虑到背景死亡(没有在愈伤组织上进食的那些昆虫发生的)的情况下，计算死亡率和发育迟緩的计分。还将Arg"蛹放在未经TIC807编码基因转化的对照愈伤组织上，作为愈伤组织上正常蛹生长的对照。TIC807蛋白介导的抑制的备选组织是叶组织。具有表面积足以放置防止A^i/;逃逸的障碍的叶组织的任何植物都可^f吏用。例如，可用含有编码毒素蛋白的基因或感兴趣的一种或多种基因(已针对单子叶或双子叶植物表达进行了优化)的构建体来转化紫花苜蓿、玉米、大豆或莴苣细胞。令经转化的细胞发育为愈伤组织，随后再生为植物。然后，当植物达到足够的成熟水平，例如，当叶生长到允许使用物理障碍防止Z;^z^逃逸的大小时，令有害昆虫(例如，A^"蛹)进食。防止Zygws逃逸的障碍可以是任何商业可获得的或自制的、允许Zj^m蛹与吖组织接触并允许昆虫探测叶的维管组织并进食的设备。与Mowry(1993)(J.Agric.Entomol.10:181-184)所述类似的孩史虫笼(clipcages)将足以装纳A^m蛹以进食。然后在考虑到背景死亡(没有在叶组织上进食的那些昆虫发生的)的情况下，测定死亡率和发育迟緩计分。还将A^^蛹放在未经TIC807编码基因转化的对照叶上，作为愈伤组织上正常蛹生长的对照。可用植物内昆虫抑制检验，来鉴定下述转基因植物，所述转基因植物能抑制刺和/或吸来自植物细胞和组织的流体的大量有害昆虫(应当受限于检验组织)中的任何。特别地，此类昆虫抑制检验可用于测试表达TIC807和/或其它昆虫抑制性试剂的植物。其它昆虫抑制性试剂包括但不限于，i)核糖核苷酸序列，所述有害昆虫摄入后发挥功能，抑制所述昆虫内的生物学功能，和ii)昆虫抑制性的非TIC807蛋白。这些有害昆虫包括刺然后吸韧皮部汁液或细胞内含物的那些有害昆虫以及浸软进食区附近的细胞然后通过吸管摄取从浸软的细胞释放的流体的那些有害昆虫。TIC807蛋白和本文所述的其它昆虫抑制性试剂靶向的昆虫包括多种半翅目、同翅目和异翅目昆虫。本发明特别包括，通过使用TIC807和本文所述的其它昆虫抑制性试剂，对昆虫(例如A^m、粉鼠、跳虫和辨虫)的抑制。VIII.转基因植物昆虫控制方法
技术领域：
：本发明的包含编码TIC807或其杀昆虫片段的多核苷酸的转基因植物可用于控制昆虫侵害的方法。转基因的大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、草皮草、甘蔗、小麦、紫花苜蓿、香蕉、花椰菜、豆、巻心菜、油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘类、棉花、葫芦、桉树、亚麻、蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、杨树、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、番茄、装饰植物、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、稷、哞酒花和牧场草可用于这些方法。本发明特别包括被TIC807蛋白抑制的半翅目有害昆虫攻击的转基因植物(例如紫花苜蓿、油菜、棉花、莴苣和草莓植物)。本发明进一步特别包括包含编码TIC807或其杀昆虫片段的多核苷酸的转基因棉花植物，所述植物受到保护，以抵挡A^^种的昆虫侵害。本发明的转基因植物对于控制刺和/或从植物细胞和组织吸流体的昆虫物种特别有效，所述昆虫包括但不限于Miridae科的盲蝽(plantbug),例如，西部牧草盲蝽(Z/^/s力e"er^物种)、牧草盲蝽(At^a///zeo7aWs物种)和灰豆棒(palelegumebugs)(Z/^ye//5^)和臭蝽(Stinkbug,尸e/^",'c^e科的物种)。本发明包括表达抑制特定有害昆虫的TIC807蛋白的特定类型的转基因植物。本发明特別包括表达抑制半翅目昆虫(包括Z/^/s、跳虫和虫牙虫)的TIC807蛋白的转基因棉花植物。表达SEQIDNO:5的TIC807蛋白的转基因棉花植物预计能抑制A^tas力ewerw或Ar^Ay///zeohr/i本发明还特别包括表达SEQIDNO:5的TIC807蛋白并且抑制A^^的转基因紫花苜蓿、油菜、莴苣和草莓植物。首先通过本文所述的方法中的任何一种来鉴定表达昆虫抑制量的TIC807蛋白的转基因植物。可在受控环境条件下(即，在封闭的生长腔或温室中)进行初始昆虫抑制。还可在田间测试中令转基因植物受到昆虫侵害，并将其与非转基因对照植物相比较。典型地，非转基因对照植物将包括被杀昆虫剂处理过的植物和未受处理的植物。展示出最佳昆虫抑制活性的转基因植物品系(即，源于明显的转基因事件(包含转基因向不同基因组位置的插入)的转基因植物)被选用于潜在的开发，以用于多种不同的遗传背景(即，遗传上不同的栽培种、品种和/或杂交种质)。将转基因种质渗入进另外的种质并且生产种子库(主要包含转基因种子)的方法是本领域技术人员已知的。例如，转基因可以以纯合状态固定于想要的遗传背景中。一旦转基因在该背景中固定，纯合的转基因植物可用于生产非杂交作物的转基因种子。备选地，纯合转基因植物可用作为花粉供体或受体，以生产杂交作物的转基因种子。本发明包括表达抑制特定有害昆虫的TIC807蛋白的特定类型的转基因植物。本发明特别包括表达抑制半翅目昆虫(包括Ar^/s、跳虫和虫牙虫)的TIC807蛋白的转基因棉花植物。表达SEQIDNO:5的TIC807蛋白的转基因棉花植物预计能抑制A^"s力e^er^或Ap^as72'/eohWs。本发明还特别包括表达SEQIDNO:5的TIC807蛋白并且抑制A^^的转基因紫花苜蓿、油菜和草莓植物。IX.非转基因对照方法和组合物本文公开的TIC807蛋白组合物特别可用作为昆虫抑制性试剂，用于局部和/或系统性地应用到田间作物、草、水果和蔬菜以及装饰植物上。更特定地，TIC807可用于包含昆虫抑制量的TIC807蛋白组合物的组合物中。在这方面，由针对》ac/77"s力"r/z^/e"Ws芽孢的TIC807晶体蛋白制备物制成的TIC807蛋白组合物特别有用。TIC807蛋白组合物可包含SEQIDNO:5的氨基酸序列或展示出与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列至少70%序列同一性的至少250个氨基酸的昆虫抑制性蛋白。昆虫承卩制性纟且合物还可包含^sc/77wst6ui7刀^7ei^/s细月包,或这些细胞的培养物，或者表达一种或多种本发明的TIC807晶体蛋白的一种或多种A^w2'/^7MS2、细胞的混合物。在某些方面，可能想要制备含有多种晶体蛋白(天然或经修饰的)的组合物，用于处理一种或多种类型的易感昆虫。本发明包括可使用本文公开的蛋白，利用本领域技术人员已知的任何配制方法，来制备昆虫抑制性组合物。可能想要配制表达一种或多种TIC807DNA片断的细胞培养物(优选地，细菌细胞培养物，例如^3"77m^wr/i^/e/25"2、培养物)的全细胞制备物、细胞提取物、细胞悬浮物、细胞均质物、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤出液或者细胞沉淀团，以生产编码的TIC807蛋白或肽。用于制备这些制剂的方法是本领域技术人员已知的，其包括，例如，对表达感兴趣的TIC807肽的细菌细胞(例如5a"77"sSIC8091、SIC8092、SIC8093和SIC8094细胞)的一种或多种培养物进行干燥、冻干、均质、提取、过滤、离54心.沉淀或浓缩。在一种实施方式中，昆虫抑制性组合物包含油可流动的悬浮液，其包含经裂解或未经裂解的细菌细胞、芽孢或晶体，其中含有一种或多种本文公开的新颖的晶体蛋白。优选地，细胞是A细胞，但是，本发明包括表达本文公开的新颖的核酸片断并且产生晶体蛋白的任何此类细菌宿主细胞j皮认为是有用的，例如，^c//7^spp.，包才舌及/Z7egateriw/H、及sw6fy7/s;及cerews,j6^c力er/c力/sspp.，，包括S.co7/和/或/^ew^o/z70flasspp.，包括户.c，c/a、户.aerw^7'力o》a和户./7uoi"esce"s。备选地，油可;充动悬'浮'液可由下述组合物中的一种或多种的组合构成经裂解的或未经裂解的细胞、芽孢、晶体和/或经纯化的晶体蛋白。在第二实施方式中，昆虫抑制性组合物包含水可分散的颗粒或粉末。该颗粒或粉末可包含经裂解的或未经裂解的细菌细胞、芽孢或晶体(其含有本文公开的新颖的晶体蛋白中的一种或多种)。这些组合物的优选来源包括细菌细胞，例如，及Mw/z^/e";y2、细胞，但是，本发明也包括经本文公开的DNA片断转化并表达晶体蛋白的5ac/7/ws、i5^c力er/c力/a和T^ew^o/z70/2as属的细菌也是有用的。备选地，颗粒或粉末可由下述组合物中的一种或多种的组合构成经裂解的或未经裂解的细菌细胞、芽孢、晶体和/或经纯化的晶体蛋白。在第三种重要的实施方式中，昆虫抑制性组合物包含可润湿的粉末、喷雾、乳剂、胶体、水性或有机溶液、尘末、沉淀团或胶态浓缩物。此类组合物可含有如上文所述的未经裂解的或经裂解的细菌细胞、芽孢、晶体或细胞提取物，它们含有本文公开的新颖的晶体蛋白中的一种或多种。优选的细菌细胞是A"wW"p'e/^/s细胞，但是，本发明也包括经本文公开的DNA片断转化并表达晶体蛋白的细菌，例如及/ffeg"eW亂A^f/6〃7/s、Acerew51、co7/或？5"ewd咖o/M51spp.细胞，它们也是有用的。此类干燥形式的杀昆虫组合物可被配制为润湿后立即溶解，或者备选地，以受控释放、緩释或其它时间依赖性方式溶解。备选地，此类组合物可由下述组合物中的一种或多种的组合55枸成经裂解的或未经裂解的细菌细胞、芽孢、晶体和/或经纯化的晶体蛋白。在第四种实施方式中，昆虫抑制性组合物包含经裂解的或未经裂解的细菌细胞、芽孢、晶体或经裂解的或未经裂解的细菌细胞、芽孢和/或晶体的混合物的水性溶液或悬浮液或细胞培养物，例如，上文描述的含有一种或多种本文公开的新颖的晶体蛋白的那些。此类水性溶液或悬浮液可作为经浓缩贮液提供(在应用前被稀释)或者可作为即用型稀释溶液提供。对于涉及细菌细胞的应用的这些方法而言，可在任何方Y更的营养培养基中培养含有TIC807蛋白基因的细菌宿主，其中，DNA构建体提供了选择性优点，提供选择培养基，使得基本上全部或全部细胞都保留及Mi/W/^/eiL2、基因。可按照传统方法收获这些细胞。备选地，可在收获之前对这些细胞进行处理。当杀昆虫组合物包含含有感兴趣的经修饰的晶体蛋白的及Mur/z^/e/^/s细胞、芽孢和/或晶体时，可以以多种方法来配制此类组合物。它们可用作为可润湿的粉末、颗粒或尘末，这通过与多种惰性材料，例如，无机矿物质(层状硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物性材料(粉末化的玉米芯、稻壳、胡桃壳等)混合来实现。制剂可包括延展剂-粘着剂佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂或表面活性剂。液体制剂可以是基于水的或者非水性的，它们可用作为泡沫、悬浮液、可乳化浓缩物等。成分可包括流变试剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。备选地，可通过天然或重组细菌表达系统，体外制备TIC807蛋白，并对其进行分离，以用于随后的田间应用。在活性杀生物制剂中配制之前，此类蛋白可以处于粗制细胞裂解物、悬浮液、胶体等中，或者备选地，可以经纯化、精制、緩冲和/或其它加工。类似地，在某些情况下，可能想要从表达晶体蛋白的细菌培养物分离晶体和/或芽孢，以及将此类晶体和/或芽孢的溶液、悬浮液或胶态制备物作为活性生物杀昆虫组合物应用。与应用方法无关，活性组分的量以昆虫抑制量应用，这将根据下迷因素变化，所述因素例如，待控制的特定的半翅目、同翅目或异翅目昆虫，待处理的特定植物或作物，环境条件，以及昆虫抑制性组合物应用的方法、比率和量。可通过将细菌细胞、晶体和/或芽孢悬浮液或经分离的蛋白组分与想要的农业可接受的载剂一起配制，来制造本文描述的昆虫抑制性组合物。在以合适的方式施用之前，可对组合物加以配制，例如冻干的、冷冻干燥的、干燥的或处于水性载剂、介质或合适稀释剂(例如盐水或其它緩冲液)中的。经配制的组合物可以是下述形式尘末或颗粒材料，或者是(植物或矿物)油中的悬浮液，或者水或油/水乳剂，或者作为可润湿粉末，或与适于农业应用的任何其它载剂材料组合。合适的农业载剂可以是固体或液体的，它们是本领域公知的。术语"农业可接受的载剂"包括通常用于杀昆虫剂配制技术的所有佐剂，例如，惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂(tackifiers)、粘结剂等，这些是杀昆虫剂配制领域的技术人员公知的。制剂可与一种或多种固体或液体佐剂混合，可通过多种方式来制备，例如，通过使用传统配制技术，进行均质混合、掺合和/或将杀昆虫组合物与合适的佐剂一起碾碎来实现。通过传统方法，优选通过喷雾，将本发明的昆虫抑制性组合物应用至靶标半翅目、同翅目或异翅目昆虫的环境，典型地，应用到待保护的植物或作物的叶上。根据特异于特定害虫、待处理的作物和特定环境条件的条件，来设置杀昆虫应用的强度和持续时间。活性成分与载剂的比例将自然取决于杀昆虫组合物的化学性质、溶解性和稳定性以及所用的特定的制剂。其它应用技术，例如，撒粉(dusting)、撒布(sprinkling)、浸湿(soaking)、土壤注射、种子包覆、幼苗包覆、喷雾、充气、喷薄雾(misting)、雾化等，也是可行的，在某些情况下可能是必须的，例如，导致根或茎干侵害的昆虫，或者用于精致的植被或装饰植物。这些应用流程也是本领域技术人员公知的。本发明的昆虫抑制性组合物可单独或与其它化合物(包括但不限于其它杀虫剂)组合用于本发明的方法。本发明的方法还可与其它处理(例如，表面活性剂、去垢剂、聚合物或时间释放制剂)组合使用。本发明的杀昆虫組合物可被配置，以用于系统或局部使用。用于环境、系统性或叶应用的昆虫抑制性组合物中的昆虫抑制性试剂的浓度将在很大范围内变化，这取决于特定的制剂的性质、应用手段、环境条件以及昆虫抑制活性的程度。典型地，组合物中的昆虫抑制性试剂将以按重量计至少大约1°/。的浓度存在于应用的制剂中，其可多至按重量计大约99%(含)。组合物的干制剂可以是组合物按重量计的大约1%至大约99%,而液体制剂将通常包含按重量剂大约1%至大约99%或更多的活性成分。包含完整细菌细胞的制剂将通常含有大约104至大约10"个细胞/mg组合物。在一种或多种应用中，昆虫抑制性制剂可根据需要施用给特定的植物或粑标区域，典型的田间应用率(每公项)在大约lg至大约lkg、2kg、5kg或更多活性成分的概数范围内。XI.商品本发明还包括可用本发明的组合物和方法获得的商品。此外，本发明特别包括，一种或多种优点可能与源于本发明的商品相关。预计，使用TIC807昆虫抑制性蛋白和相关方法可提供具有降低的杀虫剂残留水平的商品。在某些情况下，种植者将被鼓励使用更少的杀虫剂，例如，有机磷、氨基甲酸盐、新类烟碱(neonicotinoid)和拟除虫菊酯杀昆虫剂。种植、收获、加工或者接触本发明的商品的人向这些杀虫剂的暴露也因此预计有所降低。杀虫剂的使用降低还预计能提供降低的商品生产成本、降低的环境污染水平以及降低的不想要的对有益(非靶标)昆虫和动物群的副作用。本发明还包括，使用本发明将提供具有较低生产成本的商品，这因为包括但不限于增加的产率和/或减少的杀昆虫剂使用等因素。XII.将TIC807昆虫抑制性蛋白与其它昆虫抑制性试剂组合使用的方法
技术领域：
：本发明包括下述若干方法，通过所述方法，增加了对特定有害昆虫的抗性或对若干类有害昆虫的更广的抗性。两种方法都需要将有害昆虫与TIC807蛋白和另外的昆虫抑制性试剂的组合相接触。该另外的昆虫抑制性试剂可抑制与TIC807所抑制的相同的半翅目有害昆虫，以使得半翅目昆虫对TIC807蛋白或其它半翅目昆虫抑制性试剂的抗性发生率减少。备选地，该另外的昆虫抑制性试剂可抑制TIC807不抑制的昆虫，以扩展获得的昆虫抑制谱。昆虫对某些杀昆虫剂发展出抗性的潜力已被文献很好地记录。使用表达昆虫抑制性试剂的经遗传修饰作物的大多数昆虫抗性管理策略都依赖于使用庇护区域，其中包含缺乏昆虫抑制性基因的作物植物。理论上，庇护提供了这样的区域，其中，携带有非抗性遗传等位基因座的非抗性昆虫种群保留下来，从而降低了在昆虫种群中发展出抗性的潜力。但是，庇护策略遭遇很多缺点。首先，种植者必须接受种植昆虫抑制性基因的面积上的产量降低。笫二，庇护是否能有效控制昆虫种群中显性抗性等位基因座尚不清楚。一种备选的昆虫抗性管理策略可利用表达两种不同的昆虫抑制性试剂(通过不同的作用模式运作)的转基因作物。在这种情况下，对昆虫抑制性试剂之一有抗性的任何昆虫将受到另一昆虫抑制性试剂的控制，由此降低了在昆虫种群中发展抗性的机会。此外，在田间，单种作物可能经历过同时存在的多种不同类的有害昆虫。例如，在生长季，棉花植物可能受到半翅目害虫(例如Af^/;)和鳞翅目害虫(例如5^o化;^eraez/g"a(甜菜夜蛾)、j7e7/o^2zea(冲帛铃虫)和/或^i/coFe，a,/zi^ra(夜盗蛾))两者的攻击。对这些害虫中的每种有活性的不同的抑制性试剂的表达将提供对棉花植物的更好的保护，并且，由于有害昆虫导致的损失降低，这将增加英亩产量。可与TIC807蛋白组合用于昆虫抗性管理或扩展的昆虫抑制镨的59第一组昆虫抑制性试剂包含下述核糖核苷酸序列，其被所述有害昆虫摄入后，所述序列发挥功能以抑制所述有害昆虫内的生物学功能。选自特定的害虫细胞的天然的、涉及必要生物学途径的序列的特定核苷酸序列可以以导致形成双链RNA或者甚至是稳定的双链RNA的方式在细胞中表达。通过用核糖核苷酸抑制靶标有害昆虫的必要基因产物，生物体无法法发育，最终死亡。在美国专利申请公开文本No.20060021087中对使用此类核糖核苷酸序列来控制有害昆虫(例如Z/^/s)进行了描述。靶向提供下述必要生物学功能的必要昆虫基因，以进行抑制，所述生物学功能包括但不限于肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素调控，离子调控和运输，消化酶的合成，细胞膜势能保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素传感，触角形成，翅膀形成，腿形成、发育和分化，卵形成，幼虫成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神经传递，细胞分裂，能量代谢，呼吸和凋亡。