生殖系干细胞的分离、表征和繁殖的制作方法

专利名称：生殖系干细胞的分离、表征和繁殖的制作方法
技术领域：
本发明涉及下述领域在胎儿和出生后发育期间分离的雄性和雌性生殖系干细胞 及这些细胞用于治疗目的的用途。特定地，本发明涉及对不同生殖系干细胞群体和由其产 生的细胞系的鉴定、分离和分化，所述细胞在细胞替代疗法中具有不同的潜在用途。
背景技术：
能够安全地用于再生药物中的多能(pluripotent)细胞系的产生在细胞替代 疗法中具有巨大的潜在影响。在这方面，胚胎干(EQ细胞被认为是潜在的细胞来源，因 为它们能够无限繁殖，并且可以分化为所有三种胚层的表型。然而，在能够实现ES细胞 应用之前，至少必须解决伦理问题，并且也必须克服移植后的畸胎瘤形成。来源于组织 的成年(adult)干细胞也被认为是基于细胞的疗法的替代性来源，这尤其是因为它们在 移植后不形成畸胎瘤，并且它们保持分化为相同组织谱系的表型的能力。成年干细胞也 可以被诱导而横向分化(trans-differentiate)为不同谱系的细胞型，或者被再程序化 (reprogramme)而成为用于可能的临床应用的多能干细胞。在所有成年干细胞中，只有生殖 系干细胞(GSC)保留了将原有的遗传信息传递给后代的能力。若干项证据表明，GSC通过 正常发育期间发生的再程序化过程获得多能性(pluripotentiality)。因此，GSC理论上是 产生多能或专能(multipotent)成年干细胞系的模型。干细胞是能产生其它类型细胞的原始细胞。存在有数种干细胞，它们也被称为祖 细胞。全能细胞(totipotent cells)被认为是机体的“主人”细胞，因为它们含有产生机 体加胎盘(为人类胚胎提供营养)所有细胞所需的全部遗传信息。人类细胞仅在受精卵最 初的极少数次分裂期间具有这种全能能力。全能细胞分裂三次或四次后，就出现了一系列 的阶段，其中细胞变得逐渐专门化。分裂的下一阶段产生多能细胞，其高度多用，能产生除 了胎盘或子宫其它支持组织的细胞之外的任何细胞类型。在下一阶段，细胞变为专能的，这 意味着它们能产生数种其它细胞类型，但是这些类型数量有限。专能细胞的例子是造血细 胞-能发育为数种血细胞的血细胞，但是不能发育为脑细胞。在使胚胎发展的细胞分裂长 链末尾，是“终末分化”细胞——被认为永远定型为特定功能的细胞。干细胞是细胞的稀少种群，它们能产生器官保持和功能所必需的大范围的细胞组 织种类。这些细胞被定义为具有下述两种基本特征的未分化细胞(i)它们具有自身更新 的能力，(ii)它们还具有分化为一种或多种具有成熟表型的专门化细胞类型的能力。干细 胞有三大组(i)成年的或体(出生后的)干细胞，存在于所有出生后生物中，(ii)胚胎干 细胞，其能从胚胎前或胚胎发育阶段获得，以及(iii)胎儿干细胞(产前)，其能从发育的胎 儿中分离出。用于细胞再生疗法时，每组干细胞都具有其自身的优点和缺点，特别是在它们的分化潜力，以及在合适的或目标细胞环境中从头移植(engraft)和发挥功能的能力。在出生后动物中，存在谱系(lineage)定型的祖干细胞和谱系未定型的多能干细 胞，它们存在于例如结缔组织、肌肉组织和脂肪组织中，向出生后生物提供连续的器官或器 官系统保持和修复所需的细胞。这些细胞被定名为体干细胞或成年干细胞，其可以是静止 的或非静止的。典型地，成年干细胞具有如下两种特征(i)它们能长期产生它们自身的相 同拷贝(长期自身更新)；以及(ii)它们能产生具有特征形态和专门功能的成熟细胞类 型。不幸的是，事实上，成年动物体内的每种体细胞，包括干细胞，都具有留有时间和 重复细胞分裂破坏痕迹的基因组。