专利名称：在特定位置检测甲基化dna的方法
技术领域：
本发明涉及基因组DNA样品中甲基化核苷酸的鉴定。本发明还涉及通过鉴定特定的甲基化核苷酸诊断特定状况的方法。
背景技术：
人类DNA中5-甲基胞嘧啶(通常在CpG 二核苷酸上)的检测在诊断上非常重要，因为在此类胞嘧啶，特别是在基因控制序列(例如，启动子序列)上的此类胞嘧啶的甲基化通常与癌症的发作相关。这一所谓的DNA后生(因为其在通常意义上不是可遗传的)修饰对于发育也是非常重要的，并且通常导致基因沉默。在癌症中，该后生改变是异常的，并且可以导致涉及抑制肿瘤形成的基因的沉默，或涉及肿瘤发生的基因的活化。
当前广泛使用的检测此类DNA修饰的方法使用化学物质亚硫酸氢盐处理DNA，并且其具有就进行有效诊断分析而言的缺点。在它们当中，尤其是高复杂性、需要很长的时间、缺乏重复性以及待检测DNA的显著损失。此外，使用亚硫酸氢盐与在遗留PCR产物污染的控制中使用的尿嘧啶_n-糖基化酶是不相容的。需要有不具这些缺点的方法。
同时，还需要以高敏感度以及在相同、未修饰的DNA序列的高背景水平的存在下检测此类DNA修饰的方法。在肿瘤中，并不是所有的细胞均含有在感兴趣的序列上甲基化的DNA——实际上，大多数细胞都没有。此外，在应用散布的肿瘤细胞或在血流中能找到的肿瘤DNA进行癌症早期检测的情况下，大多数DNA在感兴趣的序列上没有甲基化。最多仅有很少百分比的序列拷贝可能是甲基化的。此类序列的浓度可能是每毫升样品体积中少于1个拷贝。在检测中对于高敏感性和高特异性的需求是明显的且通过之前的方法是难以获得的。 发明简述 本发明涉及检测位于样品中特定位置的甲基化DNA的方法，其包括(a)用甲基活性切割方法处理样品，所述甲基活性切割方法在位于样品中特定位置的甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA ; (b)添加与在或接近该特定位置的DNA互补的引物；(c)使该样品进行聚合酶链式反应，并且当在该样品的特定位置存在甲基化DNA时产生扩增产物；以及(d)检测扩增产物的存在，表明在该样品的特定位置存在甲基化DNA。 根据本发明优选的是检测位于样品中特定位置的甲基化DNA的方法，其包括(a)
用甲基活性切割方法处理样品，所述甲基活性切割方法在位于样品中特定位置的甲基化
DNA的存在下在一致位点导致碱基切除；(b)改变在该切割或碱基切除位点上的DNA序列；
(c)添加与在或接近该特定位置的DNA互补的引物和/或探针，并且它们至少之一能特异性
地识别所述经改变的DNA序列；(d)使该样品进行聚合酶链式反应，并且当在该样品的特定
位置存在甲基化DNA时产生扩增产物和/或探针信号；以及(e)当特异性地产生扩增产物
或探针信号时，检测扩增产物的存在，表明在该样品的特定位置存在甲基化DNA。 本发明还包括通过检测位于基因组DNA样品特定位置上的甲基化胞嘧啶从而诊
断某些状况的方法。
本发明还涉及检测位于样品中特定位置的甲基化DNA的方法，其包括用甲基活性切割方法处理样品，所述甲基活性切割方法在位于样品中特定位置的甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA ;添加与在或接近该特定位置的DNA互补的引物；使该样品进行聚合酶链式反应，并且当在该样品的特定位置存在甲基化DNA时产生扩增产物；以及检测扩增产物的存在，表明在该样品的特定位置存在甲基化DNA。
在特定实施方案中，该样品包含基因组DNA。 在优选的实施方案中，该特定位置是已知基因的启动子区域。在其它实施方案中，该样品来自患者，并且在该已知基因的启动子区域存在甲基化DNA表明该患者中存在癌细胞。 在其它优选的实施方案中，在甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA的甲基活性切割方法是甲基活性限制性酶。在其它实施方案中，在甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA的甲基活性切割方法是用5-甲基脱氧胞苷糖基化酶/裂解酶处理，用5-甲基脱氧胞苷糖基化酶、随后用独立的脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶(或独立的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶)处理，或用5-甲基脱氧胞苷糖基化酶、随后通过碱水解处理。 