可被抑制的昆虫基因包括但不限于编码V-ATP酶蛋白、泛素蛋白、多聚半乳糖醛酸酶蛋白、果胶酶蛋白、GABA神经递质转运蛋白、EFIa蛋白、细胞色素P-450单氧合酶蛋白、表皮蛋白前体蛋白、CHD3蛋白和20S蛋白酶蛋白的基因。基于核糖核苷酸的昆虫控制试剂还可包含针对多种昆虫靶向基因的序列。为控制A^M，本发明特别包括针对SEQIDNO:24至SEQIDNO:39的抑制性核糖核苷酸或针对SEQIDNO:24至SEQIDNO:39的抑制性核糖核苷酸的组合。SEQIDNO:24至SEQIDNO:39在昆虫控制中的用途在美国专利申请公开文本No.20060021087中公开。当多种昆虫基因被靶向以阻遏时，可按照Filiatti，美国申请公开文本No.2004-0029283Al中阐释和公开的，制造多顺反子DM元件。可使用多种方法来在转基因植物中生产针对靶标害虫的抑制性核糖核苷酸。通常，抑制性dsRNA和昆虫靶标基因的部分工相至少大约80%的序列同一性，或者大约90%的序列同一性，或者大约95%的序列同一性，或者大约99%的序列同一性，或者甚至大约100%的序列同一性。备选地，RNA的双链体区域可在功能上被定义为能与輩巴标基因60转录物的一部分杂交的核苷酸序列。展示出更高同源性的较全长短的序列能补偿较长但较少同源性的序列。相同核苷酸序列的长度可以是至少25、50、100、200、300、400、500或1000个碱基。通常，应当使用超过20-100个核苷酸的序列，虽然超过大约200-300个核苷酸的序列将是优选的，超过500-1000个核苷酸的序列将是尤其优选的，这取决于靶标基因的大小。在另一实施方式中，可通过"间隔序列，，分开的反向重复来产生晃虫抑制性核糖核苷酸。间隔序列可以是这样的区域，其中包含在需要的时侯协助各重复之间形成二级结构的任何核苷酸序列。在本发明的一种实施方式中，间隔序列是mRNA的正义或反义编码序列的一部分。备选地，间隔序列可包含能与核酸分子共价相连的核苷酸或其同源体的任何组合。间隔序列可包含长度为至少大约10-100个核苷酸的核苷酸序列，或者备选地，长度为至少大约100-200个核苷酸，长度为至少大约200H00个核苷酸，或者长度为至少大约400-500个核苷酸。用于生产dsRNA的转基因序列可包含启动子，其与内含子编码序列和源于靶标基因中的序列的发卡RM可操作相连(MikiandShimamoto，PlantCellPhysiol.Apr2004;45(4):490-495)。备选地，用于生产siRNA的转基因可包含与发卡RNA可操作相连的RNApolIII启动子(etal.，NucleicAcidsRes.Dec22004;32(21):el71)。发卡RNA可包含正义链靶标基因序列的大致19-24个核苷酸的5，序列，接着是大约8-IO个核苷酸的间隔核苷酸，接着是反义序列的大致19-24个核苷酸的序列(其能与前面的正义链序列碱基配对)。但是，也可使用含有98至853个的范围内的核苷酸的正义/反义臂的、表达发卡MA的植物转基因(Wesleyetal.，PlantJ.2001，27(6):581-90)。用于发卡RNAs的转基因介导的表达的载体和方法公开于美国专利申请Nos.20050164394、20050160490和20040231016中。可与TIC807蛋白组合使用用于昆虫抗性管理或扩大的昆虫抑制揭的第一组昆虫抑制性试剂包含并非TIC807的昆虫抑制性蛋白。可使用源于及Mwri/^/eas/^尸力ofor力a^/ws和/或Ze/or力a^/iAy的多种昆虫抑制性蛋白。为控制刺吸式昆虫(例如AF^/s),可将若干非TIC807昆虫抑制性蛋白与TIC807在植物中组合表达，以获得更好的控制和/或抗性管理。在植物中与TIC807—起表达的此类分子可包括ET79、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128(PCTUS2006/033867)、AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038(WO06/107761)、AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021(W006/083891)、AXMI-010(WO05/038032)、AXMI-003(WO05/021585)、AXMI-008(US2004/0250311)、AXMI-006(US2004/0216186)、AXMI-007(US2004/0210965)、AXMI-009(US2004/0210964)、AXMI-014(US2004/0197917)、AXMI-004(US2004/0197916)、AXMI-028和AXMI-029(WO06/119457)和AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004(WO04/074462)。关于抑制性蛋白分子的组合，TIC809(示为SEQIDNO:10)和TIC810(示为SEQIDNO:l2)以前已在生物检验中显示出对西部牧草盲蝽(WTPB)，A^"s力esperusKnight有抑制性(PCTUS2006/033867)。TIC809和TIC810的融合蛋白——TIC127(示为SEQIDNO:14)和TIC128(示为SEQIDNO:16)也可对Zj^m有活性。编码TIC127的多核普酸包含编码TIC809的核酸分子，该分子与编码TIC810的核酸分子通过多接头核苷酸序列(示为SEQIDNO:17,编码SEQIDNO:18中示出的氨基酸接头)相连。编码TIC128的多核苷酸包含编码TIC810的核酸分子，该分子与编码TIC809的核酸分子通过多接头核苷酸序列(示为SEQIDNO:l7，编码SEQIDNO:18中示出的氨基酸接头)相连。TIC807与TIC127或TIC128的组合表达可提供对的增强的控制。可用下述植物表达构建体来转化双子叶植物，例如，棉花，所述构建体含有经双子叶植物优化的、编码TIC807(示为SEQIDNO:6)的核苦酸序列以及TIC809(示为SEQIDNO:9)和TIC810(示为SEQIDNO:11)，或TIC127(示为SEQIDNO:200880020577.113)弟.TIC128(示为SEQIDNO:15)，以提供对At^aj的增强的抗性或者抑制Ar^/s属内含有的其它物种。为控制鳞翅目害虫，本发明特别包括TIC807蛋白与鳞翅目活性蛋白(例如，CrylA蛋白(美国专利No.5,880,275)、CrylB(美国专利No.10/525,318)、CrylC(美国专利No.6,033,874)、CrylF，CrylA/F嵌合体(美国专利Nos.7，070,982、6，962，705和6,713,063)和Cry2Ab蛋白(美国专利No.7，064，249))的组合。编码TIC807蛋白分子和其它昆虫抑制性试剂(例如双链RNA分子和/或非TIC807蛋白)的DM序列可通过直接转化、通过育种或其组合方式，组合于单种植物中。可将包含启动子和昆虫抑制性试剂编码载:。、当两种k虫抑制性试;是蛋白时，可通i蛋白":感性接头或者甚至自身加工蛋白酶切割位点，将针对每种的编码区域分开(见美国专利No.5,846,767)。当昆虫抑制性试剂每种被引入不同的转基因植物中时，可杂交这些植物，以获得含有所有的昆虫抑制性试剂编码转基因的植物。还预计，TIC807蛋白分子与其它昆虫抑制性试剂(例如双链RNA分子和/或非TIC807蛋白)的组合可带来意料不到的协同性昆虫抑制性效果，这是单独使用TIC807杀昆虫蛋白、单独使用抑制性核糖核苷酸或者单独使用非TIC807昆虫抑制性蛋白时观察不到的。协同性效果包括但不限于i)LC5。、EC5。、IC5。、百分比死亡率或百分比发育迟緩值的定量改变，和ii)不反映每种昆虫抑制性试剂单独展示的谱(即，一种试剂提供的半翅目昆虫抑制和另一试剂提供的鳞翅目昆虫抑制的组合)的简单组合的昆虫抑制谱定性改变(即，半翅目、同翅目和鳞翅目昆虫抑制)。协同性定量效果的例子包括但不限于在组合中观察到的比加合性更大的LC5。、EC5Q、和/或ICs。的减少、或百分比死亡率或百分比发育迟緩值中的任何的增加。协同性定性效果的例子包括但不限于用昆虫试剂的组合对有害昆虫的控制是单独用任何成员时都看不到的。在这种情况下，通过組合控制的新的有害昆虫可以是昆虫目(即半翅目)内的，其中，昆虫抑制性试剂仅抑制单独使用时针对的昆虫目内的其它有害昆虫。XIII.经分离的TIC807蛋白和生物等同物本发明还提供了经分离的TIC807蛋白。在一种实施方式中，TIC807蛋白包含与SEQIDNO:5具有至少70°/。序列同一性的至少250个氨基酸的蛋白，并且展示出昆虫抑制活性。本文包括的生物功能等同物的肽、多肽和蛋白应当与TIC807多肽序列的序列或其中的相应部分具有大约70%或更高的序列同一性，优选大约85%或更高的序列同一性，以及最优选大约90%至95%或更高的序列同一性。在本发明的某些实施方式中，的生物功能等同物的肽、多肽和蛋白与TIC807的序列(SEQIDNO:5)具有80%或80%以上，优选大约85%、86%、87%、88%、89%或更高的序列同一性，以及最优选大约90%、91%、92%、93%、94°/。、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。与TIC807生物功能等同的肽、多肽和蛋白包括但不限于在TIC807蛋白序列中含有保守氨基酸取代的氨基酸序列。可被取代已获得生物等同物的TIC807蛋白的例子包括但不限于TIC807蛋白序列(SEQIDNO:5)。在此类氨基酸序列中，序列中的一处或多处氨基酸可被电荷和极性与原有氨基酸类似的另一氨基酸取代，即，保守氨基酸取代，这产生沉默改变。TIC807多肽序列内的氨基酸的取代可选自天然存在的氨基酸所述的类别中的其它成员。氨基酸可被分入下述四组(l)酸性氨基酸；(2)碱性氨基酸；(3)中性极性氨基酸；和(4)中性非极性氨基酸。这若干组内代表性的氨基酸包括但不限于U)酸性(负电荷)氨基酸，例如，天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(正电荷)氨基酸，例如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)中性非极性(疏水)氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。200880020577.1可将这些組之一中的一个氨基酸取代为同组的另一氨基酸，来制進TIC807多肽序列中的保守氨基酸改变。TIC807的生物功能等同物可具有IO处或更少的保守氨基酸改变，更优选地，7处或更少的氨基酸改变，最优选地，5处或更少的保守氨基酸改变。编码核苷酸序列(基因、质粒DNA、cMA或合成DNA)因此将具有相应的碱基取代，这令其得以编码TIC807的生物功能等同物形式。如所指出的，可在本发明的肽和编码它们的DNA片断的结构中制造修饰和改变，但仍获得编码具有想要的特征的蛋白或肽的功能分子。下述讨论基于对蛋白氨基酸的改变，以制造等同物或者甚至有所改进的第二代分子。在本发明的某些特别的实施方式中，经突变的TIC807蛋白可用于增加蛋白的昆虫抑制活性，由此增加植物细胞中重组转基因的表达和/或昆虫抑制活性。可根据表1给出的密码子，通过改变DNA序列的密码子来实现氨基酸改变。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>例如，在蛋白结构中，某些氨基酸可被其它氨基酸取代，而不会导致生物化学活性或生物学活性有可观损失。鉴于界定蛋白生物学功能活性的是蛋白的交互能力和性质，因此可在蛋白序列中制造某些氨基酸序列(当然，根本的DNA编码序列)取代，但获得具有类似性质的蛋白。发明人由此提出可在公开的组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中制造多种改变，而不会导致生物利用性或活性的可观损失。在制造此类改变时，可考虑到氨基酸的水指数(hydropathicindex)。氨基酸水指数对于赋予蛋白交互生物学功能的重要性通常是本领域所理解的(KyteandDoolittle，JMolBiol.157(1):105-32，1982)。公认，氨基酸的相对水指数特征为得到的蛋白的二级结构作出贡献，这进而界定了蛋白与其它分子(例如酶、底物、报道子、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。基于其疏水性和电荷特征，每种氨基酸都被分配了水指数(KyteandDoolittle，Ibid)。它们是异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);曱硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。本领域中已知，某些氨基酸可被具有近似水指数或计分的其它氨基酸取代，但仍得到具有相似生物学活性的蛋白，即，仍获得生物功66能等同物蛋白。在制造此类改变时，水指数在+2之内的氨基酸的取代是优选的，在+1之内的那些是特别优选的，在+0.5之内的那些是进一步更优选的。还应当理解，对相似氨基酸的取代可基于亲水性有效进行。美国专利No.4，554，101指出，蛋白的最大的局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性控制)与蛋白的生物性质相关。如美国专利No.4，554，101指出的，已向氨基酸残基分配了下述亲水性值精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0.+0.1);谷氨酸(+3.0.+0.1);丝氨酸(+G,3);天冬酰胺(+Q.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(G);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5.+0.1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。TIC807多肽中的非保守取代还应认识到，可在TIC807多肽序列中制造非保守取代，以获得是本文公开的TIC807多肽的功能生物等同体的TIC807多肽。在这些情况下，可针对对真菌生长的抑制，对非保守取代进行筒单地测试，以鉴定出提供给定的TIC807多肽的功能生物等同体的非保守取代。TIC807的片段和变体虽然本发明的昆虫抑制性多肽优选包含TIC807蛋白序列，但与该昆虫抑制性蛋白具有相同或相似昆虫抑制活性的该序列片段和变体也包括在本发明内。因此，具有昆虫抑制活性的、TIC807蛋白中至少250或更多个氨基酸的连续序列也是本发明所预期的。具有本发明预期的昆虫抑制活性的TIC807片段或变体也可在TIC807蛋白序列中包含氨基酸取代、缺失、插入或添加。本发明的昆虫抑制性多肽优选包含TIC807蛋白序列(SEQIDNO:5)，具有与该特定TIC807蛋白相同或相似的昆虫抑制活性的、该序列的片段和变体也包括在本发明内，这是本发明所预期的。因此，具有昆虫抑制活性的、SEQIDNO:5中至少250或更多个氨基酸的连续序列是本发明所预期的。昆虫抑制性的TIC807片段还可包含SEQIDNO:5的309个氨基酸的TIC807序列中的至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个氨基酸。具有本发明预期的昆虫抑制活性的片段或变体也可在SEQIDNO:5所示的序列中包含氨基酸取代、缺失、插入或添加。成熟TIC807蛋白的片段可以是截短形式的，其中，一个或多个氨基酸从N-末端、C-末端、蛋白中部或这些的组合处缺失，但仍具有昆虫抑制活性，这也是本发明所预期的。这些片段可以是TIC807的天然存在的突变体或合成突变体，并且保留有TIC807的昆虫抑制活性。可用于获得具有昆虫抑制活性的截短的衍生物的一种优选TIC807蛋白是SEQIDNO:5的TIC807蛋白。TIC807的变体包括下述形式，其中，一处或多处氨基酸已被插入天然序列。这些变体也可以是TIC807的天然存在的突变体或合成突变体，并且保留有TIC807的昆虫抑制活性。前述的组合，即氨基酸缺失和添加都含有的昆虫抑制性多肽的形式也被本发明所包括。其中也可存在氨基酸取代。本发明所包括的TIC807的片段和变体优选应当与具有SEQIDNO:5所示的相应氨基酸序列的成熟TIC807蛋白的相应区域具有大约70-75°/。或更高的序列同一性，更优选大约80%、85%、88%或更高的序列同一性，以及最优选地，大约90%至95%或更高的氨基酸序列同一性。结构功能关系用于设计昆虫抑制性TIC807变体的用途本发明还包括将结构功能关系用于设计其它昆虫抑制性TIC807蛋白变体的用途。首先，可通过对TIC807晶体的晶体学分析来获得结构。预计此类结构揭示了TIC807蛋白中对TIC807的昆虫抑制活性做出贡献的昆虫受体结合、昆虫肠中孔形成、与TIC807的多聚化、蛋白酶敏感性和/或蛋白酶抗性中涉及的结构域。还预计，对TIC807和其它相关蛋白的比较可允许推断出对TIC807蛋白的杀昆虫活性做出贡献的蛋白结构域。在该方面，注意到，TIC807具有与MTX样蛋白家族的一定相似性。该Mtx样蛋白家族是按"3"7/^5s/力e"'cy51蛋白Mtx2(ThanabaluandPorter,Gene.170(1):85，1996;NCBI检录No.2211294A)和Mtx3(Liuetal.，ApplEnvironMicrobiol.62(6):2174，1996;NCBI检录No,AAB36661)命名的，其包括Cryl5Aa(SEQIDNO:41)、Cry33Aa(NCBI检录No.AAL26871)、Cry23Aa(NCBI检录No.AAF76375)、Cry38Aa(NCBI检录No.AAK64559)、CryC35(NCBI检录No.CAA63374)、機D蛋白(NCBI检录No.AAA22332)和CryNT32(NCBI检录No.AAL26870)。还认为，TIC807与气溶素蛋白家族距离上相关，该家族包括cryET33(WO97/17600)和TIC901(美国专利申请No.20060191034)。气溶素是这样的一组蛋白，其多聚化，并在膜中形成孔，已知它们是毒素(Parkeretal.,Mol.Microbiol.19(2):205，1996)。特别地，晶体结构测定表明，气溶素的e-折叠结构域参与形成膜孔(RossJohnetal.