在生物的寿命期间，细胞暴露于大范围的因素，例如环境 致癌物、UV光和日光辐照，所有这些因素均能够诱导基因组损伤。作为细胞代谢副产物的 反应活性氧物质也是危及细胞基因组完整性的内在因素。科学家们越来越倾向于认为器官 和组织必须具有自我更新的体系，并且这些体系可能涉及固有的组织干细胞或来自于循环 的干细胞。随着生物的衰老，可能对固有干细胞的损伤累积并且修复体系收受到威胁。端粒是染色体的物理末端，其含有高度保守的、串联重复的DNA序列。端粒参与线 性DNA分子的复制和稳定性，作为细胞中计数机制发挥作用；随着每轮细胞分裂，端粒长度 缩短，在预定的阈值，激活信号以起始细胞的老化。干细胞和体细胞产生端粒酶，这会抑制 端粒的缩短，但是它们的端粒在衰老和细胞胁迫期间仍会逐渐缩短。生殖系干细胞存在于繁殖器官即卵巢和睾丸中，它们潜在地代表哺乳动物体内最 为受到遗传保护的干细胞种类之一。遗传保守已由下述发现表明来自这些组织的干细胞 中的高端粒酶活性以及染色质染色体修饰的广泛的DNA修饰。科学家们对于成年繁殖组织 中存在何种干细胞以及它们在分化中的潜能持不同观点。哺乳动物发育的个体发育提供了干细胞的中心作用。在胚胎发生的早期，来自接 近上胚层(印iblast)的、预定成为生殖细胞(原生殖细胞)的细胞沿着生殖腺嵴移动。这 些细胞表达高水平的碱性磷酸酶，并且表达转录因子0ct4。随着移动和生殖腺嵴的定居，原 生殖细胞经历分化，成为雄性或雌性生殖细胞前体(原生殖系前体细胞)。在雄性繁殖发育 期间，原生殖系前体细胞开始与前体足细胞紧密联系，导致生精索(seminiferouscord)开 始形成。当原生殖细胞被包括进生精索时，科学家目前认为它们分化为有丝分裂静止的生 殖母细胞，即精原干细胞(SSC)的前体。这些生殖母细胞随后分裂数天，然后就停留于细胞 周期的(ViG1阶段。在小鼠和大鼠中，这些生殖母细胞在出生后数天内重新开始分裂，以产 生SSC，并且所述SSC分化并经历精子生成过程中的减数分裂。成年组织中残余原生殖系性 细胞的存在是有争论的。如果它们存在于成年组织中，这些细胞能够直接负责产生生殖母 细胞和/或SSC。理论上原生殖系性细胞可能不会是谱系定型的，并且可能在基因组品质上 与胚胎干细胞相当。因此，用于它们的传统鉴定和分离的方法是有用的。精原干细胞(SSC)是雄性生殖系干细胞，其通过其自我更新而维持生产精子的精 原细胞和精子的持续生产。已假定类似类型的干细胞可存在于雌性生殖系中，但是这些细 胞被证明难以鉴定和分离。对SSC即生殖系前体干细胞而言，是否存在前体干细胞是难以 查明的。假设非常小量地存在，它们所隐藏的位置是难以分离和纯化的。如果能够被分离 和鉴定，则SSC前体是用于人治疗的高品质干细胞潜在的良好来源。不幸的是，输精管内这 些细胞的位置和鉴定特征是难以分辨的。
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雄性生殖系干细胞(GSC)通过精原干细胞(SSC)的自我更新和定型至分化的精 原细胞的产生，来维持精子生成。据报道，在某些体外条件下，来自新生和成年小鼠睾丸的 GSC能够产生专能生殖细胞系(mGC)，所述mGC具有与胚胎干细胞(ESC)相似的特征和分化 潜能。然而，在不同实验室产生的mGC显示不同的生殖细胞特征，即一些保留它们的SSC特 性，一些则将所述特性完全丢失。因此仍然存在下述可能性，衍生的专能生殖细胞系可来自 于小鼠睾丸中存在的不同亚群的生殖系干细胞。