专利名称：治疗肾功能衰竭的选择性细胞疗法的制作方法
技术领域：
本发明在用于恢复器官功能的选择性细胞疗法的领域内。
背景技术：
慢性肾功能衰竭的特征在于肾功能的渐进丧失，并且最终可进行至终末期肾功能 衰竭，此时肾不再以维持身体的水平发挥功能作用。终末期肾功能衰竭是牵涉受累者的多 个器官的破坏性疾病。在美国终末期肾病的最常见病因是糖尿病。由肾脏进行的功能之一是产生促红细胞生成素(EP0)。当肾正常发挥功能时， 肾间质中的低组织氧合作用(tissue oxygenation)刺激间质细胞产生EP0。分泌的EP0 接着刺激骨髓中红细胞产生，这使组织氧压恢复至正常水平。由无效造血(ineffective hematopoiesis)所致的贫血是由于肾减小的产生EP0的能力引起的慢性肾功能衰竭的不 可避免的一个结果。也已报导EP0具有抗氧化应激和细胞凋亡的保护作用。肾是身体中EP0的主要产生者，从而是治疗肾功能衰竭诱导的贫血的主要靶。虽 然透析可延长许多终末期肾病患者的存活，但目前只有肾移植才可恢复正常功能。然而，肾 脏移植严重受限于临床供体不足。多年来用于缓解与肾功能衰竭相关的贫血的治疗包括反复地输入红细胞以及施 用睾酮和其他促蛋白合成类固醇(anabolic steroid)。然而，此类治疗方法一直以来没有 一个是完全令人满意的。接受反复输血的患者遭受铁超负荷(iron overload)，并且可产生 抗主要组织相容性抗原的抗体。睾酮对骨髓中红细胞生成作用最小，并且其与不期望的男 性化副作用相关。之前减轻与肾功能衰竭相关的贫血的努力包括施用纯化的重组EP0(参见，授予 例如Cheung等人的美国专利6，747，002，授予ffestenfelde等人的6，784，154)。然而，重 组EP0的施用只是暂时提高了血液中的EP0水平，并且可导致缺铁症。也一直在寻求其中 使用转染的宿主细胞产生EP0的基因治疗方法(参见，例如，授予Selden等人的美国专利 5，994，127，授予 Aebischer 等人的 5，952，226，授予 Carcagno 等人的 6，777，205 ；Rinsch 等 人(2002)Kidney International 62 1395-1401)。然而，这些方法牵涉非肾细胞的转染，并 且需要在移植后防止抗原识别和免疫排斥的技术例如细胞包囊化(cell encapsulation)。 此外，使用外源DNA的转染可能是不稳定的，随着时间的过去，细胞可丧失它们表达EP0的 能力。基于肾细胞的替换肾组织的方法受到对鉴定肾细胞和以足够的数量扩增其的需 要的限制。此外，用于肾组织工程目的的肾细胞的培养因肾的独特结构和细胞异质性而特 别困难。肾脏是具有多种功能(包括废物排泄、身体内环境稳定(body homeostasis)、电解 质平衡、溶质运输以及激素产生)的复杂器官。
仍然存在对用于缓解肾细胞的衰竭所致的贫血以产生足够量的促红细胞生成素 的备选治疗选择的巨大需要。发明概述在本发明的实施方案中本文提供了从已进行了传代和/或体外扩增的肾的分化 细胞收获的分离的肾细胞群体。在一些实施方案中，肾细胞包括肾脏的肾小管周围间质细 胞和/或内皮细胞。在一些实施方案中，肾细胞由或基本上由获自肾组织的并且体外传代 的肾的肾小管周围间质细胞和/或内皮细胞组成。在一些实施方案中，细胞产生促红细胞 生成素(EP0)。在另外的实施方案中，选择肾细胞来进行EP0产生。还提供了产生分离的产生EP0的细胞群体的方法，该方法包括步骤1)收获分化 肾细胞；和2)将分化肾细胞传代，其中细胞在所述传代后产生EP0 ；从而产生分离的产生 EP0的细胞群体。