，JStructBiol.121(2):92,1998)。可用来自其它MTX冲羊或气溶素家族蛋白的相似结构域代替TIC807蛋白的结构域，以鉴定出参与对TIC807的昆虫抑制活性做出贡献的昆虫受体结合、昆虫肠中孔形成、与TIC807的多聚化、蛋白酶敏感性和/或蛋白酶抗性中涉及的结构域。可比较来自结构域代替实验的数据，或者将其推广至Mtx样蛋白家族成员的结构数据，以阐明提供不同的杀昆虫活性、改进的杀昆虫活性、改进的结合特征、改进的孔形成能力的结构域。已经鉴定了TIC807蛋白中提供TIC807蛋白的昆虫抑制性质(即，昆虫受体结合、昆虫肠中孔形成、与TIC807的多聚化、蛋白酶敏感性和/或蛋白酶抗性)的某些蛋白结构域，还预计，这些区域可被广泛地诱变。一旦被诱变，可对进行变体TIC807蛋白进行生物化学检验(即，昆虫受体结合、昆虫肠中孔形成、与TIC807的多聚化、蛋白酶敏感性和/或蛋白酶抗性)或生物学检验(即，昆虫抑制检验)，以鉴定出赋予改进的生物化学和/或昆虫抑制活性的那些变体。本发明还包括对鉴定出的这些变体再进行重复的诱变和检验轮次。可利用本领域技术人员已知的(Steinmer，W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747,1994;Yuanetal.,Microbiol.Mol.Biol.Rev.69(3):373，2005)或其它完全不同的方法所提供的、用于经分离蛋白的分子进化的多种流程，来产生TIC807蛋白变体。至少9个氨基酸的经分离的TIC807蛋白在本发明的其它一些实施方式中，提供了下述经分离的蛋白，其包含SEQIDNO:5中含有的长度为至少9个氨基酸的多肽序列。本发明包括至少9个氨基酸的TIC807肽序列的至少两种不同的用途。首先，本发明包括，可将至少9个氨基酸的TIC807肽序列取代进不同的蛋白序列，以在得到的经TIC807肽取代的蛋白上赋予TIC807蛋白的昆虫抑制活性中的全部或亚组。TIC807肽序列赋予的昆虫抑制性活性可包含对半翅目害虫(包括但不限于A^m)的抑制。在不被理论束縛的情况下，我们相信，当插入另一蛋白时，由于上文指出的理由中的全部或任何，至少9个氨基酸的TIC807肽序列可提供1)改进的晶体形成，2)改进的蛋白稳定性或降低的蛋白酶降解，3)改进的昆虫膜受体识别和结合，4)昆虫中肠内皮中改进的寡聚化或通道形成，和5)改进的杀昆虫活性或杀昆虫特异性。来自SEQIDNO:5的至少12、至少16、至少32、至少50或至少IOO个氨基酸残基的较大的TIC807肽序列也可被取代进不同的蛋白序列，以获得经昆虫抑制性的TIC807肽取代的蛋白。可通过下述技术来合成经TIC807肽取代的蛋白，所述技术包括但不限于位点特异性诱变(Kunkel，T.A.etal.Meth.Enzymol.154:367，1987)、DNA改组((Stemmer，W.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747，1994)、PCRTM重叠延伸(Hortoneta1.,Gene77:61，1989)、<壬<可蛋白分子进4^方法(Yuanetal.,Microbiol.Mol.Biol.Rev.69(3):373,2005)、直接合成、这些方法的组合，或者通过提供经TIC8(H取代的蛋白的其它完全不同的方法来进行。特别地，本发明包括通过将至少9个氨基酸的TIC807肽序列插入或取代进源于70^c^/i^Mi/r/z^/e/2W;的昆虫抑制性蛋白而获得的经TIC807取代的蛋白。可^皮TIC807多肽取代以获得具有昆虫抑制活性的经TIC807取代的蛋白的示例性^"'77mMwW"乡ye/2Ws蛋白包括但不限于Cryl5Aal(Brown&Whiteley,1992，JBacteriol174549-557;SEQIDNO:41)、CryET29(美国专利No.6，093，695)、CytlBal(美国专利No.5,723,440)、"aci/7y^f力wri"^7e/^/sisraelensisCyt毒素(美国专利No.5，885，963)和另外的活性A"77"《MwW邱/ew/s晶体蛋白AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038(美国专利申请公开文本No.20060242732中公开的)。可被TIC807多肽取代以获得具有昆虫抑制活性的经TIC807取代的蛋白的其它蛋白包括但不P艮于Mtx2(ThanabaluandPorter,Gene.170(1):85，1996;NCBI检录No.2211294A)、Mtx3(Liuetal.,ApplEnvironMicrobiol.62(6):2174，1996;NCBI检录No.AAB36661)、Cryl5Aa(SEQIDNO:41)、Cry33Aa(NCBI检录No.AAL26871)、Cry23Aa(NCBI检录No.AAF76375)、Cry38Aa(NCBI检录No.AAK64559)、CryC35(NCBI检录No.CAA6337.4)、40KD蛋白(NCBI检录No.AAA22332)、CryNT32(NCBI检录No.AAL26870)、cryET33(W097/17600)和TIC901(美国专利申请公开文本No.20060191034)。本发明还包括，大约250至大约309个氨基酸之间的经分离的TIC807蛋白还可用于抗体生产或昆虫抑制。本发明的这些经分离的TIC807多肽序列与SEQIDNO:5内含有的相应多肽序列具有至少大约70%，至少大约90%，至少大约95%或100%的序列同一性。这些TIC807蛋白还可包含共价相连的指示剂、氨基酸间隔、氨基酸接头、信号序列、叶绿体转运肽序列、液泡靶向序列或停止转移序列。本发明还包括，SEQIDN0:5的至少9个连续氨基酸的经分离的TIC807肽序列可用作为免疫原或表位，以制备识别TIC807蛋白的抗体。此类抗体可用于检测转基因植物中、源于转基因植物的商品中、微生物或重组DM表达文库(含有克隆的TIC807序列)中的TIC807蛋白。TIC807多肽长度可以是至少9、至少12、至少16或至少32个氨基酸。当TIC807肽序列长度为至少32个氨基酸时，其与SEQIDNO:5内含有的相应多肽序列具有至少大约80°/。、90%或95%的序列同一性。肽可与载剂蛋白(例如KLH或清蛋白)相连，以协助抗体生产。鉴定出适用于疫苗中的TIC807蛋白免疫决定表位和/或其功能等同物是相当简单的。例如，技术人员可利用Hopp在美国专利No.4,554,101中教导的方法，其中教导了基于亲水性来从氨基酸序列鉴定和制备表位。还可使用若干其它文章中描述的方法以及基于它们的软件程序来鉴定表位核心序列(见，例如，美国专利No.4,554,101)。这些"表位核心序列"的氳基酸序列也可容易地并入肽中，这通过应用肽合成或重组DNA技术来实现。根据本发明使用的优选的TIC807肽通常将在大约9至大约20个氨基酸的长度概数内，更优选地，大约9至大约15个氨基酸的长度。我们提出，较短的抗原性TIC807蛋白源的肽在某些情况下将提供优点，例如，在免疫检测检验的制备中。示例性的优点包括易于制备和纯化、相对较低成本和改进的生产重现性以及有好处的生物分布性。我们提出，可通过制备下述合成肽来实现本发明的优点，所述合成肽包括经修饰的和/或延伸的表位/免疫原性核心序列，这导致产生了针对TIC807蛋白(以及特别针对TIC807相关序列)的"通用，，表位肽。在本发明中一些特別的方面，这些表位核心序列作为特殊多肽抗原的亲水区域被鉴定。我们提出，这些区域代表了最可能促进T-细胞或B-细胞刺激以及因此诱发特异性抗体生产的区域。在本文中使用时，表位核心序列是相对较短的氨基酸段，其与本文公开的针对TIC807蛋白的抗体上的抗原结合位点"互补"并因此将与其结合。此外或备选地，表位核心序列是这样的序列，其诱发与针对本发明的肽组合物的抗体有交叉反应性的抗体。因此，可根据其对想要的蛋白抗原与相应的针对蛋白的抗血清的结合的竟争或者可能代替的能力，从操作上对本发明的某些表位核心序列加以定义。通常，认为多肽抗原的大小并不关键，只要其至少长到能携带给定的一种或多种核心序列即可。本文公开内容中预计最小的有用核心72序列将通常是长度为大约9个氨基酸的概数，概数为10至20个氨基酸的序列是更优选的。因此，该大小通常对应于根据本发明制备的最小的肽抗原。但是，如果需要的话，抗原的大小也可以更大，只要其含有基本表位核心序列即可。XIV.TIC807抗体组合物和制造抗体的方法在一些特别的实施方式中，本发明包括与本文公开的TIC807蛋白结合的抗体(单克隆或多克隆)的用途。用于制备和分析抗体的方法是本领域公知的(见,例如,UsingAntibodies:ALaboratoryManual:ColdSpringHarborLaboratory,1999)。产生单克隆抗体(mAbs)的方法通常从与制备多克隆抗体相同的品系开始。简言之，通过用根据本发明的免疫原性组合物对动物免疫，制备多克隆抗体，从经免疫的动物收集抗血清。可使用宽范围的动物物种来生产抗血清。典型地，用于生产抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和山羊。因为兔有相对较大的血液体积，兔是生产多克隆抗体的优选选择。如本领域公知的，给定的组合物的免疫原性可有所变化。因此通常必须要对宿主免疫系统进行强化，这可通过将肽或肽免疫原与载剂偶联来实现。示例性的优选载剂是钥孔戚血蓝蛋白(KLH)和牛血清清蛋白(BSA)。其它清蛋白，例如，卵清蛋白、小鼠血清清蛋白或兔血清清蛋白也可用作为载剂。用于将肽、多肽或蛋白与载剂蛋白缀合的手段是本领域公知的，其包括使用戊二^、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双耦氮(biazotized)联苯胺。还如本领域公知的，可使用免疫应答的非特异性刺激剂(已知作为佐剂)，来增强特定免疫原组合的免疫原性。示例性和优选的佐剂包括完全Freimd，s佐剂(免疫应答的非特异性刺激剂，含有杀死的c"6erci/7cc、)、不完全Freund，s佐剂和氛氧4b钻佐剂。用于生产多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质和用于免疫的动物而改变。可使用多种途径来施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可通过免疫之后在多个点从经免疫的动物采血样，来监测多克隆抗体的生产。还可给予笫二次、强化注射。重复强化和滴定的过程，直到获得合适的效价。当获得想要的免疫原性水平时，对经免疫的动物放血，分离血清并贮藏，和/或动物可用于产生mAbs。可使用公知技术，容易地制备单克隆抗体(mAbs)，例如美国专利No.4，196，265中示例的那些。典型地，该技术包括用选用的免疫原组合物(例如，经纯化或部分纯化的抗真菌蛋白、多肽或肽)对合适的动物加以免疫。免疫组合物可以以能有效刺激产生抗体的细胞的方式施用。啮齿类(例如小鼠和大鼠)是优选的动物，但是，也可使用兔、绵羊和青蛙细胞。使用大鼠可提供某些好处，但是小鼠是优选的，其中BALB/c小鼠是最优选的，因为其最常使用，并且通常提供较高的稳定融合比例。本发明还包括遗传免疫方法，以获得与本文公开的TIC807蛋白结合的单克隆或多克隆抗体。在这些方法中，将编码TIC807蛋白的基因与在哺乳动物细胞中有活性的启动子可操作相连。然后，将包含哺乳动物细胞表达盒(包含TIC807编码蛋白)的经分离的质粒DNA直接注射进动物，诱发对编码的TIC807蛋白的免疫应答。可用作为用于遗传免疫的注射宿主的动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、山羊、牛或马。虽然可使用多种注射方案，但是一种典型的方法将包括以大约100ug/注射/动物(即，针对小鼠、大鼠或兔)的剂量，注射溶于经磷酸盐緩冲的盐水或其它合适的緩沖液中的质粒DNA(浓度为大约l-2mg质粒DNA/ml)。每只动物中，可以以2周的间隔进行大约3-4次注射。ChambersandJohnston，NatureBiotechnol.(21):1088，2003中对遗传免疫进行了描述。协议研究机构还进行了遗传免疫实验，以获得抗体(QEDBioscienceInc.，SanDiego,CA,USA)。可用于遗传免疫的有用的哺乳动物表达盒的例子包括但不限于pRc/RSV载体(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA),或pcDNA3.1载体(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)，其提供了CMV启动子，用于表达可操作相连的基因。当高水平的抗原表达是细胞毒性时，可使用较弱的启动子，例如SV40启动子，来表达抗原。预计，天然TIC807基因(SEQIDNO:4)或合成TIC807基因(SEQIDNO:6)可与在哺乳动物细胞中有活性的启动子和聚腺苷化元件可操作地相连，以获得适于遗传免疫的质粒。但是，本发明还包括通过将TIC807氨基酸序列(SEQIDNO:5)翻译回去，来设计和合成用于在哺乳动物宿主中表达的其它TIC807编码序列。本发明还包括下述哺乳动物表达载体，所述载体还包含信号肽序列，所述序列提供可操作相连的编码TIC807蛋白的序列的跨膜插入和/或细胞外分泌。XV.TIC807蛋白筛选和检测试剂盒本发明包括下述方法和试剂盒，用于篩选可能含有TIC807蛋白或TIC807相关多肽或生产此类多肽的细胞的样品。在本文包括的一些特定实施方式中，所述方法和试剂盒检测TIC807蛋白。试剂盒可含有一种或多种本发明的抗体，并且还可含有用于检测本发明的抗体和样品之间的相互作用的试剂。提供的试剂可以是经放射性标记、分光光度标记、荧光标记或醉促标记的。提供的试剂可包括底物，所述底物可转化为可通过分光光度法、发光测量或荧光检测的产物。试剂盒还可含有已知的经放射标记或半抗原标记的、能与本发明的抗体结合或相互作用的试剂。试剂盒的试剂可作为液体溶液、与固体支持物相连的形式或者作为干燥粉末提供。优选地，当试剂以液体溶液的形式提供时，液体溶液是水性溶液。优选地，当提供的试剂与固体支持物相连时，固体支持物可以是色镨介质、具有多种孔的测试板或显微镜玻片。当提供的试剂是干燥粉末时，可通过加入合适的溶剂(可被提供)来重构该粉末。在又一些实施方式中，本发明涉及免疫检测方法和相关试剂盒。提出，可利用本发明的TIC807蛋白或肽，来检测与其有反应性的抗体，或者，可利用按照本发明制备的抗体来检测TIC807蛋白或含有TIC80775蛋白相关表位的肽。通常，这些方法将包括首先，获得可能含有此类蛋白、肽或抗体的样品，将样品与根据本发明的抗体或肽相接触(根据可能的情况，在能有效令免疫复合体形成的条件下)，以及然后检测免疫复合体的存在。通常，对免疫复合体形成的检验是本领域中相当公知的，这可通过应用多种手段来实现。例如，本发明包括应用ELISA、RIA、免疫印迹(点印迹)、间接免疫荧光技术等。通常，将通过使用标记，例如放射性标记或酶标签(例如，碱性磷酸酶、马辣根过氧化物酶等)来检测免疫复合体的形成。当然，技术人员可发现使用二级结合配体(例如二抗)或生物素/亲和素配体结合安排的优点，这是本领域已知的。对于检验目的而言，我们提出，可利用可能包含想要检测的TIC807蛋白或肽或TIC807蛋白相关肽或抗体的基本上任何样品。本发明中，此类实施方式可应用对抗原或抗体样品的滴定中、对杂交瘤的选择中，等等。在一些相关实施方式中，本发明包括对可用于检测TIC807蛋白或相关肽和/或抗体是否存在样品中的试剂盒的制备。样品可包括可能含有TIC807蛋白或肽的细胞、细胞上清液、细胞悬浮液、细胞提取物、酶级分、蛋白提取物或其它不含细胞的组合物。一般而言，根据本发明的试剂盒将包括合适的TIC807蛋白、肽或针对此类蛋白或肽的抗体，以及，用于检测抗体/抗原复合体的免疫检测试剂、使用这些材料的指导和容纳抗体或抗原和试剂的设备。典型地，免疫检测试剂将包含与抗体或抗原相连的标记或与二级结合配体相连的标记。示例性的配体可包括具有相连标记的二抗(针对一抗)或抗原或生物素或亲和素(或链亲和素)。当然，如上文所述，本领域已知大量的示例性标记，所有这些标记都可用于本发明。容器将通常包括瓶(vial),其中可放置抗体、抗原或检验试剂，并且其优选是被合适地小份试样化的。本发明的实际盒还将典型地包括装纳抗体、抗原和试剂容器的设备，其处于密封，以用于商业销售。此类容器可包括注塑或吹塑成型容器，其中装有想要的瓶。由前文可看出，已实现并获得了本发明的若干优点。本丈中对实施方式的选择和描述仅仅是为了最好地解释本发明的宗旨及其时间应用，由此使得本领域其他技术人员能够在多种实施方式中最好地利用本发明，对特定用途而言可进行多种改良。实施例下文公开的实施方式仅仅是本发明代表性的，其可以多种形式实现。因此，本文公开的特定结构和功能细节不应被解释为限制。实施例1:鉴定"s"."m/力z;r/，'e腦V菌林EG2934本实施例描述了Aac277"ir^z/r2'/^7e"5^菌才朱EG2934和源于该菌抹的晶体蛋白。""///mMwW/^/e/^/s菌林公知具有生产伴胞晶体的能力，伴胞晶体中含有针对鳞翅目、鞘翅目和双翅目昆虫物种的多样杀昆虫活性的蛋白。当通过相差显微观察时，这些伴胞晶体展示出多种几何形状，它们被描述为不规则、立方形、棒状、偏菱形、双锥形等。展示出鳞翅目毒性活性的AM"W/^/e/7i"/》菌林看起来比展示出针对其它昆虫物种的A^訂//^/6/^/5菌抹更常见。展示出双锥形的伴胞晶体通常与鳞翅目毒性的A/^wr/z^/e/^/,分离林相关。当篩选未经分析的及MwW力口'ei^/s菌林时，这种与鳞翅目活性的双锥形晶体结构-功能关系具有好处，其允许快速选择出可能展现针对并非鳞翅目物种的昆虫的杀昆虫活性的菌抹。基于此点，选择菌林EG2934，因为当通过相差显微镜观察时，其含有缺乏双锥形结构的良好建构的晶体。为确定该菌林生产的何种晶体蛋白具有杀昆虫活性，克隆了编码这些蛋白的基因，并在经良好分析的无毒且无晶体突变型的及f力i;W/7g/ei^/s宿主菌林中将其表达。在及^ur//7g/e/7(sr/<y菌抹EG2934产生的晶体制备物中，鉴定出了大小范围为大约35千道尔顿(kDa)至大约120kDa的四种晶体蛋白。作为常规篩选，用这些蛋白进行针对已知植物有害昆虫的毒性测试。发现，命名为TIC807的来自及^r//^ye/^"菌林EG2934的一种蛋白对刺吸式昆虫丄/^/s77/e,尸erz/s和Zt^ws//刀eo7a了/s有毒'1"生。