胚胎干细胞细胞系的产生被认为提供了用于研究和治疗的胚胎干细胞的可更新 来源，但是近来的报道表明，现有的细胞系比原来所认为的活力更低，并且许多已在培养期 间被免疫原性动物分子所污染。胚胎干细胞(ESC)最初被提出作为“万能供体”细胞，因 为它们被认为是免疫豁免(immunologically privileged)的，并因此不受移植物排斥；并 且，它们能够分化为定制的专能细胞或谱系定型的细胞。ESC从前着床胚泡阶段的胚胎的内 细胞团获得并具有最大的分化潜力，能产生在胚胎本体(proper)全部三个胚层中发现的 细胞。从实践角度来看，胚胎干细胞是人工制造的细胞培养物，因为，在它们天然的上胚层 环境中，它们仅在胚胎发生期间短暂存在。在体外对胚胎干细胞的操作已导致了宽范围的 细胞类型的产生和分化，包括心肌细胞、造血细胞、内皮细胞、神经、骨骼肌、软骨细胞、脂肪 细胞、肝和胰岛。然而，胚胎干细胞可能不适合作为直接移植物，因为它们在移植后形成畸 胎瘤。另外，存在与从人胚胎中分离胚胎干细胞相关的道德和伦理问题。因此，具有类ESC 特性的干细胞类型是用于再生药物的高度期望的替代方式。因此，人们需要生物学上有用的、非胚胎并且非胎儿的、多能干细胞的新颖来源， 所述干细胞具有接近生理初期状态的基因组。此外，人们需要具有后者特性的干细胞来源 用于人和兽医疗法中。

发明内容
本文公开内容提供了对来自雄性和雌性的生殖系干细胞进行分离、纯化和培养扩 展的方法。还提供了下述证据根据所公开的方法分离的生殖系干细胞展示出与多能干细 胞相似的分子特征，并且具有与未受破坏的、出生前或胚胎干细胞的端粒酶活性相当的端 粒酶活性。本发明还公开了来自雄性性腺的不同种类的生殖系干细胞，所述干细胞具有1) 成为能够使得精子生成的精原干细胞的潜能，和2、专能细胞特征，并且能够分化为专能细 胞类型。在一个实施方案中，提供了由经分离的性腺细胞组成的经分离的生殖系细胞群 体，所述生殖系细胞的特征是至少一种选自以下的标记物的表达生殖系干细胞表面标记 物 GFR-al、a6-整联蛋白、Thy-l、SSEA-4、CD9、Dolichos biflourus 凝集素(DBA)、生殖 细胞标记物VASA和DAZL，和精原干细胞标记物PLZF ；至少一种选自以下的生殖系干细胞基 因的表达端粒酶、VASA, c-RET, GFR- a 1、DAZL和PLZF和高水平的端粒酶表达。在另一个实施方案中，经分离的生殖系细胞群体是雄性的。在另一个实施方案中， 细胞是雌性的。在另一个实施方案中，细胞是哺乳动物的。还在另一个实施方案中，细胞从 胎儿例如妊娠11和22周之间的胎儿中分离。在另一个实施方案中，细胞从出生后的个体 中分离。在另一实施方案中，经分离的生殖系细胞群体任选地表达选自Oct-4、Nanog和碱性磷酸酶的多能标记物。在另一实施方案中，经分离的生殖系细胞群体表达GFR-α 1和α 6_整联蛋白二者 的细胞表面标记物。还在另一实施方案中，经分离的生殖系细胞群体表达Thy-I和α 6-整 联蛋白二者的细胞表面标记物，和编码端粒酶的基因。还在另一实施方案中，细胞表达针 对SSEA4、GFR- α 1的细胞表面标记物和生殖细胞标记物VASA。在一个实施方案中，大于约 50%的细胞表达GFR-α 1以及VASA。还在另一个实施方案中，细胞不表达至少一种选自以 下的标记物黏附/激活分子(EpCAM)和c-Kit。在一个实施方案中，经分离的生殖细胞群体表达Oct-4和C-Kit 二者，并显示至少 一种选自以下的特性约72小时的细胞周期倍增时间；生殖系特异基因的表达比胚胎干细 胞(ESC)中所表达的水平更高；多能细胞的表达比ESC水平更低；与白血病抑制因子(LIF) 或成纤维细胞生长因子(FGM)因子相比，其自我更新更加依赖于胶质细胞依赖性神经营 养因子(⑶NF) ；SSEA-I表达水平比ESC更低。