在一些实施方案中，方法还包括选择分化肾细胞来进行EP0产生的的步 骤。在一些实施方案中，传代步骤包括在包含胰岛素转铁蛋白硒(ITS)的培养基中培养分 化肾细胞。还提供了治疗有此需要的受试者(例如，患者)中导致减少的EP0产量的肾病或 其他不适(ailment)的方法，该方法包括步骤1)提供分离的产生EP0的细胞群体；和2)对 受试者施用所述群体(例如，以有效治疗肾病和/或减少的EP0产量的量)，从而产生EP0 的细胞体可在体内产生EP0。在一些实施方案中，通过收获肾的分化肾细胞并且在体外传代 细胞来进行提供步骤。在一些实施方案中，产生EP0的细胞群体包括，由或基本上由获自肾 的分化细胞的并且体外传代的肾小管周围内皮细胞和/或间质细胞组成。在一些实施方案 中，在适当的载体(例如，胶原凝胶)中提供所述群体以便施用。在一些实施方案中，通过 将细胞群体植入患者的肾来进行施用步骤。在一些实施方案中，施用步骤通过皮下注射或 植入所述组合物来进行。在一些实施方案中，产生EP0的细胞是人细胞。还提供了分离的细胞群体，其包括获自人肾组织并且已进行体外传代的分化人肾 细胞。在一些实施方案中，肾细胞由或基本上由获自肾组织的并且已进行体外传代的肾的 肾小管外周间质细胞和/或内皮细胞组成。在一些实施方案中，分化人肾细胞产生促红细 胞生成素(EP0)。在一些实施方案中，人肾细胞已传代1至20次。在一些实施方案中，人肾 细胞已传代至少3次。在一些实施方案中，群体已被选择用于EP0产生。一些实施方案以 不使用编码多肽的外源DNA转染细胞为条件。还提供了包含如本文所述的人肾细胞群体和药学上可接受的载体的组合物。在一 些实施方案中，载体包括胶原。本发明的另一个方面是如本文所述的方法用于制备组合物或药剂或用于制造如 本文所述的制品的用途，所述组合物或药剂用于治疗或用于进行如本文所述的治疗方法 (例如，用于治疗导致减少的EP0产量的肾病或其他不适)。附图概述
图1.促红细胞生成素(EP0)产生的机制。肾的肾间质管周细胞(Renal interstitial peritubular cell)检测到低血氧水平，然后将EPO分泌入血液。EP0刺激 红系祖细胞(erythroid progenitor)的增殖和至网织红细胞的分化，并且阻止细胞凋亡， 从而引起更多的网织红细胞进入循环血液。网织红细胞分化成红细胞，从而增加了红细胞 系的数量。从而增加了氧至组织的输送。
图2.与阴性对照(X400)相比较，在第一代1 (P1)、第2代(P2)和第3代(P3)于 肾细胞的原代培养物中确认了细胞内促红细胞生成素的免疫反应性。图3.肾组织(左图)和培养肾细胞(右图)中促红细胞生成素表达细胞的显微 镜图像。图4.产生促红细胞生成素(EP0)的细胞的定量。表达EP0的细胞数目随着后续 传代而减少(*P < 0. 05)。图5.去污剂溶解的细胞提取物的Western印迹分析检测到早期代原代培养的肾 细胞(P0-P3)的 EP0 蛋白(34kDa)。图6.使用FACS进行的EP0表达分析。顶行小鼠细胞，第0至3代。底行大鼠 细胞，第0至3代。图7A-7B.小鼠肾细胞的表征。通过免疫荧光(图7A)确认EP0表达(KNRK细胞 用作正对照)。也检测到GLEPP1和Tamm Horsfall肾标记(图7B)。图8.大鼠肾细胞的表征。培养大鼠肾细胞具有不同细胞形态学，如由相差显微镜 (左图)所显示的，并且表达GLEPP1和Tamm Horsfall肾标记(右图)。图9.通过western印迹显示EP0在IfepG2细胞中的表达，将其与肾细胞中的EP0 表达相比较。