实施例2:表征A^^r/z^7e/7Ws菌抹EG2934产生的晶体蛋白本实施例阐述了对从及MuW/^/ms/s菌林EG2934分离的晶体蛋白的表征以及随后对A)^^活性毒素蛋白TIC807的初始表征。在C2芽胞形成培养基(Donovanetal.，Mol.Gen.Gent.214:365-372，1988)中，25至28摄氏度下，对及MwW"^7e7^/s菌4朱EG2934培养3至4天，或者直到芽胞完全形成，并裂解。通过离心来收集芽胞和晶体，将其重新悬浮于洗涤緩沖液(lOmMTris-HCl,0.1mMrEDTA，0.005%TritonX-100,pH6.8)中，并通过离心再次收集。将芽胞-晶体沉淀团重新悬浮于最初培养体积1/10的洗涂緩冲液中。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分析1OX浓缩物中的晶体蛋白。使用牛血清清蛋白(BSA)作为标准，通过密度测量，来测定蛋白浓度。芽胞形成后，及^wr/z^2'ei7W、菌林EG2934产生大约120、110、65和35千道尔顿(kDA)的晶体蛋白。通过SDS-PAGE分辨来自EG2934的蛋白。电泳之后，按照标准western杂交印迹流程，将蛋白转移到PVDF膜(BioRad,Hercules，CA)上。转移后，使用标准的自动Edman降解流程，对与每张膜结合的蛋白进行N-末端测序。TIC807的N-末端氨基酸序列示为SEQIDN0:1。在可获得的公众数据库中查询，没有鉴定出与该序列的明显匹配，这表示TIC807蛋白可能是新颖的。基于氨基酸序列SEQIDN0:1设计了两条简并寡核苷酸引物，它们被称为djc-prl2(SEQIDNO:2)和djc-prl13(SEQIDNO:3),以用作为分离编码TIC807蛋白和TIC807同源体的B.thuringiensis基因的杂交探针。实施例3:分离和分析从AM"W/^/e/zs/s菌才朱EG2934分离的TIC807本实施例阐释了对含有编码TIC807蛋白的DNA的噬菌体克隆的筛选。还描述了对编码TIC807蛋白的DNA的克隆和测序。下文所述的方法还可用于回收源于其它AMwW/^/e/^"菌才朱的质粒、粘粒或噬菌体文库中编码TIC807同源体的DNA序列和相关基因。用实施例2描述寡核苷酸引物djc-prl2和djc-prl3(分别是SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)作为杂交探针，以探测使用经尺寸选择的DM(分离自AW"W/^/e/^/s菌林EG2934)构建的文库。在SEQIDNO:2(AAYGCDATHAAYTAYTGGGGDCCDAARAAY)和SEQIDNO:3(TGGGGDCCDAARAAYAAYAAYGARATWCAR)的简并寡核普酸中，Y残基代表C或T残基的混合物，D残基代表A、G或T残基的混合物，H残基代表A、C或T残基的混合物，R残基代表A或G残基的混合物，W残基代表A或T残基的混合物。使用其中利用了CTAB提取步骤的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology(1997)JohnWileyandSons,Inc.),制备及^w"'i^/e/^/s菌才朱EG2934的总DNA。用限制性酶&w3AI(典型用于制备基因组文库的4碱基切割酶)没能切动该DNA。令人吃惊地，对DNA甲基化敏感的Aw3AI同裂酶对基因組DNA进行高效消化。在1%琼脂糖IXTBE凝胶上对经消化的DNA进行大小分级分离。使用标准方案从凝胶切片提取7-12kb的片段，将其连接进经BamHI消化的X-ZapExpress载体，并使用GigaPackIIIGold试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)包装进喧菌体颗粒。噬菌体扩增后，进行平板转染，用DuralonUV尼龙膜(Stratagene，LaJolla，CA)进行噬菌斑转印。在标准预杂交/杂交緩冲液(含有5XSSC、0.1%N-月桂酰肌氨酸、0.02%SDS、1%封闭试剂(Roche,Indianapolis,IN，Cat.No.1585762)、0.1mg/mLpoly—A和4ug/mLpoly-dA)中，于50摄氏度下，对膜孵育数小时。使用末端转移酶DIG-11-dUTP(DIG寡核苷酸加尾试剂盒；Roche，Indianapolis,IN,Cat.No.1417231)和厂商推荐的方案，用地高辛(DIG)在3，末端对寡核苷酸进行标记。加入经DIG标记的寡核苷酸djc-prl2和djc-prl3的1:1混合物，在50摄氏度对膜孵育过夜。在室温下，于3XSSC、0.1%SDS下对膜进行两次洗涤，每次15分钟，然后在50摄氏度下，在1XSSC、0.1%SDS中冲洗两次，每次"分钟。使用Roche(Indianapolis,IN)洗涤和封闭緩沖液组合和方案(Roche，Indianapolis,IN，Cat.No.11585762001)、抗DIG-碱性磷酸酶Fab片段(Roche,Indianapolis,IN,Cat.No.11093274910)和底物CSPD(3-(4-甲氧基螺甾{1,2-二氧环丁烷-3，2-(5-氯)三环[3.3.1.13，7]癸}-4-基)苯基磷酸二钠)(Roche，Indianapolis,IN),通过化学发光，观察杂交的噬菌斑。从初级板中捡出n个重组克隆，稀释、涂板并用经DIG标记的寡核苷酸进行再次探测。获得纯的克隆仅需要两轮涂板/探测。所有12个噬菌体克隆都经历了切割反应，产生了12个噬粒克隆。用6WI和对它们加以消化，释放出克隆的插入。在1°/。琼脂糖IXTBE凝胶上分辨消化物，将其印到Nytran⑧膜上，用于Southern分析。插入的大小要比预想的小得多，大小在2-5kb之间的范围内。但是，Southern分析证实12个克隆中有9个存在杂交DNA。使用简并寡核苷酸djc-prl2和djc-prl3和针对插入侧翼的载体序列特异的引物的組合，进行热扩增反应，以在噬粒克隆上对TIC807编码区域的位置加以图镨定位。基于这些结果，确定，整条基因存在于命名为pIC17039至pICl7042的四个不同的噬粒克隆上。表2中显示了对应于这些噬粒克隆中每种的插入大小和菌林鉴定。表2:含有TIC807噬粒的i^c力er/c力/aco//菌抹和相关插入大小菌林喧粒估计的插入大小(千碱基)SIC8087pIC170392.3SIC8088pIC170403.5SIC8089pIC170415.5SIC8090pIC170421.5对质粒pIC17042上的TIC807基因插入进行测序。推测的编码区域(示为SEQIDNO:4)编码309个氨基酸的蛋白，该蛋白示为SEQIDNO:5。对非重复蛋白数据库进行BlastP(版本2.2.9)检索，揭示TIC807蛋白序列与及/^訂//7#/6/^2、晶体蛋白Cryl5Aal(SEQIDNO:41)最匹配。对两条蛋白的Needleman—Wunsch总体比对显示，TIC807蛋白序列和Cryl5Aal蛋白序列之间有25.5%的序列同一性。图1展示了对TIC807(SEQIDNO:5)和Cryl5Aa(SEQIDNO:41)的比对。虽然TIC807和Cryl5Aal蛋白并不高度保守，但蛋白的局部区域在长度多至7个残基的连续氨基酸序列的短基序上显示出完全序列保守性。带有载体pIC17040的^c力eric力/aco7/菌林SIC8088于2007年3月16日被保藏于Peoria,Illinois的AgriculturalResearchCultureCollection,NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRL)，保藏号为No.NRRLB-50030。实施例4:在无毒素的及Mw/i7g/e7w/s宿主菌才朱中表达TIC807本实施例阐释了将TIC807编码区域克隆进质粒以在无毒素的A^wW/^/e"Ws宿主菌林中表达的过程。本实施例还阐释了下述工艺，通过该工艺，可以纯粹针对有害昆虫的生物检验的纯度，来生产蛋白毒素，例如TIC807。用限制性核酸内切酶和J肌I消化TIC807质粒pIC17040和pIC17041(表1)，在1XTBE中的1%琼脂糖凝胶上进行电泳。琼脂糖凝胶电泳之后，按照厂商方案，使用Qiagen(Valencia,CA)DNA纯化试剂盒对得到的单DNA片段加以纯化。类似地，用限制性核酸内切酶和J鹏I消化五.AMw//^/e/^2、穿梭载体pEG854(Baumetal.1990),琼脂糖凝胶电泳之后，纯化大约4.3千碱基的DNA片段，其中含有Bt质粒复制起点ori43和氯霉素乙酰转移酶(cat)基因。将TIC807基因片段与ori43-cat基因片段连接起来，产生了能在AMi/i7/^/ei^/s中复制的质粒。通过电穿孔，用连接产净勿将无曰曰曰体缺卩各型(acrystalliferous)(Cry—)6勺及tAi/r/ag/e/^/s宿主菌林EG10650转化为氯霉素抗性，产生了重组A"wr/i^/e7^"分离林SIC8091、SIC8092、SIC8093和SIC8094,如表3所示。表3:含有用于TIC807表达的质粒的及"wri/^/e/^"菌林<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>在C2培养基中，25至28摄氏度下，对重组菌抹培养3至4天，或者直到芽胞完全形成，并裂解。通过离心(例如4000xg下30分钟)来收集芽胞和晶体，将其重新悬浮于洗涤緩沖液(lOmMTris-HC1，0.1mMEDTA,0.005%TritonX-100,pH6.8)中，并通过离心再次收集。将芽胞-晶体沉淀团重新悬浮于最初培养体积1/10的洗涤緩沖液中。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分析10XC2浓缩物中存在的晶体蛋白。所有四种重组菌林都产生了具有大约35kDa的预期表观分子量的晶体蛋白。使用牛血清清蛋白(BSA)作为标准，通过密度测量，来测定蛋白浓度。实施食寸5:TIC807对Zj^y/s力es/7e/7Ay和Z/^ws7//7eo/ar/s有毒性本实施例阐释了进食检验，以确定TIC807蛋白分子对西部牧草盲蝽(WTPB)Lygushesperus和牧草盲蝽(TPB)Lygusli腳laris有毒性。WTPB和TPB是食叶类刺吸式昆虫，它们攻击多种杂草和作物。WTPB和TPB通过直接进食损害来损害农业作物(包括棉花)。因为WTPB和TPB通过刺吸进食，用于测试针对该类昆虫的蛋白毒素的检验应当允许昆虫的天然进食行为。所使用的进食检验基于96孔板形式和袋系统，如Habibietal.(ArchivesofInsectBiochem.andPhys.50:62-74(2002))所述。人工膳食由Bio-Serv(Bio-ServDietF9644B,Frer^town,NJ)提供，其组分展示于表4中。表4:Bio—ServF9644BWTPB人工膳食<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>将518毫升经高压灭菌的沸水与156.3克Bio-ServDietF9644B在经表面灭菌的掺合仪中合并。打开四个经表面灭菌的鸡蛋，将内容物加入到含有膳食混合物的掺合仪中。对混合物加以掺合，直到光滑，对其调节至l升的体积，令其冷却。通过将TIC807毒素蛋白制备物以想要的浓度与相当体积的掺合膳食混合物，来制备毒素样品。大约-20亳米汞柱的真空(足以将Parafilr^推向孔)下，将一片Parafilm(PechineyPlasticPacking,Chicago,IL)》文至)J96孑L真空岐管(AnalyticalResearchSystems,Gainesville,)上。向Parafiln^孔中加入40微升测试样品。然后将一片Mylar膜(ClearLamPackaging,Inc.,ElkGroveVillage,IL)放到Parafilm⑧上，用电燹器(BienfangSealectorII,HuntCorporation，PhiladelphiaPA)轻柔密封。然后将Paranim⑧袋放到平底96孔板上，该板含有悬浮于琼脂糖中的At^a卵。孵化后，A^^蛹将通过刺穿它们上方存在的袋来进食。不被理论束縛的情况下，我们相信，袋中的口外消化可导致蛋白水解和降解(昆虫摄入之前)。为确保蛋白在昆虫膳食中完整呈现，每两天换一次膳食袋。这种增强理论上允许进食检验期间完整毒素蛋白更长时间地存在于昆虫膳食中。此外，鉴于为补偿可能的口外消化效果不需要更大量的蛋白，可对较低浓度的可能毒素蛋白进行测试。第2天和第4天更换昆虫膳食袋。第5天测定发育迟緩和死亡率计分，并将其与未经处理的检查(UTC)相比较。表5到表8阐释了TIC807对西部牧草盲蝽(WTPB)Aj^m力e^er^和牧草盲蝽(TPB)Z/^as7/"eo7ar/s的毒性。膳食并非对于TPB最优，相对于针对WTPB的UTC而言，UTC(未经处理的检查)中膳食降低了蛹的生长速率。但是，针对TPB展示了显著的死亡率和发育迟緩。表5:针对西部牧草盲蝽(WTPB)Zj^m力e^er^的TIC807发育迟緩计分处理浓度(mg/ml)N平均发育迟緩标准偏差P>|t|UTC0.00120.000.00TIC8071.0051.600.55<0.0001表6:针对西部牧草盲蝽(WTPB)Ap^m力e^er^的TIC807百分比死亡率计分<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>表7:针对牧草盲蝽(TPB)Af^/s///eo/ar"的TICS(H发育迟緩计分_<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>实施例6:合成编码设计来在植物中表达的TCI807蛋白的基因设计并合成编码TIC807蛋白的基因。设计来在植物中表达的该非天然编码区域在本文中作为SEQIDNO:6提供。编码序列的特征在于A+T的含量要HS源于^^r/agie/^is的天然TIC807编石马区域更低，去除了天然TIC807基因的富含A+T的区域，用具有更少A+T残基的序列来代替它们。实施例7:用于在转基因植物细胞或转基因植物中表达TIC807蛋白的表达盒用非天然TIC807编码区域(SEQIDNO:6)构建了多种植物表达盒。此类表达盒可用于在植物原生质体或植物细胞中的瞬时转化。第一TIC807植物表达盒包含增强的CaMV35S启动子，其与包含非天然TIC807编码序列的编码区域可操作相连，所述编码序列具有与myc-蛋白表位标签(SEQIDNO:19)的以符合读码框的方式的C-末端融合。该编码区域与3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺香化位点可操作相连。该非靶向并且标签化的5，-e35S-TIC807-myc-NOS-3，表达盒的序列作为(SEQIDNO:20)提供，其被克隆于pMON59221中。完整的5，-e35S-TIC807-myc-N0S-3，表达盒被含在pM0N59221穿梭载体的#0^/限制性片段上。第二TIC807植物表达盒包含增强的CaMV35S启动子，其与包含N-末端^raW化/^2:Mi^叶绿体肽编码序列(即CTP2)的编码区域可操作相连，所述叶绿体肽编码序列与非天然TIC807编码序列以符合读码框的方式融合，所述非天然TIC807编码序列具有与myc-蛋白表位标签(SEQIDNO:21)的以符合读码框的方式的C-末端融合。该编码区域与3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺苷化位点可操作相连。该被靶向并且标签化的e35S-CTP2-TIC807-myc-NOS表达盒的序列作为(SEQIDNO:22)提供，其被克隆于pMON59223中。完整的5，-e35S-CTP2-TIC807-myc-NOS-3，表达盒被含在pMON59223穿梭载体的#0〃限制性片段上。第三TIC807植物表达盒包含增强的CaMV35S启动子，其与包含非天然TIC807编码序列(SBQIDNO:6)的编码区域可操作相连。该编码区域与3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺苷化位点可操作相连。该非革巴向的TIC807表达盒的序列作为(SEQIDNO:40)提供，其被克隆于pMON59224中。完整的5，-e35S-TIC807-N0S-3，表达盒被含在pMON59224穿梭栽体的vYW/限制性片段上。第四TIC807植物表达盒包含增强的CaMV35S启动子，其与包含N-末端^ra6/^;^h叶绿体肽编码序列(即CTP2)的编码区域可操作相连，所述叶绿体肽编码序列与非天然TIC807编码序列(SEQIDNO:7)以符合读码框的方式融合。该构建体编码的CTP2-TIC807融合蛋白的肽序列作为SEQIDNO:8提供。该编码区域与3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺苷化位点可操作相连。该被靶向的5'-e35S-CTP2-TIC807-NOS-3，表达盒的序列作为(SEQIDNO:23)提供，其被克隆于pM0N59222中。完整的5，-e35S_CTP2-TIC807-NOS-3，表达盒被含在pMON59222穿梭载体的#0纟/限制性片段上。第五耙向质体的表达盒包含增强的CaMVMS启动子，其与源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻译引导序列可操作地相连，所述引导序列与包含N-末端ArabidopsisshkG叶绿体肽编码序列(即CTP2)的编码区域可操作相连，所述叶绿体肽编码序列与非天然TIC807编码序列(SEQIDNO:6)以符合读码框的方式融合。该构建体编码的CTP2-TIC807融合蛋白的肽序列作为SEQIDNO:8提供。该编码区域与3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺苷化位点可操作相连。该被靼向的5，-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-N0S-3，表达盒的序列作为(SEQIDNO:42)提供。