本发明还包括通过检测位于来自患者的样品中特定位置的甲基化DNA，从而检测患者中癌症的方法，其包括用甲基活性切割方法处理样品，所述甲基活性切割方法在位于样品中特定位置的甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA ;添加与在或接近该特定位置的DNA互补的引物；使该样品进行聚合酶链式反应，并且当在该样品的特定位置存在甲基化DNA时产生扩增产物；检测扩增产物的存在，表明在该样品的特定位置存在甲基化DNA ;以及从扩增产物的存在检测该患者中的癌症。 在某些实施方案中，该样品包含基因组DNA。在某些实施方案中，该特定位置是已知基因的启动子区域。在某些实施方案中，在甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA的甲基活性切割方法是甲基活性限制性酶。在某些实施方案中，在甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA的甲基活性切割方法是用5-甲基脱氧胞苷糖基化酶/裂解酶处理，用5-甲基脱氧胞苷糖基化酶、随后用独立的脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶(或独立的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶)处理，或用5-甲基脱氧胞苷糖基化酶、随后通过碱水解处理。
在某些实施方案中，本发明包括通过检测位于来自患者的样品中基因组DNA中特定位置的甲基化DNA，从而检测患者中癌症的方法，其包括用甲基活性限制性酶处理基因组DNA以产生切割产物；添加与在或接近该特定位置的DNA互补的引物；使该样品进行聚合酶链式反应，以当在该特定位置存在甲基化DNA时获得扩增产物；检测扩增产物的存在，其表明在该特定位置存在甲基化DNA;以及通过检测扩增产物的存在检测该患者中的癌症。
在本发明优选的实施方案中，所述特定位置是已知基因的启动子区域，所述甲基活性限制性酶是大肠杆菌(E. coli)McrBC和/或该方法还包括以下步骤在切割产物上产生平端(blunt end)，连接切割产物的末端以产生切割产物封闭环，并且如此定向引物以使得扩增产物仅能从切割产物的封闭连接环产生。 在某些实施方案中，本发明包括通过检测位于来自患者的样品中的基因组DNA中特定位置的甲基化DNA，从而检测患者中癌症的方法，其包括用甲基活性限制性酶处理基因组DNA以产生切割产物；在切割产物上产生平端；连接切割产物的末端以产生切割产物封闭环；添加与在或接近该特定位置的DNA互补的引物，其中如此定向引物以使得扩增产物
5仅能从切割产物的封闭连接环产生；使该样品进行聚合酶链式反应以获得扩增产物；检测扩增产物的存在，其表明在该特定位置存在甲基化DNA;以及通过检测扩增产物的存在检
测该患者中的癌症。
发明详述
定义 术语"扩增子"是指作为扩增反应(诸如聚合酶链式反应)的结果产生的双链DNA分子。 本文所使用的术语"CpG位点"是指在一些基因组DNA分子中在胞嘧啶上可能被甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸。 一般地，CpG 二核苷酸在较大的核酸序列中存在。
本发明中短语"甲基活性限制性酶"是指仅当在DNA中存在甲基化胞嘧啶时切割DNA的限制性酶。不同的此类酶可能需要甲基化胞嘧啶位于特定的位点。