图10.在低氧条件下的培养细胞的EP0蛋白的表达。在正常和低氧条件下培养 Lewis大鼠肾细胞和H印G2细胞，通过细胞的western印迹估量EP0产量。34kDa = EP0 ； 43kDa = 肌动蛋白。图11.在低氧条件下培养基中EP0蛋白质的表达。通过western印迹法估量Lewis 大鼠肾细胞和H印G2细胞的培养基中的EPO。34kDa = EP0 ；43kDa = 0 -肌动蛋白。图12.从第1和2代大鼠肾原代细胞制备总蛋白裂解物。处理来自含氧量正常的 样品(NC)、3% 02和7% 02中的样品的培养皿，在10% SDS-PAGE上进行电泳。KNRK细胞系 用作正对照。图13.通过western印迹测量培养基浓缩物中的EP0。在各代将来自Lewis大鼠 的原代培养细胞在10cm培养皿上培养至接近汇合。用KSFM饥饿细胞24小时，然后置于 低氧箱(1%02)中进行24、48或72小时。在低氧温育后，收集培养基，用10K分子量筛截 amicon超离心装置(Millipore)进行浓缩。然后将40ug总蛋白上样在10%聚丙烯酰胺凝 胶上。KNRK细胞用作正对照。图14.取回的植入物的组织学分析显示肾细胞在体内存活并且形成组织。使用 EP0特异性抗体在组织免疫学上确认了 EP0产生细胞的存在(X400)。左图lxl06个细胞/ 注射的初始细胞密度。右图lxl06个细胞/注射的初始细胞密度。每一个图的顶行2周。 每一个图的底行4周。图15.通过实时PCR测量的培养基和低氧对肾原代细胞的作用。将肾原代细胞 (p0)在10cm培养皿中培养至80%的汇合。然后用无血清KSFM或DMEM培养3个培养皿的 细胞并且置于3% 02的低氧箱中。在24小时后，处理样品以进行RNA和cDNA合成。以一 式三份重复进行实时PCR，相对于含氧量正常的样品定量样品。图16.通过实时PCR测量的低氧对肾原代细胞的作用。将肾原代细胞(第0代和 第2代)在10cm培养皿中培养至80%的汇合。然后将细胞培养在无血清KSFM中并且置于1%02的低氧箱中。在24、48或72小时后，然后处理样品以进行RNA和cDNA合成。以 一式三份重复进行实时PCR，相对于含氧量正常的样品定量样品。图17.通过实时PCR测量的低氧对肾原代细胞的作用。将肾原代细胞(第0代) 在10cm培养皿中培养至80%的汇合。然后将细胞置于02的低氧箱中进行达到24小 时。然后处理样品以进行RNA和cDNA合成。以一式三份重复进行实时PCR，相对于含氧量 正常的样品定量样品。图18.扩增原代人肾细胞。显示了第2、4、7和9代的细胞。图19.人原代肾细胞被保持通过20次倍增。图20.人肾细胞的表征。GLEPP1和EP0阳性细胞存在于群体中。图21.使用20mg/ml胶原载体进行的人肾细胞体内递送。在取回时，注射后3周， 注射体积得到保持，并且存在新血管形成。图22.胶原和培养的人肾细胞的注射胶原导致表达EP0的组织在体内形成。优选实施方案的详述可以以两个方向总体地和选择性地进行用于肾功能衰竭的基于细胞的疗法。本 文所描述的是用于实现特定功能器官组分的恢复的选择性细胞疗法。本文引用的所有美国专利参考资料的公开内容以它们与本文所示的公开内容相 一致的程度通过引用合并入本文。如本文所使用的，在本发明的描述和所附权利要求中，除 非上下文清楚地指出，否则单数形式“a”、“an”和“the”旨在也包括复数形式。此外，如本 文所使用的，术语“大约”和“大致”当指测量值例如化合物的量、剂量、时间、温度等时，意 指包括指定量的20 %、10%、5 %、1 %、0. 5 %或甚至0. 1 %的变化。