第六表达盒包含增强的CaMV35S启动子，其与源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻译引导序列可操作地相连，所述引导序列与包含非天然TIC807编码序列(SEQIDNO:6)的编码区域可操作地相连。该构建体编码的TIC807蛋白的肽序列作为SEQIDNO:5提供。该编码区域与3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺苷化位点可操作相连。该5，-e35S-Hspl7.9-TIC807-NOS-3，表达盒的序列作为SEQIDNO:43提供。实施例8:构建含有TIC807表达盒的^^ro&c"ri咖介导的转化载体并转入"r。6a"e,2'咖为构建v^ro&WeW咖介导的转化载体，将TIC807表达盒在J^ro6sc"W咖边界序列之间克隆进合适的栽体，使得它们将通过含有构建的载体的J^ro6acfer/咖宿主与可选择标志物基因一起转入宿主植物细胞的基因组中。更特别地，将含有完整5，-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-N0S-3，表达盒(SEQIDNO:42)的限制性片段克隆进^^ro6a〃eW咖植物转化载体。类似地，含有完整5，-e35S-Hspl7.9-TIC807-NOS-3，表达盒(SEQIDNO:43)的限制性片段净皮克隆进^^Y&crer/M7植物转化载体。通过电穿孔或通过三亲杂交，将含有TIC807表达盒(即，SEQIDNO:43的非靶向盒和SEQIDNO:42的靶向盒)的载体引入^"&c"了y咖。实施例9:用TIC807J^ro6ac&W咖转化载体转化棉花可使用与美国专利No.5,159,135所述基本相似的流程，用物来转化棉花。'、*5为启动用于棉花植物的转化和再生过程，首先必须要对棉花种子进行表面灭菌，以防止对得到的培养物的疏忽性污染。然后令种子在合适的发芽培养基(含有杀真菌剂)上发芽。发芽后4-6天，未成熟植物的下胚轴部分被移出，将其切成各平均大约O.5厘米的小块。令下胚轴外植体稳定，在液体或琼脂植物组织培养基上令其保持存活。下胚轴块一旦被稳定，可迅速用转化感受态非致癌性yigro6aCe,iw/z/的悬、浮培养净勿来接种它4门。可4吏用^g",o6aCer2'w范菌林，例如LBA4404。令接种过程在室温下，即，24摄氏度下，进行3至5天。在接种时期的末端，首先需要漂洗掉过多的」^ro6ac"i"2'咖。然后可将剩下的经处理的组织转到第二琼脂培养基上，其中含有对Agrobacterium有毒但对下胚轴组织无毒的一种或多种抗生素，其浓度足以杀死培养物中残留的任何Agrobacterium。用于此类培养基的合适的抗生素包括羧千青霉素和头孢噻肟。然后组织放置1至IO天的时间段，以从转化过程回收，然后再继续培养。现在在组织培养基上培养组织，所述培养基除了含有其正常组分之外，还含有选择试剂，选择试剂对未经转化的棉花细胞有毒性但是对已经具有了对选择试剂的抗性并且表达该抗性的经转化棉花细胞无毒。合适的组织培养基是其中加入了植物激素2,4二氯苯氧基乙酸(2-4，D)、6-糠氨基嘌呤和胶凝剂的MS培养基。合适的选择试剂包括抗生素和除草剂。可用作为显性可选择标志物的合适的抗生素性状包括氨基糖苷磷酸转移酶-3，-II(APH-(30-II)基因(其也被称为新霉素磷酸转移酶II基因(NPTII)，其编码针对抗生素卡纳霉素的抗性)和APH-(30-IV基因(其编码针对潮霉素B的抗性)。卡纳霉素、G418和潮霉素B是氨基糖苷，它们将停止未经转化的棉花细胞的生长，但是如果表达于经转化的细胞中的话，这些抗生素会被合适的酶磷酸化。另一合适的选择试剂是除草剂草甘膦，其可用于选择含有草甘膦抗性的EPSPS基因的经转化的棉花细胞。当使用pM0N105863和pMON105864时，针对对卡纳霉素或另一抗生素的抗性来选择经转化的植物细胞，所述另一抗生素与卡纳霉素密切相关，并且能被这些载体编码的新霉素鳞酸转移酶II基因(NPTII)失活。加入抗生素或除草剂的培养基仅允许经转化的细胞继续茁壮生长。因此，令经转化的细胞或愈伤組织在选^f性培养基上生长。将存活的经转化的组织转到笫二培养基中，以诱导体胚形成。存活的经转化组织将因此继续形成为体胚，然后其可通过本发明的再生技术或通过使用棉花体胚作为其起点的任何其它备选性的植物再生方案再生。选择过程将持续一段较长的时间，即，3-4个月，因为即使经转化的组织在抗生素培养基上生长也很緩慢。每4-6周进行一次移种，以更新营养物和抗生素。经转化的细胞被选择和扩增后，获得的各细胞系可被鉴定，并可移出并单独扩增。根据本发明的再生技术从由转化过程得到的组织开始。这些组织是可能经转化的愈伤组织，在合适的胚诱导培养基上培养时，它们能产生体胚。本文公开了用于将这些体胚再生为整抹植物的一种技术，但应当理解，一旦产生了经转化的胚形成组织，还可使用其它技术。申请人在此使用的再生技术因此是从由转化过程得到的组织开始的。将从棉花植物的下胚轴块产生并且可能经过转化的棉花愈伤组织直接放到体胚诱导培养基上。在该时间点，应当从培养基中移除抗生素选择试剂，不过培养基也可保持不变。在体胚诱导培养基上培养的这些愈伤组织将形成小的胚性结构，它们被命名为体胚。体胚出现和成熟可能需要长达2至3个月的时间。在体胚诱导培养基的琼脂配方中，从单个愈伤组织可能出现大约5个至多达20个体胚。将可根据本文所述的技术，将由此产生的很多体胚再生为整林植物。当发育中的体胚足够大(即，长度达到4mm或更大的大小)，并且看起来具有良好的胚发育(即，通常具有子叶和胚根)的情况下，可将它们转到大的试管中，并放到精细蛭石上。用Stewart和Hsu(SH)培养基(Planta137:113(1977))加植物激素吲哚乙酸、6-糠氨基噤呤和赤霉酸浸透蛭石。最终发育出具有2至3片叶的小的幼植物。一旦建立了幼植物生长，即，2-3片叶的阶段，现已可将植物移入具有蛭石土壤的植物罐。可按照需要对它们浇水和施肥。在暴露给温室前，它们还可能需要冷强化处理(hardenoff)。当幼植物具有4-6片叶时，可对幼植物移罐，之后它们将继续长到成熟。针对TIC807的表达，对来自幼植物的样品进行检验，以鉴定具有昆虫抑制活性的转基因植物。实施例11:在愈伤組织中对TIC807进行植物内测试本实施例阐释了TIC807植物内表达的非限制性例子，这用于针对Lygus和刺和/或吸来自植物细胞和组织的流体的其它有害昆虫的生物检验。用含有编码TIC807蛋白的感兴趣的基因的构建体转化棉花细胞。在这种情况下，使用前述实施例中描述的TIC807转化载体中的TIC807表达盒，在棉花细胞中表达编码TIC8(H蛋白的、非天然A+T富集的核酸序列。这些表达盒提供了TIC807向叶绿体的靶向(即，用5，-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-N0S-3，或5，-e35S-CTP2-TIC807N0S-3，表达盒)或TIC807的非靶向的(胞质)表达(即，用5，-e35S-Hspl7.9-TIC807-NOS-3，或5，-e35S-TIC807-N0S-3，表达盒)。转化载体提供了可选择标志物，在这种情况下，用于选择转基因植物组织中的卡纳霉素抗性。可使用pMON10SS"载体或含有TICS0植物表达盒和可选择标志物的其它等同TIC807植物表达载体。在Petri皿中，转化和选择后，令愈伤组织在组织培养基中发育。然后将蛹放进含有经TIC807植物表达盒转化的愈伤组织的Petri皿或微滴定板的孔。还将A^M蛹放进含有未经TIC807植物表达盒转化的对照愈伤组织的Petri皿或微滴定板的孔。Petri亚和微滴定板的封闭盖防止了Z/^^蛹的逃逸。将防止Z/^/s逃逸但允许Petri皿中气体交换的任何材料，例如Parafilm⑧，可用于封闭Petri皿盖或微滴定板。一定百分比的Z/^/5"蛹将发现愈伤组织并进食。然后在考虑到背景死亡(没有在愈伤组织上进食的那些昆虫发生的)的情况下，计算死亡率和发育迟緩的计分。将呈现给经TIC807转化的组织的Z/^/s蛹的经修正计分与呈现给对照组织的A^7^蛹的经^，正计分相比较。呈现给经TIC807转化的组织的Ar^^蛹的死亡率和/或发育迟緩计分较之呈现给对照组织的A^"s蛹的计分显著增加。实施例12:在叶组织中对TIC807进行植物内测试使用前述实施例中描述的TIC807转化载体中的TIC807表达盒，转化紫花苜蓿、棉花、油菜、大豆或莴苣细胞。这些表达盒提供了TIC807向叶绿体的靶向(即，用5，-e35S-CTP2-TIC807-myc-N0S-3，或5，-e35S-CTP2-TIC807—N0S-3，表达盒)或TIC807的非靶向的(胞质)表达(即，用5，-e35S-TIC807-myc-N0S-3，或5，-e35S-TIC8Q7-NOS-3，表达盒)。转化载体提供了可选择标志物，在这种情况下，用于选择转基因植物组织中的卡纳霉素抗性。针对对卡纳霉素的抗性对经转化的细胞加以选择，并将其再生为转基因植物。然后，当植物达到足够的成熟水平，例如，当叶长到允许用物理障碍防止AF^/s逃逸的大小时，令有害昆虫(例如Z7^^蛹)进食。防止丄7g"s蛹逃逸的障碍可以是任何商业可获得的或自制的、允许Af^a蛹与叶组织接触并允许昆虫探测叶的维管组织并进食的设备。与M匿y(1993)(J.Agric.Entomol.10:181-184)所述类似的孩i虫笼(clipcages)将足以装纳丄/^^蛹以进食。然后将Zj^^蛹呈现给来自表达TIC807蛋白的转基因植物的叶组织或不表达TIC807蛋白的对照叶组织。理想地，对照叶组织是平行选择并再生的转基因植物，但其中不含编码TIC的转基因。但是，来自相似来源和年龄的其它植物的叶组织也可使用，只要组织不含显著量的TIC807蛋白即可。然后在考虑到背景死亡(没有在叶组织上进食的那些昆虫发生的)的情况下，测定死亡率和发育迟緩的计分。将呈现给经TIC807转化的叶组织的Z/《z^蛹的经修正计分与呈现给对照叶组织的A^^蛹的经修正计分相比较。呈现给经TIC807转化的叶组织的A^^蛹的死亡率和/或发育迟緩计分较之呈现给对照叶组织的Ar^/s蛹的计分显著增加。实施例13:使用tic807组合其它昆虫控制试剂进行昆虫控制已经获得了表达胞质TIC807蛋白或靶向TIC807蛋白的转基因棉花植物，还可能想要获得与TIC807组合表达其它昆虫抑制性蛋白的棉花植物。本实施例阐释了若干种方法，通过它们可实现对特定有害昆虫的增加的抗性或者更广的对若干类的有害昆虫的抗性，以为作物植物提供更好的昆虫保护。下文描述的所有策略也可用于增强昆虫抗性管理程序。I)在植物中组合TIC807与昆虫抑制性dsRNAi分子可将双链RNA介导的对靶标有害昆虫中生物功能的基因阻遏与编码TIC807蛋白的基因组合。可被dsRNAi靶向的执行关键生物功能的昆虫基因如美国专利申请公开文本No.US2006/0021087所述。可令此类dsRMi分子抑制丄/^/s(与TIC807所抑制的相同的靶标昆虫)。通过同时用dsRNAi和TIC807抑制Zj^m，经由两种不同的作用模式达成抑制。通过不同的作用模式实现的抑制预计导致改进的昆虫抗性管理。为控制A^ws,dsRNAi分子源于SEQIDNO:4至seqidno:39(对应于Af^/s中表达的基因)中的任何一条。在对昆虫的控制中使用SEQIDNO:24至SEQIDNO:39在美国专利申请公开文本No.US2006/0021087有所/>开。在经J^ro^c^eW咖介导的转化载体(设计来表达dsRNAi分子的)转化的转基因棉花植物中，表达针对SEQIDNO:24至SEQIDNO:39中任何一条的dsRNAi分子。通过回收下述转基因植物，来达成dsRNAi分子的表达，所述转基因植物包含在这些植物中有活性的启动子，其与长度为至少19-24个核苷酸的A^m序列(即SEQIDNO:24至SEQIDNO:39)片段和这些序列的反向互补序列可操作地相连。还可令这些dsRNAi分子针对其它刺吸式昆虫，例如，蜂虫、跳虫或粉虱。为控制蚜虫，在经J^ro&c&Ww迈介导的转化载体(设计来表达dsRMi分子的)转化的转基因棉花植物中，表达源于或同源于来自美国专利申请7^开文本No.2006/0021087中的7bzc7^ersc/"yc/da或爿c7r^ow';力o/7/j^w/b的序歹廿的dsRNAi分子。为4空制逸^转化的转基因棉花植物中，表达源于或同源于来自专利申请公开文本No.U.S.2006/0021087中的^鹏7ocT/"acoagu7We的序列的dsRNAi分子。为控制粉虱，可在经J^ro6ac"r/m介导的转化载体(设计来表达dsRNAi分子的)转化的转基因棉花植物中，表达合适的dsRNAi分子。通过回收下述转基因植物，来达成dsRNAi分子的表达，所述转基因植物包含在这些植物中有活性的启动子，其与长度为至少19-24个核苷酸的各虫牙虫、跳虫或粉虱的序列片段和这些序列的反向互补序列可操作地相连。此类dsRNAi分子还可针对鞘翅目害虫。在这种情况下，将dsRMi分子与TIC807组合表达在转基因植物中提供了对鞘翅目害虫和双翅目害虫两者的控制。为控制棉籽象鼻虫^^力o/7咖ws^ra"c^、Boheinan，在经J^ro^c,"2'咖介导的转化载体(设计来表达dsRNAi分子的)转化的转基因棉花植物中，表达源于美国专利申请公开文本No.2006/0021087中所述的V-ATP酶A直向同源体序列的dsRNAi分子。通过回收下述转基因植物，来达成dsRNAi分子的表达，所述转基因植物包含在这些植物中有活性的启动子，其与长度为至少19-24个核苷酸的棉籽象鼻虫V-ATP酶A片段和这些序列的反向互补序列可操作地相连。此类dsRNAi分子还可针对鳞翅目害虫。在这种情况下，将dsRNAi分子与TIC807组合表达在转基因植物中提供了对鳞翅目害虫和双翅目害虫两者的控制。为控制夜盗蛾，在经^^ro&cfer/咖介导的转化载体(设计来表达dsRNAi分子的)转化的转基因棉花植物中，表达源93于中肠表达的夜盗蛾序列(即，来自美国专利申请公开文本No.2006/0021087的Ae7/c，ai7s/,s序歹'j)的dsRNAi分子。通过回收下述转基因植物，来达成dsRNAi分子的表达，所述转基因植物包含在这些植物中有活性的启动子，其与长度为至少19-24个核苷酸的夜盗蛾片段和这些序列的反向互补序列可操作地相连。I)在植物中组合TIC807与并非TIC807的昆虫抑制性蛋白为控制刺吸式昆虫，例如，蚜虫、跳虫、Ar^/s或粉虱，可在植物中将若干毒素分子与TIC807组合表达，以获得更好的控制。在植物中与TIC807—起表达的此类分子可包括i)ET29、ET37或TIC809和TIC810、TIC812、TIC127或TIC128(PCTUS2006/033867;美国专利No.6，093,695);ii)AXMI-027、AXMI-036和/或AXMI-038(W006/107761);Hi)AXMI-018、AXMI-020和/或AXMI-021(WO06/083891);iv)AXMI-010(WO05/038032);v)AXMI-003(WO05/021585);vi)AXMI-008(US2004/0250311);vii)AXMI-006(US2004/0216186);viii)AXMI-007(US2004/0210965);ix)AXMI-009(US2004/0210964);x)AXMI-014(US2004/0197917);xi)AXMI-004(US2004/0197916);xii)AXMI-028和/或AXMI-029(WO06/119457)和xiii)AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004(WO04/074462)。毒性蛋白分子TIC809(示为SEQIDNO:10)和TIC81Q(示为SEQIDNO:12)的组合以前已在生物检验中显示出能抑制西部牧草盲蝽(WTPB)A^us力e^7erwsKnight(PCTUS2006/033867)。TIC809和TIC810的融合蛋白TIC127(示为SEQIDNO:14)和TIC128(示为SEQIDNO:16)也可对A^^有活性。编码TIC127的多核苷酸包含编码TIC809的核酸分子，该分子与编码TIC810的核酸分子通过多接头核苷酸序列(示为SEQIDNO:17，编码SEQIDNO:18中示出的氨基酸接头)相连。编码TIC128的多核苷酸包含编码TIC810的核酸分子，该分子与编码TIC809的核苷酸分子通过多接头核苷酸序列(示为SEQIDNO:17,编码SEQIDNO:18中示出的氨基酸接头)相连。TIC807与TIC12794或TIC128的组合表达可提供对Z/^/s的增强的控制。可用下述植物表达构建体来转化双子叶植物，例如，棉花，所述构建体含有经双子叶植物优化的、编码TIC807(示为SEQIDNO:6)的核苷酸序列以及TIC809(示为SEQIDNO:9)和TIC810(示为SEQIDNO:11),或TIC127(示为SEQIDNO:13)或TIC128(示为SEQIDNO:15)，以提供对Z/^^的增强的抗性或者抑制Ar^a属内含有的其它物种。毒素分子的最优表达可能需要靶向表达，例如，靶向细胞的叶绿体。这可通过在编码毒素的核酸分子的5，末端添加本领域公知能将翻译的蛋白指导向细胞叶绿体的编码转运肽的核酸分子来实现。编码TIC807表达盒的DNA序列可与编码昆虫抑制性双链RNA和/或并非TIC807的昆虫抑制性蛋白分子的DNA序列中之一或两者组合。这些DNA分子可通过直接转化或育种或其组合来组合，以产生显示出对Ar^/s增强的抗性的良种或杂交品系。一种或多种杀昆虫蛋白与一种或多种双链RNA(都独立对半翅目害虫(例如A^m)有活性)的组合是优选的，因为其提供两种不同的作用模式(抗性管理)，导致产生意料不到的协同性效果，所述效果是单独使用杀昆虫蛋白、单独使用双链RNA、使用都针对半翅目害虫的两种不同的杀昆虫蛋白的组合或者使用都针对半翅目害虫的两种不同的dsRNA的组合时观察不到的。此外，4吏用昆虫毒素蛋白和双链RM分子两者在植物中的表达，作物植物的抗性镨可被拓宽，以除了对半翅目害虫(例如Af^/s)之外，还含有对其它类的有害昆虫(例如鞘翅目、鳞翅目或双翅目)的抗性。为在转基因植物中控制鳞翅目害虫和半翅目害虫，可获得表达TIC807蛋白和一种或多种针对鳞翅目害虫有活性的蛋白这两者的蛋白。获得表达鳞翅目活性蛋白的转基因植物的方法已被良好表征，所述蛋白例如CrylA蛋白(美国专利No.5880275)、CrylB(美国专利申请No.10/525318)、CrylC(美国专利No.6033874)、CrylF、CrylA/F嵌合蛋白(美国专利Nos.7070982、6962705和6713063)和Cry2Ab蛋白(美国专利No.7064249)。