在一个实施方案中，多能基因选自0ct_4、 Nanog、Dppa-5、Sox2、碱性磷酸酶禾口 Crypto。在另一个实施方案中，经分离的生殖系细胞群体分离自雄性，其不表达c-Kit并 且能够分化为产精子的细胞。在另一实施方案中，这些细胞表达α-干扰素以及Thy-1。在另一实施方案中，经分离的生殖系细胞群体分离自雌性，并且表达Oct-4、 Nanog、碱性磷酸酶和VASA。在另一个实施方案中，经分离的生殖系细胞群体分离自雌性，并 且能够分化为类卵母细胞的细胞。在另一个实施方案中，更高的端粒酶活性水平是胚胎干细胞端粒酶活性的至少 20%。另一个实施方案中，更高的端粒酶活性水平至少是胚胎干细胞端粒酶活性的50%。在另一个实施方案中经分离的生殖系细胞群体是多能或专能的。在另一个实施方 案中，经分离的生殖系细胞群体能够分化为外胚层细胞、内胚层细胞和中胚层细胞。还在另 一个实施方案中，细胞能够分化为产多巴胺的细胞。还在另一个实施方案中，细胞不能形成 畸胎瘤。在一个实施方案中，经分离的生殖系细胞群体分离自灵长类睾丸，且细胞表达 Thy-U α6-整联蛋白和SSEA-4，并且不表达C-Kit。在另一实施方案中，这些细胞还表达 GFRa、Nanog和VASA。还在另一个实施方案中，这些细胞能够分化为生精细胞。在一个实施方案中，提供了包含本文公开的生殖系细胞的细胞长期培养物。在一个实施方案中，提供了分离生殖系干细胞群体的方法，所述方法包括下述步 骤选择显示出生殖系干细胞表面标记物表型的性腺细胞；以及确定所述性腺细胞表达至 少一种生殖系干细胞基因。在另一个实施方案中，性腺细胞表达Oct-4以及c-Kit。在其它一些实施方案中， 性腺细胞是雌性或雄性的。在另一个实施方案中，生殖系表面标记物表型包括至少一种选自以下的表型上 皮细胞黏附/激活分子(EpCAM)阴性，GDNF受体(GFR- a 1)阳性，c-Kit阴性，Dolichos biflourus凝集素(DBA)阳性，CD9阳性，CD90阳性，CD49f阳性，SSEA4阳性和a 6-整联蛋 白阳性。在另一个实施方案中，生殖系干细胞基因选自端粒酶、VASA、c-RET、GFR-a UDAZL 和 PLZF。在另一个实施方案中，选择生殖系干细胞表面标记物表型的步骤包括选择不表达c-Kit但表达⑶90以及⑶49f的细胞。在另一个实施方案中，选择生殖系干细胞表面标记物表型的步骤包括选择不表达 c-Kit并且不表达SSEA4的细胞。在另一个实施方案中，选择生殖系干细胞表面标记物表型的步骤包括选择不表达 c-Kit但表达SSEA4、⑶90以及⑶49f的细胞。在另一个实施方案中，选择生殖系干细胞表面标记物表型的步骤包括选择表达 α 6-整联蛋白和⑶90但不表达c-Kit的细胞。在另一个实施方案中，细胞还表达SSEA-4。附图概述

图1描绘了扩展过程期间的人胎儿生殖母细胞。图IA描绘了培养开始时碱阳性 的生殖母细胞。图IB描绘了在PM培养基中培养一周后的蘑菇形集落。图IC描绘了培养 两周后的扁平集落。图ID描绘了在无血清培养基中若干次传代后的扁平集落。图2描绘了来自人胎儿生殖母细胞的细胞上多能标记物的表达。碱性磷酸酶(图 2Α) ；SSEA-4(图 2B) ；TRAI-60(图 2C) ；TRAI-81(图 2D) ；0ct_4 和人线粒体蛋白质(MP，人 2E) ；Nanog 禾口人 MP (图 2F)。图3描绘了来自于胎儿生殖母细胞的集落在无血清和无养料(feeder)时的生长。 