同样，如本文所使用的， “和/或”或“/”是指和包括一个或更多个相关列出项的任何和所有可能组合和，当在二者 选一(“或”)情况下解释时表示不存在组合。“肾组织”是从肾分离或收获的组织，该组织包含肾细胞。在一些实施方案中，肾细 胞对于一个或更多个已知的肾标记例如GLEPPl、Tamm Horsfall等是阳性的。“细胞”可以 是任何适当的物种的细胞，在一些实施方案中是与向其中植入通过本文中的方法产生的组 织的物种相同的物种的细胞。哺乳动物细胞(包括小鼠、大鼠、狗、猴子和人细胞)在一些 实施方案中是特别优选的。如本文所使用的，“分离的”表示将细胞置于除了它们的天然环 境外的环境中。当最初从受试者分离组织或细胞例如原代外植体时，它们就被“收获”。“受试者”通常是人受试者，包括但不限于“患者”。受试者可以是男性或女性并且 可以是任何种族，包括但不限于高加索人、非洲裔美国、非洲人、亚洲人、西班牙人、印度人 等。受试者可以是任何年龄的人，包括新生儿、新生婴儿(neonate)、婴儿、儿童、青少年、成 人和老年人。受试者还可包括用于例如兽医学和/或药物开发目的动物受试者，特别地哺乳动 物受试者例如犬科动物、猫科动物、牛族动物、山羊科动物(caprines)、马科动物、羊科动物 (ovines)、猪、啮齿类动物(例如，大鼠和小鼠)、兔类动物、非人灵长类动物等。细胞可以是同基因的(即，遗传上相同的或密切相关的，以使组织移植排斥降至 最低)、同种异体的(即，来自相同物种的非遗传相同的成员)或异种的(即，来自不同物种 的成员)。同基因细胞包括为自体的(即，来自待治疗的患者的)和等基因的(即，遗传上 相同但不同受试者，例如来自相同双胞胎的)细胞。细胞可获自例如供体(即活的或尸体的)或来源于已建立的细胞株或细胞系。细胞可以例如使用本领域内已知的标准活检技术 从供体收获。“原代培养”是在将分离的细胞或原代外植体接种入培养容器后建立的首次培养。 如本文所使用的，“扩增”是指活细胞的数目的增加。扩增可以通过例如将细胞“培养”通过 一个或更多个细胞周期来实现，其中至少一部分细胞分裂，从而产生增加的细胞。“体外传代的”或“传代的”是指将细胞培养物转移或再培养至第二培养容器，通常 牵涉机械或酶促分离、再接种和取决于增殖速度，通常至两个或更多个子培养物的分配。如 果就特定的基因型或表型选择群体，培养物在传代培养后变成“细胞株”，即，培养物是同质 性的并且具有期望的特征(例如，表达EP0的能力)。EP0的“表达”或“表现”意指编码EP0的基因被转录，和优选被翻译。通常，根据 本发明，EP0编码区的表达将导致编码的多肽产生，这样细胞是“产生EP0的细胞”。在一些 实施方案中，细胞产生EP0而无需另外的操作例如外源基因的导入。在一些实施方案中，本 发明的条件是不通过导入外源基因和/或利用刺激EP0的产生的外源化学试剂来处理产 生EP0的细胞。在一些实施方案中，收获的细胞不进行传代。在其他实施方案中，将细胞传代一 次、二次或三次。在其他实施方案中，将细胞传代3次以上。在一些实施方案中，将细胞传 代0至1次、0至2次或0至3次。在一些实施方案中，将细胞传代1至2次、1至3次或1 至4次或更多次。在一些实施方案中，将细胞传代2至3次、2至4次或更多次。在另外的 实施方案中，将细胞传代5、8、10、12或15或更多次。在一些实施方案中，将细胞传代0、1、 2、3或4至8、10、15或20或更多次。所用的传代次数可根据例如在每一次传代后细胞群体 中测量的相对EP0产量来选择。肾细胞的生长和扩增逐渐受到明显挑战，因为此类细胞易于停止生长和早期分 化。