可通过将表达TIC807或95鳞翅目蛋白的各转基因植物杂交，来获得表达TIC807蛋白和鳞翅目活性蛋白两者的植物。备选地，可用提供TIC807或一种或多种鳞翅目活性蛋白两者的表达的植物转化载体来转化植物。实施例14:TIC807的经纯化晶体芽孢制备物对力e^erws的毒性还使用经纯化的晶体芽孢制备物，测试了TIC807对Z/^a力e^er^的毒性。通过蔗糖梯度离心，对含有TIC807蛋白的伴胞晶体进行了部分纯化。用Benzonase(Novagen;10U/ml样品)来处理TIC807蛋白的IOX浓缩的芽孢-晶体制备物，以降低样品粘度。令经处理的样品在4C过夜。在适于SW28转子的Ultraclear或Polyclear管中制备蔗糖梯度每级10mL的79%、70%和55%蔗糖(处于10mMTris-HC1、0.1mMEDTA、0.005%TritonX-100(pH7)中)。每个梯度上样大约6-7fflL样品(装到离管顶部1/4英寸)。在SW28转子中，4C下，以18K运行梯度并过夜(16-18小时)。从55-70%的界面或70-79%的界面获得晶体。在梯度緩冲液中对晶体进行至少5倍的稀释，通过离心(例如，4°C下8K进行20分钟)来沉淀。将晶体沉淀团重新悬浮于緩沖液中，在相差显微镜下检查，以评估芽孢污染。随后用50mMCAPS-NaOH(pH11)来处理经纯化的晶体，在37C孵育，直到悬浮液澄清。将溶解的蛋白对25fflM碳酸钠、10mMNaCl(pH8.O)渗析，上样到用同样緩沖液平衡过的Q-Sepharose柱上，用线性10mM-500mMNaCl梯度洗脱。将洗脱的蛋白对25raM碳酸钠(pH8.5)渗析。通过SDS-PAGE分析，蛋白被评定为高度纯化。在进食检验中观察到，较之未经处理的检查而言，该TIC807蛋白制备物导致A^^力e^en^蛹的显著死亡率和发育迟緩(质量降低)，这展示于下表9和10中。表9:TIC807针对西部牧草盲蝽(WTPB)Af^/sAe^eTT^的发育迟緩计分<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>在用丄j^M7eo7aWs进行的进食检验中获得了相似的结杲。实施例15:合成编码TIC807蛋白的其它基因(设计来用于在植物中表达的)设计并合成编码TIC807蛋白的其它核苷酸序列。设计来在植物中表达的这些非天然编码区域在本文中作为SEQIDNO:44至SEQIDNO:53提供。示为SEQIDNO:44至SEQIDNO:53的编码序列的特征在于A+T的含量要比源于万a"77MMtfWi^/e/^/s的天然TIC807编码区域更低，去除了天然TIC807基因的富含A+T的区域，用具有更少A+T残基的序列来代替它们。SEQIDNO:44是其中启动甲硫氨酸的起始密码子从细菌起始密码子"TTG"变为植物起始密码子"ATG"的天然TIC807编码区域。实施例16:用于在转基因细胞或转基因植物中表达TIC807蛋白的其它表达盒笫七靼向质体的表达盒包含增强的CaMV35S启动子，其与源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻译引导序列可操作地相连，所述引导序列与包含N-末端ArabidopsisshkG叶绿体肽编码序列(即CTP2)的编码区域可操作相连，所述叶绿体肽编码序列与非天然TIC807编码序列(SEQIDNO:6)以符合读码框的方式融合。该构建体编码的CTP2-TIC807融合蛋白的肽序列作为SEQIDNO:8提供。该编码区域与3，末端CaMV35S聚腺苷化位点(T-35S)可操作相连。该被靼向的5，-e35S-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表达盒的序列作为SEQIDNO:54提供。第八表达盒包含增强的CaMV35S启动子，其与源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻译引导序列可操作地相连，所述引导序列与包含非天然TIC807编码序列(SEQIDNO:6)的编码区域可操作相连。该构建体编码的TIC807蛋白的肽序列作为SEQIDNO:5提供。该编码区域与3，末端CaMV35S聚腺苷化位点可操作相连。该5，-e35S-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表达盒的序列作为SEQIDNO:55提供。第九乾向质体的表达盒包含SugarcaneBad證irus(ScBV)启动子(美国专利5,994,123),其与源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻译引导序列可操作地相连，所述引导序列与包含N-末端ArabidopsisshkG叶绿体肽编码序列(即CTP2)的编码区域可操作相连，所述叶绿体肽编码序列与非天然TIC807编码序列(SEQIDNO:6)以符合读码框的方式融合。该构建体编码的CTP2-TIC807融合蛋白的肽序列作为SEQIDNO:8提供。该编码区域与3，末端CaMV35S聚腺苷化位点可操作相连。该被靼向的5，-P-ScBV-Hsp17.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表达盒的序列作为SEQIDNO:56提供。第十表达盒包含SugarcaneBadnavirus(ScBV)启动子，其与源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻译引导序列可操作地相连，所述引导序列与包含非天然TIC807编码序列(SEQIDNO:6)的编码区域可操作相连。该构建体编码的TIC807蛋白的肽序列作为SEQIDNO:5提供。该编码区域与3，末端CaMV35S聚腺苷化位点可操作相连。该5，-P-ScBV-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表达盒的序列作为SEQIDNO:57提供。实施例17:构建含有TIC807表达盒的其它J^r"ac&r/M介导的转化载体并转入y^ro^3"er/腿为构建J^ro6ac"r/咖介导的转化载体，将TIC807表达盒在J^ro^c"r/咖边界序列之间克隆进合适的载体，使得它们将通过含有构建的载体的J^r^ac^W咖宿主与可选择标志物基因一起转入宿主植物细胞的基因组中。更特别地，将含有完整5，-e35S-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表达盒(SEQIDNO:54)的限制性片段克隆进J^ro6ac^er/咖植物转化载体，获得pMON105863(图2)。类似地，含有完整5'-e35S-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表达盒(SEQIDNO:55)的限制性片段被克隆进J^ro6acfer/咖植物转化载体，获得pM0Nl05864(图3)。为使用不同的启动子表达，将含有完整5，-P-ScBV-Hsp17.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表达盒(SEQIDNO:56)的限制性片段克隆进J^^6ac"r2'咖植物转化载体，获得pMON78892(图4)。类似地，含有完整5，-P-ScBV-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表达盒(SEQIDNO:57)的限制性片段被克隆进」^ro&c&W咖植物转化载体，获得pMON78893(图5)。通过电穿孔或通过三亲杂交，将含有TIC807表达盒(即，SEQIDNO:55和SEQIDNO:57的非靶向盒和SEQIDNO:54和SEQIDNO:56的耙向盒)的载体引入^ro6a"eri亂双元植物转化载体含有可选择标志物(在图2至5中表示为"可选择标志物")，用于使用抗生素卡纳霉素来选择经转化的植物细胞。使用壮观霉素的抗生素选择被用于细菌选择。这在图2至5中表示为"SPC/STR"，这包括针对Tn7腺苷转移酶的启动子、针对编码源于S帥力W,c面麼面的3"(9)-Q-氨基糖苷腺苷转移酶(AAD)的基因的编码区域和来自Tn7腺苷转移酶的转录终止子区域，其赋予壮观霉素和链霉素抗性。每个质粒中包括两个细菌复制起点，用于^^ro6acfer/"范f"/ge/a".e/s复制的起点(在图2至5中表示为"Ec.oriV-RK2")和用于在^yc力eWc力2'aco7/中复制的起点(在图2至5中表示为"Ori-322")。编码与及co//复制起点组合使用的遏制子引物的fsc力er/c力/a编码区域在图2至5中表示为"Ec.rop"。用于T-DNA稳定整合进植物基因组的左右边界在图2至5中被分别表示为"LB，，和"RB"。图5还显示了使用的另一种表达盒，其中，TIC128毒素蛋白(PCTUS2Q06/Q33867)被表达并被标记，见图5中的"TIC128表达盒"。实施例18:在愈伤组织中对TIC807的其它植物内测试本实施例阐释了TIC807植物内表达的非限制性例子，这用于针对Lygus和刺和/或吸来自植物细胞和组织的流体的其它有害昆虫的生物检验。使用前述实施例中描述的TIC807转化载体中的TIC807表达盒，转化紫花苜蓿、棉花、油菜、大豆或玉米细胞。这些表达盒提供了TIC807向叶绿体的靶向(即，用5，-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807T-35S-3'或5，-P-ScBV-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表达盒)或TIC807的非靶向的(胞质)表达(即，用5，一e35S—Hspl7.9-TIC807-T—35S-3，或5，-P-ScBV-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表达盒)。转化载体提供了可选择标志物，在这种情况下，用于选择转基因植物组织中的卡纳霉素抗性。针对对卡纳霉素的抗性对经转化的细胞加以选择，并将其再生为转基因植物。然后，当植物达到足够的成熟水平，例如，当叶长到允许用物理障碍防止A^"s逃逸的大小时，令有害昆虫(例如A^ws蛹)进食。防止Zj^/s蛹逃逸的障碍可以是任何商业可获得的或自制的、允许Z/gm蛹与叶组织接触并允许昆虫探测叶的维管组织并进食的设备。与Mowry(1993)(J.Agric.Entomol.10:181-184)所述类似的微虫笼(clipcages)将足以装纳A^"s蛹以进食。然后将4^^蛹呈现给来自表达TIC807蛋白的转基因植物的叶组织或不表达TIC807蛋白的对照叶组织。理想地，对照叶组织是平行选择并再生的转基因植物，但其中不舍编码TIC的转基因。但是，来自相似来源和年龄的其它植物的叶组织也可使用，只要组织不含显著量的TIC807蛋白即可。然后在考虑到背景死亡(没有在叶组织上进食的那些昆虫发生的)的情况下，测定死亡率和发育迟緩的计分。将呈现给经TIC807转化的叶组织的A^^蛹的经f^正计分与呈现给对照叶组织的Ar^a9蛹的经修正计分相比较。呈现给经TIC807转化的叶组织的A^m蛹的死亡率和/或发育迟緩计分较之呈现给对照叶组织的蛹的计分显著增加。实施例19:在莴苣叶组织中对TIC807进行植物内测试使用前述实施例中描述的TIC807转化载体中的TIC807表达盒，转化莴苣细胞。这些表达盒提供了TIC807向叶绿体的靶向(即，用5，-e35S-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，或5，-P-ScBV-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表达盒)或TIC807的非覃巴向的(胞质)表达(即，用5，-e35S-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3，或5，-P-ScBV-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3，表达盒)。转化载体提供了可选择标志物，在这种情况下，用于选择转基因植物组织中的卡纳霉素抗性。针对对卡纳霉素的抗性对经转化的细胞加以选择，并将其再生为转基因植物。在1.2%次氯酸钠溶液中对莴苣种子进行20分钟的表面灭菌，接着在经灭菌的去离子水中洗3次。在层流罩中，令种子在Petri皿中干燥过夜。然后将种子以60个种子/盘的密度铺到phytatray(Sigma，St.Louis，MO,目录号P1552)中的100ml0.5XHoagland，s盐(见下表ll)上。种子在22至23摄氏度下、光照下被培养4-5天，光周期为16小时。通过用IOO微升细菌悬浮液接种10ml液体甘露糖醇-谷氨酸/Luria培养基，制备经感兴趣的植物转化载体转化的爿^r由"er/咖。培养基包含下述成分LB培养基，Miller(Difco#044-017-3)12.5g甘露糖醇5.0gKH2P040.25gMgS047H200.10g生物素0.001g总体积1000mlpH至7.00并高压灭菌在28摄氏度，旋转摇床上，对液体培养物进行24小时的孵育。用15ml补充有40mg/L乙酰丁香酮的胰蛋白胨酵母提取物培养基(5g胰蛋白胨、3g酵母提取物和20ml2mg/mL的乙酰丁香酮，总体积为1000ml，pH5.5并高压灭菌)来稀释5ml的首次过夜培养物。然后在黑暗下，用50mg/L的卡纳霉素和100mg/L壮观霉素，在28摄氏度，旋转摇床上，对其进行24小时的孵育。将1ml过夜培养物加入到19ml胰蛋白胨酵母提取物培养基中，将培养物的600nm波长光密度调节为0.08至0.09。在底部和顶端切下莴苣幼苗的子叶，将其在经稀释的Agrobacterium培养基中浸泡15分钟。然后把子叶放到没有blotting的MSO-C培养基上，以16小时的光周期保持于22至23摄氏度。用微孔带密封平板。48小时后，将子叶转至100mmX25mmPetri亚中的MSO-1培养基。随后在7和14天将外植体移种至MS0-I培养基。随着嫩枝发育，切下来并转至MS0-SE培养基。嫩枝延长后，将其转至含有IOOmlMSO-SEQ培养基的phytatray。6至8周后，将发育的嫩枝转至含有100mlMSO-R培养基的Magenta盒中，在23摄氏度孵育7至14天，根开始发育。然后将嫩枝转至含有土壤的3英寸罐，令其生长。MS0培养基的组成示于表11中。表ll:MS0培养基组分成分0.5XHoagland's盐MSO-CMSO-IMSO-SEMSO-RMSO盐(最小限度的盐)3"g34.6g3"g化6gHoagland's盐0.8g萘乙酸(1mg/ml)0.1ml0.1ml0.05ml<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807--T-35S-3,(SEQIDNO:54))来转化莴苣植物。使用载体对照(其中仅含用于转化的选择盒)来转化莴苣的对照系。从经转化的植物产生Fl种子。从F1种子培育植物，并取样用于TIC807蛋白的表达。使用标准ELISA方法和TIC807多克隆抗体，针对F1后代，测定蛋白表达水平。基于TIC807蛋白表达水平，选择植物用于A^"s力e^ei""W则试。从选择的Fl后代取叶样品，使用实施例18所述的检验方法，针对4r^s力e^er^毒性加以测试。表12中展示了来自选择的转基因莴苣品系的数据。品系事件A028和A055明显要比对照(即，未经转化的莴苣品系SVR3606)表现更好。对表达TIC807蛋白的品系的总体分析展示了较之经对照转化的植物而言显著的死亡率。表12:侵害后6天，15只侵害的幼嫩蛹(n=16)在经TIC807转化的莴苣叶上的Zj^m力e"er^死亡率百分比的均值土标准误差<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>实施例21:TIC807对马铃薯曱虫(ColoradoPotatoBeetle)有毒性本实施例阐释了昆虫毒素分子TIC807对鞘翅目的马铃薯甲虫(CPB)Z一/刀o&渭d/e固"細^的毒性。j吏用人工膳食(由13.2g/L琼脂(Serva11393)、140.3g/LBio-Serve预混合物(Bio-Serve，Frenchtown,NJCatalog#F9380B)、5ml/L氢氧化钾(18.3%w/w)和1.25ml/L福尔马林(37%)构成)，进行CPB生物检验。将膳食分发至96孔板中的200微升小份试样中，在样品应用之前筒单干燥。每个孔应用20微升测试样品，用灭菌水作为未经处理的检查(UTC)。在加入昆虫幼虫之前，令板干燥。用细毛刷向每个孔中加入1只新生幼虫(CPB)。用聚脂薄膜密封板，用昆虫针(insectpin)通风。每种处理测试40只幼虫。将生物检验板在27摄氏度、60%的相对湿度下、完全黑暗下孵育10-12天。针对幼虫死亡率对板计分。使用JMP4统计软件(SASInstitute,Cary，NC)来分析数据。喂给CPB时，TIC807展示出死亡率。表13显示了TIC807的平均百分比死亡率。因此，本发明的TIC807蛋白可用于控制鞘翅目昆虫。受本发明的TIC807蛋白控制的鞘翅目昆虫包括但不限于马铃薯甲虫、金针虫和棉籽象鼻虫。表13:TIC807针对马铃薯曱虫(CPBUe;〃刀o^a"ac/ece/z〃/2ea"的百分比死亡率计分<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>实施例22:用TIC807转化棉花，使用整林棉花植物进行毒素测试使用含有编码TIC807蛋白的感兴趣的基因的构建体转化棉花细胞。在这种情况下，使用前述实施例中描述的TIC807转化载体中的TIC807表达盒，在棉花细胞中表达编码TIC807蛋白的、经密码子再设计的核酸序列。这些表达盒提供了TIC807蛋白向叶绿体的靶向(即，用pMON105863中发现的5，-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-T-35S-3'或pMON78892中发现的5，-P-ScBV-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T—35S-3，表达盒)或TIC807的非靶向的(胞质)表达(即，用pMON105864中发现的5，-e35S-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3，或pMON78893中发现的5，-P-ScBV-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表达盒)。