本发明中的短语"甲基活性切割"是指仅在甲基化核酸的存在下发生的核酸切割。在本发明中，甲基活性切割方法包括但不限于使用甲基活性限制性酶。 在本发明中，术语"5_甲基脱氧胞苷糖基化酶/裂解酶"是指在5_甲基脱氧胞苷的存在下为活性的酶(糖基化酶和裂解酶两者)(Morales-Ruiz T， Ortega-Galisteo AP，Ponferrada—Marin MI，Martinez—Macias MI，Ariza RR，Roldan_Arjona T. Proc Natl AcadSci US A. (2006) 103(18) :6853-8 ;Gehring M， Huh JH， Hsieh TF， Penterman J， Choi Y，Harada JJ，Goldberg RB，Fischer RL. Cell. (2006) 124(3) :495-506)。 5-甲基脱氧胞苷糖基化酶/裂解酶的糖基化酶活性一般地破坏DNA的5-甲基脱氧胞苷和核糖之间的N-糖苷键。裂解酶活性也称为脱嘌呤/脱嘧啶(AP)裂解酶，其通过13 _消除反应将DNA骨架3'切割为无碱基糖。 核酸-在本发明中，术语"核酸"可以指任何天然或合成的核酸，包括但不限于单链和双链核酸、DNA、 RNA、 zDNA、合成核苷酸类似物和肽连接的合成核苷酸。
感兴趣的基因-在本发明中，术语"感兴趣的基因"可以指存在于基因组序列中的任何编码或非编码区域，其用于研究或临床检测甲基化。 启动子区-本发明中，"控制区域"可以是靠近感兴趣的基因且不必要包括在该基
因中的任何核酸部分。控制区域可以或可以不对感兴趣基因的表达具有直接的调控作用。
在感兴趣的基因的表达受到影响的某些细胞中，控制区域一般是可以具有甲基化5-脱氧
胞苷的区域。 甲基活性切割 本发明包含若干种甲基活性切割的方法。在本发明中可使用在甲基化CpG的存在下切割DNA，但是没有甲基化DNA的存在下则不切割DNA的任何方法。方法包括但不限于甲基活性限制性酶，诸如McrBC (Stewart, F.J.和Raleigh E. A. (1998) Biol. Chem. 379 :611-616.)和与裂解酶组合的5-甲基胞苷糖基化酶。
扩增方法 本发明设想了各种扩增方法，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反
应以及滚环复制。 检测方法 本发明考虑了若干种检测特定扩增产物种类的方法。检测方法包括但不限于掺入并检测标记、探针捕获方法、T叫man分析、电泳方法和杂交方法。标记包括但不限于放射标记的核苷酸、荧光团、量子点(quantum dots)、生物素缀合的核苷酸以及发色酶。
可以应用结合了检测特定位置甲基化CpG和扩增的各种方法。例如，可通过在甲基化CpG的存在下为活性的甲基活性酶切割基因组样品。可使从此类切割中产生的DNA片段进行酶法"钝化(bl皿t)"末端，将已知序列的寡核苷酸接头(adapter)连接到该末端。然后该样品可具有两个添加的引物，其中一个与特定位置附近的区域杂交，而其中的第二个与寡核苷酸接头上的已知序列杂交。上述实例在以下
图1中得以阐述。
在优选的实施方案中，可如下实施本发明可在DNA中两个5-甲基胞嘧啶位点附近用酶产生可特异地检测的DNA序列改变。如在下图1和2中所示那样，限制性酶大肠杆菌McrBC可特异地识别并切割直接在dA或dG(嘌呤=Pu)之后的5-甲基dC残基附近的dsDNA。这些包括在dG残基之前的5-甲基dC以形成CpG 二核苷酸，哺乳动物DNA甲基化的主要位点。如果该dC残基没有被甲基化，则不会发生切割。因为这一原因，McrBC被称为"甲基活性"，以与"甲基化敏感"相对，后者描述对其而言反之才成立的更大的已知的限制性酶类型，即，其切割未甲基化的靶序列而不切割甲基化的靶序列。 严格的说，为切割DNA， McrBC —般需要间隔55bp至最多至3kbp的两个PumC位点。切割位点可以是离该两个PiTC之一的约30bp处。因为参与基因调控的DNA甲基化位点含有高密度的甲基化CpG 二核苷酸，因此图1和2所示的导致产生新甲基化_特异性DNA片段的情况很可能发生。应当注意该切割不必须在识别位点之间，而是以示例的方式图示。当其确实发生时，在切割位点产生甲基化特异性序列改变是可能的。例如，在以下图1和2中，如在参考文献中描述的那样处理甲基化特异性DNA片段，以产生可连接的片段末端。如在图1中那样，如果然后使得DNA片段在DNA连接酶的存在下环化的话，可产生共价-封闭的DNA环。可应用含有甲基化靶基因(例如来自人类肿瘤的DNA)的样品经验地确定连接接合位点和序列。这可应用DNA克隆和测序来完成。 一旦知道后，可如图解那样设计并合成用于扩增特定DNA产物的PCR的特异DNA引物，其具有一条对新接合序列特异的引物。