在本发明的一些实施方案中通过使用包含促进它们生长的添加剂的肾细胞特异性培养 基(kidney cell specific media)来克服该挑战。因此，在一些实施方案中，将肾细胞培 养在包含添加剂例如生长因子和促进它们生长的其他补充剂的培养基中。此外，在一些实 施方案中，将产生EP0的细胞与其他肾细胞类型共培养。在一些实施方案中，将肾细胞培养在补充有10%胎牛血清(FBS)或fetal calf serum(FCS)和任选地青霉素-链霉素(P/S)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中。 在其他实施方案中，将肾细胞培养在角质细胞无血清培养基(KSFM)中。在另外的实施方 案中，将肾细胞培养在含有一种或更多种下列添加剂的KSFM中牛垂体提取物(BPE)(例 如，50g/mL)、表皮生长因子(EGF)(例如，5ng/mL)、抗生素-抗真菌药溶液(GIBC0)(例如， 5mL)、胎牛血清(FBS) (Gemini Bio-Product)(例如，12. 5mL 2. 5% )和胰岛素转铁蛋白硒 (ITS) (Roche)(例如，对于5L培养基50mg)。如本领域技术人员所理解的，在上述培养基的 一些实施方案中，青霉素-链霉素(P/S)与抗生素-抗真菌药溶液是可互换的。根据本发明的肾细胞的传代可使用本领域内已知的标准方法来进行。例如，可使 用胰蛋白酶/EDTA分解细胞，将其转移至其他培养皿。这是用于许多细胞类型的标准方 法。简而言之，在一些实施方案中，这可使用下列步骤来进行1)除去培养基；2)加入10ml PBS/EDTA(0. 5M)进行4分钟，在相关显微镜下确认细胞连接的分离；3)除去PBS/EDTA，加 入胰蛋白酶/EDTA ；4)当在显微镜下80-90%的细胞浮起时加入5ml培养基；5)将细胞悬浮液抽吸入15ml试管中；6)以lOOOrpm离心细胞4分钟；7)除去上清液；8)将细胞重悬浮于 5ml培养基中；9)用移液管吸出100 yl细胞悬浮液，然后进行台盼蓝染色以进行存活率测 定；10)在血细胞计数器上计数细胞的数目；11)在板上等分期望的细胞数目，使培养基的 体积为总共10ml ；12)将细胞置于培养箱中。“选择”可基于将一种细胞类型与另一种相区别的任何独特性质，例如密度、大 小、独特的标记、独特的代谢途径、营养需求、蛋白质表达、蛋白质分泌等。例如，可基于密 度和大小使用离心梯度来选择细胞。可用荧光活化细胞分选术(fluorescent activated cell sorting) (FASC)、免疫磁珠分选术、磁性活化细胞分选术(magnetic activated cell sorting) (MASC)、淘选等来选择独特标记。可通过改变在其上(特别地在无血清环境中) 培养细胞的培养基的营养成分的组成和/或量来利用独特的代谢途径和营养需求。可用不 同的测定法例如ELISA检测蛋白质表达和/或分泌。“产生EP0的细胞”是指其的至少一部分产生EP0(例如，至少20、30、40或50%或 更多，或更优选60、70、80或90%或更多的细胞产生EP0)的分化细胞。在一些实施方案中， 细胞产生EP0而无需另外的处理例如外源基因的导入。在一些实施方案中，本发明以不通 过外源基因的导入和/或利用刺激EP0的产生的外源化学试剂来处理产生EP0的细胞为条 件。细胞可获自例如肾的肾小管周围间质细胞。在一些实施方案中，就它们产生EP0的能 力来选择细胞。在其他实施方案中，通过细胞培养技术例如传代来在数量上扩增细胞。可 使用来自肾和来自其他来源的具有产生EP0的特定功能的细胞。