转化载体提供了可选择标志物，在这种情况下，用于选择转基因植物组织中的卡纳霉素抗性。可使用pMONl05863载体(图2)、pMONl05864载体(图3)或pMON78892载体(图4)或pMON78893载体(图5)或含有TIC807植物表达盒和可选择标志物的其它等同TIC807植物表达载体。可使用封闭的棉花枝检验来在表达TIC807毒素分子的植物上进行生物检验。将棉花植物培养至早期开花阶段，此时可获得若干含有蕾(square)(即，未成熟的棉花的花)的结果枝。使用透气性塑料膜(VilutisandCo.Inc.,Frankfort,IU制备套管。使用标准摄影或美术以及手工电烫器制造套管，以产生接缝，生产具有5英寸X5英寸X12英寸长的大致尺寸的口袋。将包括至少一个预开花的蕾和未巻曲的末端叶的末端枝插入进套管的开口端。备选地，如果需要的话，可用口袋装棉桃或其它组织。使用扎带(twisttie)在枝的周围密封口袋。想要的被封起来的组织下面的叶和蕾可被除去，以协助确保更靠近扎带。套管的另一端保持开放，以允许昆虫侵害。用抽吸器收集Lygus蛹，将4只蛹放进2打兰壳瓶(shellvial)中。针对含有蛹的每只瓶记录蛹的初始质量。轻柔盖上管，以确保蛹处于管的底部，除去管的盖子。将管放在套管内，将蛹暴露给棉花植物组织。然后用扎带封闭套管的开放端。令昆虫留在套管内，并在封闭的棉花植物材料上进食指定的天数。指定时间后，除去棉花枝。小心打开套管，对存活的蛹加以计数。收集所有的蛹并称重。然后参考未经转化的对照植物，测定死亡率和发育迟緩的计分。将呈现给经TIC807转化的棉花組织的AF^^蛹的经修正计分与呈现给缺乏TIC807蛋白的对照棉花组织的Ar^^蛹的经修正计分相比较。呈现给经TIC807转化的棉花组织的蛹的死亡率和/或发育迟緩计分较之呈现给对照棉花组织的A^7/s蛹的计分显著增加。实施例23:组合TIC807毒素和无蜜腺棉花本实施例阐释了使用无蜜腺棉花表型组合TIC807蛋白表达，以提供更好的对有害昆虫的控制。蜜腺缺乏已被鉴定为是"^/p/咖"/ze/^os咖中两个重复基因座的隐性突变的纯合性导致的(MeyerandMeyer,1961，CropScience,1:167169)。在笼实验中，用"鏡，.i/迈力/rswfu/H与Cc^s7pi"迈fo/se/^c^w/z7杂交展示出粉纟文夜蛾(cabbagelooper)和棉树叶虫(cottonleafworms)种群的显著降低(相对于其中存在花蜜腺的普通棉花品种而言)(LukefahrandRhyne，1960,Econ.Entomol.53:242-244)。这假设是无蜜腺棉花品系对有害昆虫来说较不美味以及缺乏蜜腺提供的食物的直接结果。在Gossypieae的物种中，多种抗性机制可能特别关键，因为花外蜜腺可直接吸引一些食草类的物种。培养的棉花中，花外蜜腺可增强若干作物害虫(包括鳞翅目和盲墙)的丰度或损害(Trelease，1879,Nectar;whatitis，andsomeofitsuses.InJ.H.Comstock[ed.],Reportuponcottoninsects,319-343.U.S.DepartmentofAgriculturePublication,U.S.GovernmentPublicationOffice,Washington,D.C.，亂UkefahrandRhyne，1960;Lukefahretal.,1960，JournalofEconEntom53:516—518;BenschoterandLeal,1974，JournalofEconEntom67:217-218;Schusteretal.,1976，JournalofEconEntom69:400-402;WilsonandWilson,1976,JournalofEconEntom69:623-624;He麵berryetal.,1977，JournalofEconEntom70:797-799;Adjei-Maafoetal.,1983，EnvironEntom12:353358;Beachetal.，1985，JournalofEntomologicalScience20:233-236;Smith,1992，AdvancesinAgronomy48:251-296;SummyandKing,1992，CropProtection11:307-319)，主要是因为这些分类的成年害虫能消耗花外蜜腺。针对无蜜腺表型和有好处的农业性状的存在，对通过《.力/"Wz/范与f咖eWo;咖杂交生产的品系加以选择。在其它一些实施方式中，从商业种质Stoneville825获得的品系可用作为包含无蜜腺表型的种质的来源。在该方法的一种实施方式中，用编码TIC807蛋白、TIC809/TIC810蛋白、TIC128蛋白或其组合或针对棉花害虫(其中，蜜腺的存在该有害昆虫作用为引诱剂)的任何其它毒素分子的表达盒，来转化选用的无蜜腺品系。在该方法的另一实施方式中，在任何合适的棉花种质中，获得包含编码TIC807蛋白、TIC809/TIC810蛋白、TIC128蛋白或其组合或针对棉花害虫(其中，蜜腺的存在该有害昆虫作用为引诱剂)的任何其它毒素分子的表达盒的转基因插入，并将该种质渗入进通过".力/rsWwz7与&M迈e"杂交产生的品系(已针对无蜜腺表型和有好处的农业性状的存在选择过)。通过本领域普通技术人员已知的育种方法，选择表达无蜜腺表型的转化子品系，并将其保持于含有无蜜腺表型和昆虫毒素分子两者的后续世代中。实施例24:对TIC807和Cry51Aa蛋白加以比较为鉴定TIC807(SEQIDNO:5)和Cry51Aa(SEQIDNO:59)的保守和非保守区域，使用ClustalW对两种蛋白进行比对。从Bt菌林F14-l分离Cry51Aa蛋白，其具报道称与cryl5Aa具有22%的同一性，并且还报道称，其具有针对/poW(鳞翅目昆虫)的活性(H磁getal.，J.Invertebr.Pathol.95(3)，175-180，2007)。cry51Aal基因(SEQIDNO:58)和编码的Cry51Aal蛋白(SEQIDNO:59)的序列作为NCBIGenBank检录号DQ836184一皮才艮道。对TIC807(SEQIDNO:5)和Cry51Aal进行的ClustalW比较显示，两种蛋白在301个氨基酸的长度上具有大约97.4%的序列同一性(见图6和表端，其对应于可^的^TG起始密码子的使用，这将产生309个氨基酸的一级翻译产物。而相反，基于通过Edman降解测定的经分离TIC807蛋白的N-末端肽序列，TIC807蛋白具有截然不同的氨基末端(见实施例2和SEQIDNO:1)。显然地，SEQIDNO:4的TTG起始曱疏氨酸密码子被用于产生SEQIDNO:5的TIC807蛋白。由此，报道的Cry51Aal蛋白在其N-末端包含额外的三个氨基酸，而这是TIC807(SEQIDNO:5)中没有出现的。在Cry51Aal中，对应于TIC807的苯丙氨酸46的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基，对应于TIC807的酪氨酸54的氨基酸残基被取代为组氨酸残基，对应于TIC807的丝氨酸167的氨基酸残基被取代为精氨酸残基，对应于TIC807的组氨酸199至丝氨酸201的三(3)个氨基酸残基缺失，对应于TIC807的丝氨酸217的氨基酸残基被取代为天冬酰胺残基。图6显示了对TIC807和Cry51Aal蛋白的这种比较。<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>虽然TIC807蛋白与Cry51Aal蛋白共享显著的序列同一性，但是当喂铜给某些鳞翅目昆虫时，TIC807蛋白令人吃惊地没有展示出显著的活性水平。4十对欧洲玉米螟(ECB;^y"/力j'a"z^/7ahY)和烟音虫(TBW:#e//o^ysr/resce/"对经纯化TIC807蛋白进行了测试，它们对这些鳞翅目昆虫没有活性。而同样的TIC807样品展示出对马铃薯曱虫CPB的活性，却对玉米根虫(CRW;"/a6ro〃cM)没有活性。因此，经纯化的TIC807对ECB和TBW不存在活性并非是由于经纯化TIC807蛋白失活。本发明因此包括对半翅目和鞘翅目昆虫有活性而对鳞翅目昆虫没有活性的TIC807蛋白。在某些实施方式中，本发明的TIC807蛋白可包含这样的TIC807蛋白，其中，TIC807蛋白的相应的笫54位残基并非组氨酸，其中，TIC807蛋白的相应的第167位残基并非精氨酸，其中，对应于TIC807的组氨酸199至丝氨酸201的三(3)个氨基酸残基存在，和/或TIC807的相应的残基217并非天冬酰胺残基。在又一些实施方式中，本发明的TIC807蛋白可包含这样的蛋白，所述蛋白在301个氨基酸的长度上，与SEQIDNO:5的第2至309位氨基酸残基对应，具有至少98%或至少99%的同一性。本文提到了若干专利和非专利公开文本，其中每篇的公开内容都通过引用整体以必要的程度并入本文。本文提到的从某些网址来自互联网的文献也通过引用整体并入本文。本文通过其"NCBI检录号"引用的某些生物序列可由ncbi.nlm.nih.gov从互联网上的NationalCenterofBiotechnologyInformation获得。在本文描述和阐释的构造和方法中，可进行多种改变，而不偏离本发明的范围，前述说明书和所附附图中含有的所有内容都应当被解释为阐释性的而非限制性的。因此，本发明的宽度和范围不应受到任何前述示例性实施方式的限制，而仅应按照所附权利要求及其等同体来界定。200880020577.1关于保藏的微生物的说明(PCT实施细则第13条之二)A.以下所作的说明涉及说明书第1页第21-25行所指的微生物。B.保藏物标识更多的保藏物标识见附页口保藏单位名称农业研究机构保藏中心(NR:RI,)保藏单位地址(包括邮政编码和国家)::1815N.UniversityStreetPeoria,U!inois61604U.S.A(美国)保藏日期2007年3月16闩保藏编号NRRLB-50030C.其它说明(如果不适用则留空)该信息续在附页上口D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)E.单独提交的说明(如果不适用则留空)以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如"保藏编号")本栏由受理局填写口本页和国际申请--起收到授权官员PCT/RO/134表本栏由国际局填写口国际局于以下n期收到本页:年月Fl授权官员国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约国际表格孟山都技术有限责任公司700ChesterfieldParkwayNorthChesterfield,MO63017美国<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>当适用第6.4(d)款时，该日期是取得国际保藏单位资格的日期在原始保藏情况下的收条，由本页下面所示的国际保藏单位根据第7.1款发给国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约国际表格孟山都技术有限责任公司存活报告书，由本页下面所示的国际保藏单位根据第10.2款发给700ChesterfieldParkwayNorthChesterfield,MO63017美国I.保藏人II.微生物的鉴别名称孟山都技术有限责任公司由国际保藏单位给予的登录号NRRLB-50030地址700ChesterfieldParkwayNorthChesterfield,MO63017(美国)原始保藏或转移的日期、2007-03-17III.存活报告书在上面II中鉴别的微生物的存活性于2004-02-092进行测试。在这一天，所述微生物(x)3存活()3不再存活IV.进行存活性测试的条件4V.国际保藏单位名称农业研究机构保藏中心(NRRL)有权代表本国际保藏单位的人员或者经授权的官员的签字地址1815N.UniversityStreetPeoriaIllinois61604U.S.A.日期2009-09-3指原始保藏日期；或者当进行重新保藏或移转时，指最近的相关日期(重新保藏日期或移转日期)。在第10.2(a)款第(ii)和(iii)项中所涉及的情况下，指最近的存活性测试。在合适的项目上打x号。如果要求这些信息和如果测试结果为阴性，请填写此项。权利要求1.经分离的多核苷酸，其编码TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段，其中，所述昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO5中含有的相应多肽序列具有至少大约70％序列同一性的多肽序列。2.权利要求1的经分离的多核苷酸，其中所述多肽序列与SEQIDNO:5中含有的所述相应多肽序列具有至少大约80%的序列同一性。3.权利要求2的经分离的多核苷酸，其中所述多肽序列与SEQIDNO:5中含有的所述相应多肽序列具有至少大约90%的序列同一性。4.权利要求3的经分离的多核苷酸，其中所述多肽序列与SEQIDNO:5中含有的所述相应多肽序列具有至少大约95°/。的序列同一性。5.权利要求4的经分离的多核苷酸，其中所述多肽序列与SEQIDNO:5中含有的所述相应多肽序列具有100%的序列同一性。6.权利要求5的经分离的多核苷酸，其中所述多肽序列是SEQIDNO:5。7.权利要求1的经分离的多核苷酸，其中所述TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段抑制半翅目昆虫、异翅目昆虫、丄ep〃/20&"a57.昆虫或同翅目昆虫。8.权利要求7的经分离的多核苷酸，其中所述半翅目昆虫是9.权利要求7的经分离的多核苷酸，其中所述同翅目昆虫是虫牙虫、跳虫或粉虱。10.权利要求8的经分离的多核苷酸，其中所述TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段在Z/^Ay膳食中以至少大约5ppm的所述TIC807蛋白或蛋白片段的A^m膳食浓度抑制Zj^m。11.权利要求10的经分离的多核苷酸，其中所述TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段在AFgM膳食中以至少大约50ppffl的所述TIC807蛋白或蛋白片段的ij^^膳食浓度抑制Zj^m。12.权利要求11的经分离的多核苷酸，其中所述TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段在丄/g^膳食中以至少大约250ppm的所述TIC807蛋白或蛋白片段的A7^aj膳食浓度抑制丄/^a。13.权利要求12的经分离的多核苷酸，其中所述TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段在膳食中以至少大约500ppm的所述TIC807蛋白或蛋白片段的A^^膳食浓度抑制A^m。14.权利要求1的经分离的多核苷酸，其中所述蛋白片段包含至少250个氨基酸残基的肽序列。15.权利要求1的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸在高度严紧条件下与SEQIDNO:4或SEQIDNO:6杂交。16.权利要求1的经分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52和SEQIDNO:53构成的组。17.权利要求1的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列被设计以在植物中表达。18.转基因植物或源于其的植物部分，其中包含TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段，其中，所述昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70%序列同一性的多肽序列。19.权利要求18的转基因植物或植物部分，其中所述植物或植物部分以下述浓度包含所述TIC807蛋白或蛋白片段，所述浓度为每克鲜重植物组织至少大约5iug所述TIC807蛋白或蛋白片段。20.权利要求19的转基因植物或植物部分，其中所述植物或植物部分以下述浓度包含所述TIC807蛋白或蛋白片段，所述浓度为每克鲜重植物组织至少大约50]ng所述TIC807蛋白或蛋白片段。21.权利要求20的转基因植物或植物部分，其中所述植物或植物部分以下述浓度包含所述TIC807蛋白或蛋白片段，所述浓度为每克鲜重植物组织至少大约250pg所述TIC807蛋白或蛋白片段。22.权利要求18的转基因植物或植物部分，其中所述植物部分是细胞、叶、茎、花、萼片、果、根或种子。23.包含下述多核苷酸的经转化的宿主细胞，其中所述多核苷酸编码TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段，其中，所述昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70°/。序列同一性的多肽序列。24.权利要求23的经转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞或植物细力包。25.权利要求24的经转化的宿主细胞，其中所述植物细胞选自大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、草皮草、甘蔗、小麦、紫花苜蓿、香蕉、花椰菜、豆、，巻心菜、油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芽菜、柑橘类、棉花、葫芦、桉树、亚麻、蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、杨树、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、番茄、装饰植物、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、稷、啤酒花和牧场草植物细胞构成的组。