DNA片段环化之后的扩增被称为"反向"PCR(Ochman H， Gerber AS， Hart 1 DL. Genetics.(1988) 120(3) :621-623)。备选地，如图2那样，可将合成的、称为"连接子(linker)"或"接头(adapter)"的dsDNA片段连接至片段的任一末端或两个末端。因为所有显示的序列都将是已知的，因此可以设计这样的PCR引物，其特异地靶向甲基化特异性片段和连接子之间的接合序列。为增加特异性(因为许多不同的片段现在都含有该连接子序列)，可如图示那样进行"巢式"PCR。 还可能应用与PCR相容的荧光寡核苷酸探针(例如，T叫man探针)靶向新的接合序列，并且应用侧翼PCR扩增引物。然而，用PCR引物代替探针靶向新序列在下述情况下具有优点，所述情况是甲基化_特异性靶在可扩增备选物的背景中是少数序列(如果诊断应用是从在诸如血清或血桨的体液中发现的DNA来早期检测癌症_大多数DNA是"野生型"且没有被甲基化，其是可能的)。如果两者都扩增的话，可由探针产生的信号会减少。如果仅扩增甲基化_特异性靶的话，能增强信号与背景之比。 应用侧翼引物，并且应用反向PCR，没有可扩增的备选物是可能的。在感兴趣的区域中不存在显著甲基化的情况下，所切割的序列将很大，并且可以如此的放置扩增引物，以使得在不存在甲基化的情况下，扩增产物将大到无法有效地扩增。
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也可以适用其它核酸扩增方法(诸如SDA)来检测甲基化-特异性序列改变。
在其它优选的实施方案中，可如下实施本发明。如图3所示，酶5-甲基脱氧胞苷 糖基化酶/裂解酶能特异性地识别并从dsDNA中(尤其是从CpG 二核苷酸中)移除5-甲 基胞嘧啶核苷酸，留下在5'之前有拥有3'磷酸或a ， 13 -未饱和醛(未显示)的核苷酸的 一个核苷酸缺口，所述3'磷酸或a ， P-未饱和醛均可使用大肠杆菌核酸内切酶IV移除， 留下适于通过DNA聚合酶延伸核苷酸链的游离3'羟基。在图3A中，应用"诱变"的单核苷 酸三磷酸(dNTP)进行此类链延伸。也就是说，该dNTP可有效地插入到这一位置，当随后通 过DNA聚合酶复制含有该诱变核苷酸的DNA链时，插入了改变最初碱基序列的核苷酸。其 实例，但不是唯一的实例是5-溴脱氧尿苷酸三磷酸(5-BrdUTP)，其能通过DNA聚合酶有效 地插入到dG残基对面，尤其是在不存在dCTP的情况下更是如此。但是当在所有四种天然 dNTP都存在的情况下复制时，优选插入dA残基而不是dC残基(Lasken RS， Goodman MF. J BiolChem. (1984)259(18) :11491-5)。为避免类似物一旦掺入就被移除，聚合酶可缺乏3' 核酸外切酶校正活性。 一旦掺入此类类似物，可使其与缺口上的5'磷酸连接。备选地，可 移除该dNTP类似物，并且可以用DNA聚合酶(缺乏3'核酸外切酶)和四种天然dNTP，沿着 之前存在的、退火DNA链的替代链，使从所掺入的核苷酸类似物3' OH的链延伸继续进行。
随后是分离两条DNA链，例如通过热变性，并且通过DNA聚合酶弓|发合成含有诱变 核苷酸类似物的链拷贝。由于类似物，制得具有经改变的核苷酸碱基序列的拷贝。 一旦鉴 定了基因组甲基化位点和周围的序列，可进行模式实验以鉴定由这一过程产生的特定序列 改变。可通过引物指导的DNA扩增(例如，PCR)高效且敏感地检测此类经改变的序列。公 知PCR能鉴别与引物的单碱基错配，尤其是与引物3'端的错配；可将此类错配设计到用于 给定分析的引物中。 备选地，如图3B所示，可提供DNA聚合酶(缺乏3'核酸外切酶校正活性)和单独 的dGTP、dATP或dTTP。在不存在dCTP的情况下，错配的核苷酸碱基能被迫掺入到dG的对
面。可通过1!1++的存在和使用有错误掺入倾向的聚合酶(诸如病毒逆转录酶)来促进这