例如，EP0也可在肝中正 常产生。在肾中，通常已知EP0由肾小管周围间质细胞产生(图1)。在一些实施方案中， 分离的分化肾细胞群体包括，由或基本上由肾的肾小管周围间质细胞组成，其由或基本上 由80、90、95或99%或更多肾小管周围间质细胞和按数量计算不超过20、10、5或或更 少的其他细胞类型组成。在其他实施方案中，分离的分化肾细胞群体包括其他细胞类型例 如内皮管周细胞(endothelial peritubular cell)。在一些实施方案中，分化肾细胞的分离群体包括，由或基本上由就EP0的产生而 选择的肾细胞组成，其由或基本上由80、90、95或99%的或更多的产生EP0的细胞和按数目 计算不超过20、10、5或的不表达EP0的细胞组成。选择可通过使用特异性标记选择表 达EP0的细胞来实现。在一些实施方案中，细胞可包括不同的肾细胞类型，只要所述细胞表 达EP0。在另外的实施方案中，可将整个肾细胞集落用于扩增和治疗。在一些实施方案中，分离的分化肾细胞群体具有“长寿命”，这样当体外培养时它 们就能够生长通过至少5、10、15、20、25或30或更多次的群体倍增。在一些实施方案中，当 在体外培养时，细胞能够通过40、50或60或更多次群体倍增来增殖。“分化的”是指具有特化功能例如EP0产生和/或已知的分化细胞的标记(例如 GLEPP1和/或Tamm Horsfall肾细胞标记)的表达的细胞或包含所述细胞的群体。在该意 义上，它们不是祖细胞或干细胞。本发明的一些实施方案以不在产生特化程度不太高的细 胞群体的条件下对收获的分化细胞进行传代为条件。备选地，在其他实施方案中，培养细胞以产生细胞系，该细胞系之后可分化产生更 特化的细胞。与细胞株相反，“细胞系”的建立总地来说是未分化的，虽然它们可被定型至 特定谱系。繁殖天然地有利于增殖表型，在一些实施方案中细胞可能需要通过例如变更培养条件来重新导入分化。存在许多本领域中已知的可在细胞系中诱导分化的分化因子(例 如，细胞因子例如表皮形态发生素和HGF、维生素等)。治疗方法在一些实施方案中，可将产生EP0的细胞施用(例如，通过注射)至有此需要的受 试者的肾(例如，施用入皮质和/或髓质)。在其他实施方案中，将产生EP0的细胞施用至 身体的其他部位，例如肝、腹膜等。在一些实施方案中，经皮下、被膜下(subcapsular)等施 用产生EP0的细胞。在另外的实施方案中，可通过植入本文所述的含有所述产生EP0的细 胞的基质(例如，胶原凝胶支架)来施用产生EP0的细胞。在其他实施方案中，通过血管通 路(vascular access)(例如，全身性或局部地)施用产生EP0的细胞。可用本文所公开的方法治疗的疾病包括但不限于贫血。贫血包括但不限于与肾功 能衰竭或终末期肾病相关的贫血、由化疗或放射治疗所致的贫血、慢性障碍例如慢性感染、 自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、AIDS所致贫血、恶性肿瘤所致贫血，早产儿贫血、甲状腺 功能减退所致贫血、营养不良所致贫血(例如，缺铁症)和与血液病相关的贫血。“治疗”是指为患者例如遭受或处于发生疾病(例如，肾病、贫血等)风险中的患者 带来益处的任何类型的治疗。治疗包括为了改善患者的状况(例如，一个或更多个症状的 缓解)、延迟疾病的发生或进展等目的而采取的行为和克制不要采取的行为。其他内分泌系统可受益于本文公开的治疗，例如，产生维生素D的细胞疗法或血 管紧张肽系统。参见，例如，授予Atala等人的美国专利申请
发明者A·阿塔拉, J·尤 申请人:韦克福里斯特大学健康科学院