26.权利要求25的经转化的宿主细胞，其中所述植物细胞是棉花才直物细胞。27.源于权利要求24的所述经转化的植物宿主细胞的植物。28.从权利要求27所述的植物产生的种子。29.来自权利要求28所述的种子的后代植物。30.权利要求24的细菌细胞，其中所述细菌细胞选自i^To6acter/w/h、Jac/Ziw^^fsc力er2.c力/a、5^//zo/2e/7a、户sewcfo/zo/2ss和W力Wwz7细菌细胞构成的组。31.权利要求30的细菌细胞，其中所述细菌细胞是勘c/7/mf力wr/刀《ye/^/51纟田l包。32.控制A^^的方法，所述方法包括下述步骤(a)提供m抑制量的TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段，其中，所述昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中舍有的相应多肽序列具有至少大约70°/。序列同一性的多肽序列；以及(b)使所述与所述抑制量的所述多肽序列接触，由此控制Zj^ws昆虫。33.权利要求32的方法，其中所述多肽序列与SEQIDN0:5中含有的所述相应多肽序列具有至少大约90°/。的序列同一性。34.权利要求33的方法，其中所述多肽序列与SEQIDN0:5中含有的所述相应多肽序列具有100%的序列同一性。35.权利要求32的方法，其中在步骤(a)中于A^m膳食中提供所述Z/^Ay抑制量的所述多肽序列，并且在步骤(b)中可通过令所述丄j^M进食所述膳食来接触所述Af《"s。36.权利要求35的方法，其中所述A^M膳食是转基因植物。37.权利要求36的方法，其中所述多肽序列的所迷丄7^^抑制量为每克所述转基因植物鲜重组织至少大约5,g。38.权利要求37的方法，其中所述多肽序列的所述Z;^^抑制量为每克所述转基因植物鲜重组织至少大约50^g。39.权利要求38的方法，其中所述多肽序列的所述Zj^^抑制量为每克所述转基因植物鲜重組织至少大约250jig。40.权利要求32的方法，其中在步骤(a)中通过将包含所述多肽的组合物喷雾到植物上，提供所述AF^^抑制量的所述多肽序列。41.权利要求40的方法，其中所述组合物包含表达所述多肽的细菌细胞或细菌芽孢。42.权利要求41的方法，其中所述细菌细胞或细菌芽孢是^2C27/m细胞或^cy77zA芽孢。43.权利要求42的方法，其中所述组合物包含含有所述多肽的伴胞晶体。44.权利要求43的方法，其中所述植物被Z/^/s侵害。45.经分离的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:4中含有的或SEQIDNO:4的互补序列中含有的序列的至少12个连续核苷酸。46.经分离的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53中含有的或SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的互补序列中含有的序列的至少12个连续核苷酸。47.试剂盒，用于检测样品中的多核苷酸序列，所述试剂盒包含与SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SBQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的多核普酸序列或其互补序列特异性杂交的寡核苷酸和与所述寡核普酸杂交的对照多核苷酸。48.组合物，所述组合物包含至少两条至少12个核苷酸的简并寡核苷酸引物，其中，所述筒并寡核苷酸引物的核苷酸序列源于SEQIDNO:5的多肽序列。49.在样品中检测或分离编码TIC807蛋白或TIC807相关蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括下述步骤(a)选择能产生扩增子的简并寡核苷酸引物对，其中，所述简并寡核苷酸引物的核苷酸序列源于SEQIDNO:5的TIC807多肽序列；(b)从所述样品中的所述多核苷酸序列产生扩增子；以及(c)检测或分离所述扩增子，由此检测或分离样品中编码TIC807蛋白或TIC807相关蛋白的多核苷酸。50.权利要求49的方法，其中所述被检测或分离的扩增子编码与TIC807(SEQIDNO:5)具有至少45%的序列同一性的TIC807相关蛋白。51.权利要求50的方法，其中所述被检测或分离的扩增子编码与TIC807(SEQIDNO:5)具有至少70%的序列同一性的多肽。52.权利要求51的方法，其中所述被检测或分离的扩增子编码与TIC807(SEQIDNO:5)具有至少90%的序列同一性的多肽。53.在样品中检测或分离编码TIC807蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括下述步骤(a)选择简并寡核苷酸或简并寡核苷酸集，其中，所述简并寡核苷酸引物的核苷酸序列源于SEQIDNO:5的ITC807多肽序列；(b)将所述简并寡核苷酸或简并寡核苷酸集与所述样品杂交；(c)检测所述样品中与多核苷酸的杂交，由此检测样品中编码TIC807的多核普酸，以及(d)分离在步骤(c)中通过杂交检测到的多核苷酸。54.权利要求53的方法，其中所述被检测或分离的多核苷酸编码与TIC807(SEQIDNO:5)具有至少45%的序列同一性的多肽。55.权利要求54的方法，其中所述被检测或分离的多核苷酸编码与TIC807(SEQIDNO:5)具有至少70%的序列同一性的多肽。56.权利要求55的方法，其中所述被检测或分离的多核苷酸编码与TIC807(SEQIDNO:5)具有至少90%的序列同一性的多肽。57.在植物中表达TIC8(H蛋白的方法，所述方法包括下述步骤(a)向植物细胞基因组中插入以5，至3，的方向包含可操作相连的、重组双链DNA分子的核酸序列，其中，所述重组双链MA分子包含i.在所述植物细胞中发挥功能的启动子；ii.编码包含TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段的多肽的多核苷酸序列，其中所述昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70%序列同一性的多肽序列；以及iii.3，非翻译核苷酸序列，其在所述植物的细胞中发挥功能以导致转录终止和聚腺苷化，其中，所述启动子、所述多核苷酸序列和所述3，非翻译核苷酸序列可操作地相连；(b)获得含有步骤(a)的所述核酸序列的经转化的植物细胞，以及(c)从所述经转化的植物细胞再生表达所述TIC807蛋白的经转化的植物，由此在植物中表达TIC807蛋白。58.权利要求57的方法，其中步骤(a)的所述多核苷酸序列编码与SEQIDNO:5具有至少90%的序列同一性的TIC807蛋白。59.权利要求58的方法，其中步骤(a)的所述多核苷酸序列编码SEQIDNO:5。60.权利要求59的方法，其中编码TIC807蛋白的、步骤(a)的所述多核苷酸序列与编码质体靶向多肽的多核苷酸序列可操作地相连。61.权利要求60的方法，其中步骤(a)的所述多核苷酸序列编码SEQIDNO:8的多肽。62.重组DNA载体，用于在植物中表达TIC807蛋白，所述载体以5，至3，的方向包含i.在植物细胞中发挥功能的启动子；ii.编码包含TIC807昆虫抑制性蛋白或源于其的昆虫抑制性蛋白片段的多肽的多核苷酸序列，其中所述昆虫抑制性蛋白或蛋白片段包含与SEQIDNO:5中含有的相应多肽序列具有至少大约70%序列同一性的多肽序列；以及iii.3，非翻译核苷酸序列，其在所述植物的细胞中发挥功能以导致聚腺普化，其中，所述启动子、所述多核苷酸序列和所述3，非翻译核苦酸序列可操作地相连。63.权利要求62的载体，其中所述多核苷酸序列编码与SEQIDNO:5具有至少90°/。的序列同一性的TIC8(H蛋白。64.权利要求63的载体，其中所述多核苷酸序列编码SEQIDNO:5的TIC807蛋白。65.权利要求64的载体，其中所述多核苷酸序列包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53。66.权利要求62的载体，其中编码TIC807蛋白的所述多核苷酸序列与编码质体乾向多肽的多核苷酸序列可操作地相连。67.权利要求66的载体，其中所述多核苷酸序列编码SEQIDNO:`8的多肽。68.权利要求67的载体，其中所述多核苷酸序列是SEQIDN0:7。69.权利要求68的载体，所述载体还包含编码可选择标志物基因的多核苷酸。70.权利要求69的载体，其中所述可选择标志物基因赋予对AMPA、莠去津、溴苯腈、茅草枯、麦草畏、草甘膦、潮霉素、甲氨蝶呤、新霉素、草铵膦、磺酰脲或2，4-D和其组合的抗性。71.从植物或种子生产的商品，其中，所述商品含有可检测到的量的TIC807蛋白或编码TIC807蛋白的多核苷酸。72.权利要求71的商品，其中所述植物或种子是棉花植物或棉花植物种子。73.权利要求72的商品，其中商品是棉绒、油、粗粉或外壳。74.控制至少一种有害昆虫的方法，所述方法包括下述步骤(a)在组合物中提供至少两种不同的有害昆虫抑制性试剂，所述组合物包含i.昆虫抑制量的TIC807蛋白，和ii.昆虫抑制量的、被下述有害昆虫摄入后发挥功能以抑制所述有害昆虫内的生物学功能的至少一种核糖核苷酸序列，和/或iii.昆虫抑制量的并非TIC807蛋白的至少一种昆虫抑制性蛋白；和(b)令所述至少一种有害昆虫与抑制量的所述组合物接触，由此控制所述至少一种有害昆虫。75.权利要求74的方法，其中所述至少一种有害昆虫是半翅目昆虫、异翅目昆虫、Ze;〃/o"r^昆虫或同翅目昆虫。76.权利要求75的方法，其中所述半翅目昆虫是Z/^/s昆虫。77.权利要求75的方法，其中所述同翅目昆虫是奸虫、跳虫或粉虱。78.权利要求74的方法，其中(a)ii.中所述有害昆虫内的所述生物学功能是必要生物学功能。79.权利要求78的方法，其中所述必要生物学功能是所述有害昆虫的必要蛋白或核糖核酸提供的，其预测功能选自肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素调控，离子调控和运输，消化酶的合成，细胞膜势能保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素传感，触角形成，翅膀形成，腿形成、发育和分化，卵形成，幼虫成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神经传递，细胞分裂，能量代it,呼吸和凋亡构成的组。80.权利要求78的方法，其中所述必要生物学功能被下述核糖核苷酸序列抑制，所述核糖核苷酸序列包含展示出与选自SBQIDNO:24至SEQIDNO:39樹成的组的核苷酸编码序列大约80至大约100%序列同一性的大约21至大约5000个连续的核苷酸。81.权利要求74的方法，其中所述并非TIC807蛋白的一种昆虫抑制性蛋白源于5ac/7/z/s^i/i"2-"^7e/^/s。82.权利要求81的方法，其中所述昆虫抑制性蛋白选自AXMI-027、AXMI-036、AXMI-038、AXMI-018、AXMI-020、AXMI-021、AXMI-010、AXMI-003、AXMI-008、AXMI-006、AXMI-007、AXMI—009、AXMI-014、ET29、ET37、AXMI-004、AXMI-028、AXMI-029、AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127和TIC128构成的组。83.权利要求74的方法，其中所述组合物包含并非TIC807的两种昆虫抑制性蛋白，并且，其中，所述两种昆虫抑制性蛋白是TIC809和TIC810。84.权利要求74的方法，其中通过所述组合物控制第二有害昆虫。85.权利要求84的方法，其中所述第二有害昆虫被ii.中的所述核糖核苷酸序列或被iii.中的所述并非TIC807的蛋白抑制。86.权利要求85的方法，其中所述第二有害昆虫是鳞翅目有害昆虫。87.权利要求86的方法，其中所述第二有害昆虫被选自CrylA蛋白、CrylB蛋白、CrylC、CrylA/CrylF嵌合蛋白和Cry2Ab蛋白构成的组的蛋白抑制。88.权利要求74的方法，其中所述组合物提供了协同性的昆虫抑制效果。89.权利要求74的方法，其中所述组合物提供了加合性的昆虫抑制效果。90.权利要求74的方法，其中所述组合物是转基因植物。91.保护植物抵挡A^m侵害的方法，所述方法包括下述步骤在所述植物中表达Zj^m抑制量的至少两种不同的Z7《m抑制性试剂，其中，所述ArgM抑制性试剂包含(i)Ar^/s抑制量的TIC807蛋白；(ii)Z7^^抑制量的、并非TIC807蛋白的至少一种Ar^/s抑制性蛋白，和/或(iii)抑制量的至少一种核苷酸序列，其被所述Af^/s摄入后发挥功能以抑制所述AF^/s内的生物学功能，由此保护所述植物抵挡力j^m侵害。92.权利要求91的方法，其中ii.中所述内的所述生物学功能是必要生物学功能。93.权利要求92的方法，其中所述必要生物学功能是所述Ar^/s的必要蛋白或核糖核酸提供的，其预测功能选自肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素调控，离子调控和运输，消化酶的合成，细胞膜势能保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素传感，触角形成，翅膀形成，腿形成、发育和分化，卵形成，幼虫成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神经传递，细胞分裂，能量代谢，呼吸和凋亡构成的组。94.权利要求93的方法，其中所述必要生物学功能被下述核糖核苷酸序列抑制，所述核糖核苷酸序列包含展示出与选自SEQIDNO:24至SEQIDNO:39构成的组的核香酸编码序列大约80至大约100%序列同一性的大约21至大约5000个连续的核苷酸。95.权利要求91的方法，其中所述并非TIC807蛋白的Z/^/s抑制(性蛋白源、于Asei/ii^f力y/i"g/e刀51/^。96.权利要求95的方法，其中所述抑制性蛋白选自AXMI-027、AXMI-036、AXMI-038、AXMI-018、AXMI-020、AXMI-021、AXMI-010、AXMI-003、AXMI-008、AXMI-006、AXMI-007、AXMI-009、AXMI-014、ET29、ET37、AXMI-004、AXMI-028、AXMI-029、AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127和TIC128构成的组。97.权利要求91的方法，其中在所述植物中表达并非TIC807蛋白的两种A^m抑制性蛋白，所述两种Ar^/s抑制性蛋白包含TIC809和TIC810。98.权利要求91的方法，其中A^^抑制性试剂的所述表达提供了协同性的抑制效果。99.权利要求91的方法，其中A^^抑制性试剂的所述表达提供了加合性的A^m抑制效果。100.斗又利要>，91的方、法，其中戶斤述Z7《w^是A^"ws力es/ei7/s或101.经分离的蛋白，其中所述蛋白包含SEQIDNO:5中含有的、长度为至少9个氨基酸的多肽序列。102.权利要求101的经分离的蛋白，其中所述多肽序列长度为至少12个氨基酸。103.权利要求102的经分离的蛋白，其中所述多肽序列长度为至少16个氨基酸。104.权利要求103的经分离的蛋白，其中所述多肽序列长度为至少32个氨基酸。105.权利要求104的经分离的蛋白，其中所述多肽序列与SEQIDNO:5内含有的相应多肽序列具有至少大约80%的序列同一性。106.权利要求105的经分离的蛋白，其中所述多肽序列与SEQIDNO:5内含有的相应多肽序列具有至少大约90%的序列同一性。107.权利要求106的经分离的蛋白，其中所述多肽序列与SEQIDNO:5内含有的相应多肽序列具有至少大约95%的序列同一性。108.权利要求107的经分离的蛋白，其中所述蛋白是SEQIDNO:109.权利要求101的经分离的蛋白，其中所述蛋白还包含载剂蛋白。110.权利要求109的经分离的蛋白，其中所述载剂蛋白是清蛋白或KLH蛋白。111.权利要求101的经分离的蛋白，其中所述蛋白还包含选自指示剂、氨基酸间隔、氨基酸接头、信号序列、叶绿体转运肽序列、液泡靶向序列、停止转移序列、跨膜结构域、蛋白纯化配体或其组合构成的组的共价修饰。112.与TIC807蛋白或源于其的肽表位特异性结合的抗体，其中，所述蛋白或表位包含SEQIDNO:5的至少9个连续氨基酸。113.在样品中检测TIC807蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含a)与TIC807蛋白或源于其的肽表位特异性结合的抗体，所述蛋白或表位包含SEQIDNO:5的至少9个连续氨基酸；和b)对照TIC807蛋白或源于其的肽表位，所述蛋白或表位包含SEQIDNO:5的至少9个连续氨基酸。114.经分离的A"力er2'c力hcoh'菌4朱SIC8088，其带有载体pIC17040，并且包含编码TIC807的杀昆虫片段的核苷酸序列，所述菌林于2007年3月16日被保藏于AgriculturalResearchCultureCollection,NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRL),保藏号为No.NRRLB-50030。全文摘要本发明公开了展示出昆虫抑制活性的新颖的Bacillusthuringiensis晶体蛋白。通过在Lygus昆虫膳食中提供新颖的晶体蛋白，显著抑制了Lygus昆虫的生长。本发明还提供了编码晶体蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的转基因植物和微生物、源于所述晶体蛋白的经分离的肽以及针对所述晶体蛋白的抗体。本发明还公开了使用所述晶体蛋白和编码所述晶体蛋白的多核苷酸以控制半翅目昆虫的方法。文档编号A23J1/00GK101686705SQ200880020577公开日2010年3月31日申请日期2008年4月25日优先权日2007年4月27日发明者G·R·海克,J·鲍姆,S·R·佩恩,S·弗拉辛斯基,U·R·苏库鲁,石晓红申请人:孟山都技术有限责任公司