一掺入。提供的单dNTP应当不是预期掺入5-甲基dC替换的上游一个碱基的dNTP，因为这 一位置的切口或缺口可能翻译为替换位点，从而给出假阳性结果。还可使得发生与dG错配 的核苷酸碱基的有效的、酶介导的连接(Lu J， Tong J， Feng H， Huang J， Afonso CL， Rock DL，Barany F， Cao W. Biochim Biophys Acta. (2004) 1701(1-2) :37-48.)。或者，不发生连 接，而是一旦允许发生了错误掺入，则可提供剩余的3种天然dNTP，在缺乏3'核酸外切酶校 正活性的情况下，可以使得发生从所掺入的错配核苷酸的有效延伸。如上，这导致特异地可 知、可扩增且可检测的序列改变。
附图简述 图1图示了扩增检测的方法。图示的方法应用了特异连接子的连接，并且使用了 与该连接子和切除的DNA杂交的引物。在该切除的DNA序列内的巢式引物增加了扩增和检 测的特异性。 图2图示了应用"反向"PCR的另一扩增和检测方法。切除后，使切除的DNA片段 环化，并且应用在连接的接合处扩增扩增子的引物，以扩增并检测DNA的成功切割。
图3图示了应用核苷酸切除和诱变的另一扩增和检测方法。应用对5-甲基胞苷 特异的糖基化酶，起始核苷酸切除。可通过诱变类似物(A)，或通过错误掺入的天然核苷酸(B)代替切除的单核苷酸。在任一种情况下，通过DNA聚合酶复制该经修饰的DNA链均产生 可特异性地扩增并检测(例如通过PCR)的序列改变。
实施例 以下是预言性的，并且不代表实际实验
实施例1 可从患者取得液体样品。可应用已知方法从该患者样品提取基因组DNA。
然后用在CpG位点中的甲基化胞嘧啶的存在下为活性的限制性酶处理提取的基 因组DNA，产生酶处理的样品。然后使该酶处理的样品与连接子组合，所述连接子与通过限 制性酶切割的分子的末端相连接。 使该混合物与以下两条引物组合，其中一条引物与感兴趣基因的启动子区域附近
的序列杂交，以及第二条引物与连接子杂交，所述连接子与通过限制性酶切割的分子的末
端相连接。使用该引物和第二引物，然后可使该混合物进行扩增反应，诸如PCR。当特定的
CpG位点被甲基化时，基因组DNA分子被切割，连接了连接子，并且从该扩增反应产生了特
定的扩增子。在缺乏特定的甲基化CpG的情况下，不会产生特定的扩增子。 然后可通过各种已知方法检测该特定的扩增子。如果检测到该特定的扩增子，表
明了该特定CpG位点的甲基化状态，然后可表明并诊断特定肿瘤状态。 实施例2 在其它实施方案中，可从患者获得实体瘤活组织。可应用已建立的技术从该实体 瘤活组织提取基因组DNA以产生样品。 然后用在CpG位点中的甲基化胞嘧啶的存在下为活性的限制性酶处理该基因组 DNA样品，产生酶处理的样品。然后可在这样的物质中处理该经酶处理的样品，所述物质产 生平端化的双链DNA。随后可用连接酶处理这一样品，从短DNA短片段产生环状DNA。这一 实施例如下图2所示。 然后可使该样品与一组引物结合，所述引物与感兴趣的基因组序列附近的序列杂
交，当在感兴趣的基因组序列附近的某些位点被切割并连接成为某种环状DNA时，其产生
仅在该某种环状DNA的存在下才可能产生的扩增子。然后可使该样品和引物组进行扩增反
应，当在感兴趣的基因组序列附近的CpG位点被甲基化时，产生特定的扩增子。 可检测特定的扩增子，表明从其中取得该活组织的实体瘤是由感兴趣的基因组序
列附近的CpG位点的甲基化表明的特定类型的肿瘤。 实施例3 在其它实施方案中，可从患者获得实体瘤活组织。可应用已建立的技术从该实体 瘤活组织提取基因组DNA以产生样品。 所述基因组DNA然后用在CpG位点中的甲基化胞嘧啶的存在下为活性的组合的 5_甲基胞嘧啶糖基化酶/裂解酶处理，或用在CpG位点中的甲基化胞嘧啶的存在下为活性 的5_甲基胞嘧啶糖基化酶、随后用独立的AP裂解酶或AP核酸内切酶处理，产生在其双链 DNA中具有缺口的经酶处理的样品。然而可以以下方式处理该经酶处理的样品，所述方式允 许通过与dC具有不同的碱基配对特异性的核苷酸填充该缺口 。 然后使该样品与下述引物组合，其中一条引物与感兴趣的癌症相关基因中的序列杂交，并且第二引物与第一引物附近的现已突变的序列特异性杂交。在某些实施方案中，为 了最大的PCR的特异性，第二引物的3'核苷酸或3'倒数第二个核苷酸与突变的碱基相对。 使用该引物和第二引物，然后可使该混合物进行扩增反应，诸如PCR。当特定CpG位点被甲 基化时，从该扩增反应产生特定的扩增子。在不存在特定甲基化CpG时，不会产生特定的扩 增子。 然后可通过各种已知方法检测该特定的扩增子。如果检测到该特定的扩增子，表 明了该特定CpG位点的甲基化状态，然后可表明并诊断特定肿瘤状态。