HF-89-p2 集落(图 3A) ；HF_22-p7 集落(图。图4描绘了来自人胎儿生殖母细胞的细胞对多能和生殖细胞标记物的表达。图5描绘了来自人胎儿生殖母细胞的细胞中的端粒酶活性。图6描绘了胚状体的形成(图6A和6B)和来自人胎儿生殖母细胞的细胞上与来 自所有三种胚层的细胞类型相关的标记物的表达(图6C)。图7描绘了来自人胎儿生殖母细胞的细胞成为以下的定向分化心肌细胞(图 7A)、平滑肌(图7B)、软骨细胞(图7C)、神经元(图7D)、星形细胞(图7E)、神经细胞类型 (图7F)、寡聚树状骨针(oligodendritic)(图7G)，和神经祖细胞(图7H)。图8描绘了来自人胎儿生殖母细胞的细胞分化的RT-PCR结果，所述细胞已分化为 神经谱系的细胞类型。图9描绘了来自人胎儿生殖母细胞的细胞分化的RT-PCR结果，所述细胞已分化为 源于所有三种胚层的细胞类型。图10描绘了来自人胎儿生殖母细胞的细胞分化的RT-PCR结果，所述细胞已分化 为神经谱系的细胞类型。图11描绘了来自人胎儿生殖母细胞的细胞分化的RT-PCR结果，所述细胞已分化 为心谱系的细胞类型。图12描绘了使用流式细胞计量术从转基因0G2小鼠中分离的睾丸干细胞GFP(绿 色荧光蛋白)阳性亚群的富集。GFP表达指出的Oct-4阳性细胞在与野生型(图12)比较的 新生(图12B)和成年(图12C)0G2小鼠二者中作为不同的细胞群体被发现。在Oct-4阳性 细胞中，发现由c-Kit阳性(R5)和c-Kit阴性(R2)组成的两种清晰的亚群(图12D-12E)。 还展示了 GFP和c-Kit表达之间的关联(图12F-12H)。图13描绘了培养物中专能生殖细胞(mGC)系发育期间的形态改变。在培养前于 细胞制备物中观察小鼠Oct-4-GFP+细胞(图13A;箭头；第1-3天)。培养后不久观察到Oct-4的下调(图13B ；第3-7天)。在培养第二周细胞黏附后，发生明显的形态改变(图 13C第7-15天；图13D第15-20天)。培养约三周后，形成含有小圆细胞的集落(图13E ；第 20-30天)。培养约一个月后观察到Oct-4的上调(图13F ；第30-40天)。图13G-20I中 分别展示了来自于新生0G2、成年0G2或新生0G2-LacZ的三种确立的mGC株系的图像(图 13G，新生 0G2 ；图 13H，成年 0G2 ；图 131，0G2LacZ)。标度棒50μπι。图14描绘了在补充有15%胎牛血清(FBS)的ΡΜ-1 培养基中，在小鼠胚胎成纤维 细胞(MEF)饲养层上培养的专能生殖系前体细胞。在培养期间的不同时间点上，使用荧光 辅助的细胞分选(FACS)测定GFP阳性细胞的数量(图14Α，第3天；图14Β，第5天；图15C， 第9天；图14D，第15天)。图14Ε描绘了细胞数量与时间相比的图。标度棒等于60 μ m。图15描绘了 mGC的表型特征和分子特征。多能和生殖细胞标记物的免疫定位展 示于图 15A-15D (Oct-4), 15E-15H(Nanog)、图 15M-150(SSEA-1)和图 15I-15L(生殖细胞 标记物VASA)中。标度棒图15A-15H :25μπι ；图151-150 :20μπι。图15Q中展示了通过 RT-PCR测定的多能和生殖特异性标记物的表达。图15Q中展示了免疫沉淀(IP)之前和之 后对mGC细胞中Oct-4、Nanog和Sox2的蛋白质含量的^festern印迹分析。图16描绘了成年的来自脂肪的干细胞(ADSC)、小鼠ES细胞、c-Kin分选后新鲜分 离的生殖系干细胞和第10代专能生殖系干细胞(新生06 的端粒酶活性和核型分析。