权利要求
检测位于样品中特定位置的甲基化DNA的方法，其包括用甲基活性切割方法处理样品，所述甲基活性切割方法在位于样品中特定位置的甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA；添加与在或接近该特定位置的DNA互补的引物；使该样品进行聚合酶链式反应，并且当存在成功的甲基活性切割时产生扩增产物，但是当不存在成功切割时没有扩增；以及检测扩增产物的存在，表明在该样品的特定位置存在甲基化DNA。
2. 权利要求1的方法，其中所述特定位置是已知基因的启动子区域。
3. 权利要求2的方法，其中所述样品来自患者，并且其中在所述已知基因的启动子区域存在甲基化DNA表明该患者中存在癌细胞。
4. 权利要求1的方法，其中在甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA的甲基活性切割方法是甲基活性限制性酶。
5. 权利要求1的方法，其中在甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA的甲基活性切割方法是用5-甲基脱氧胞苷糖基化酶/裂解酶处理。
6. 通过检测位于来自患者的样品中特定位置的甲基化DNA，从而检测患者中癌症的方法，其包括用甲基活性切割方法处理样品，所述甲基活性切割方法在位于样品中特定位置的甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA ;添加与在或接近该特定位置的DNA互补的引物；使该样品进行聚合酶链式反应，并且当在所述样品的特定位置存在甲基化DNA时产生扩增产物；检测扩增产物的存在，表明在该样品的特定位置存在甲基化DNA;以及从扩增产物的存在检测该患者中的癌症。
7. 权利要求1或6的方法，其中所述样品包含基因组DNA。
8. 权利要求6的方法，其中所述特定位置是已知基因的启动子区域。
9. 权利要求6的方法，其中在甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA的甲基活性切割方法是甲基活性限制性酶。
10. 权利要求6的方法，其中在甲基化DNA的存在下在一致位点切割DNA的甲基活性切割方法是用5-甲基脱氧胞苷糖基化酶/裂解酶处理。
11. 通过检测位于来自患者的样品中基因组DNA中特定位置的甲基化DNA，从而检测患者中癌症的方法，其包括用甲基活性限制性酶处理所述基因组DNA以产生切割产物；添加与在或接近该特定位置的DNA互补的引物；使该样品进行聚合酶链式反应，以当在所述特定位置存在甲基化DNA时获得扩增产物；检测扩增产物的存在，其表明在该特定位置存在甲基化DNA ;以及通过检测扩增产物的存在检测该患者中的癌症。
12. 权利要求ll的方法，其中所述特定位置是已知基因的启动子区域。
13. 权利要求ll的方法，其中所述的甲基活性限制性酶是大肠杆菌McrBC。
14. 权利要求11的方法，其中所述方法还包括以下步骤在切割产物上产生平端，连接切割产物的末端以产生切割产物封闭环，以及其中如此定向引物以使得扩增产物仅能从切割产物的封闭连接环产生。
15. 通过检测位于来自患者的样品中的基因组DNA中特定位置的甲基化DNA，从而检测患者中癌症的方法，其包括用甲基活性限制性酶处理基因组DNA以产生切割产物；在切割产物上产生平端；连接切割产物的末端以产生切割产物封闭环；添加与在或接近该特定位置的DNA互补的引物，其中如此定向引物以使得扩增产物仅能从切割产物的封闭连接环产生；使该样品进行聚合酶链式反应以获得扩增产物；检测扩增产物的存在，其表明在该特定位置存在甲基化DNA ;以及通过检测扩增产物的存在检测该患者中的癌症。
全文摘要
本发明涉及基因组DNA样品中甲基化核苷酸的鉴定。本发明还涉及通过鉴定特定甲基化核苷酸诊断特定状况的方法。
文档编号C12Q1/68GK101765666SQ200880101227
公开日2010年6月30日 申请日期2008年7月29日 优先权日2007年7月30日
发明者R·希古奇 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司