生 殖系干细胞中的端粒酶活性与小鼠ES细胞中相当，并且高于ADSC细胞中的活性(图16A)。 图16B描绘了相同的新生0G2细胞系的核型。该图代表了分析的80个中期涂片。15代后 细胞显示正常的核型。图17描绘了培养之前(NGC)和之后(GC)专能生殖系前体细胞的印迹分析，并针 对有差异地被甲基化的区域Meg3、PeglO、Oct-4、Igf2r和Rasgrfl与小鼠ES细胞比较。图18描绘了 mGC的自发分化。图18D-18F中展示了胚状体(EB ；图18A)的原肠胚 形成和指示极化上皮的标记物的表达(E-钙黏着蛋白和层粘连蛋白；图18B-18C)和三种胚 层的早期发育，即外胚层(ZIC1，PAX6，S0X1)、内胚层(GATA4，F0XA2)和中胚层(BRACHYURY、 BMP4和C0L2A1)。在培养中，再编程mGC也自发分化为心肌细胞(图18G-18J)、脂肪细胞 (图18K)禾口神经细胞(图18L禾口 18M)。标度棒图18A禾口 181 :50μπι ；图18C禾口 18Ε :30ym ； 图 18B 禾口 18D :25 μ m ；图 18G、18H 禾口 18L :45 μ m ；图 18K 12 μ m。图19描绘了诱导的mGC成为谱系特异性表型的分化。图19A-19G中展示了表达 神经标记物的细胞的共聚焦图像。图19J中展示了神经基因标记物的表达。图191中展示 了分化为心肌细胞的mGC的共聚焦图像。图19L中展示了心基因标记物的表达。图19H中 展示了 mGC分化后阿利新蓝(Alcian blue)阳性的软骨细胞。图19K中展示了软骨细胞特 异性基因的表达。标度棒图19A、19C禾口 19G:20ym;图19B禾口 19Η:50μπι;图19D-19F和 19J :10μ ο图20描绘了小鼠ES细胞移植进皮肤、肌肉和睾丸中后形成畸胎瘤(图20A-20F)， 但是专能的LacZ-GFP mGCs (图20G-20L)移植进皮肤、肌肉和睾丸中后则不形成畸胎瘤。通 过H&E染色在薄石蜡切片上鉴定来自ESC的畸胎瘤的形态，而移植的专能生殖细胞(mGCs) 的命运则通过以蓝色显示的LacZ染色鉴定。移植后六周，在皮肤(在毛囊的膨胀区域和 邻近的皮脂腺中，箭头；图20G-20H)、肌肉(箭；图20I-20J)和睾丸(箭；图20K)中发现 GFP-LacZ+mGCs。在培养之前和之后移植生殖干细胞后的睾丸再生展示于图20M-20R中。免疫缺陷小鼠的正常睾丸的横向切片展示于图20M中。白消安处理一个月后，大部分输精 管的内部精子生成衰竭(图20N)。用新鲜分离的Oct-4阳性细胞移植的小鼠的睾丸在多 于50%的输精管横向切片中显示精子生成，表明在该群体中存在具有SSC特性的细胞(图 200)。尽管用Oct-4阳性c-Kit阴性细胞移植的小鼠的多于80%输精管显示一些程度的 精子生成(图20P)，但是接受Oct-4阳性c-Kit阳性细胞的小鼠中的大部分输精管横向切 片是空的(图20Q)。移植的mGC也不能够增殖受体睾丸，表明它们不具有SSC特性(图 20R)。标度棒图 20A 和图 20K :275 μ m ；图 20B、20D 和 201 :60μπι ；图 20C :140μπι ；图 20Ε 100 μ m ；图 20F :50 μ m ；图 20G 禾口 20L 125 μ m ；图 20H 禾口 20J :40 μ m ；图 20M—20R 60 μ m。图21描绘了将mGC掺入胚泡和宿主胚胎中后嵌合体的形成。图21A-21D中展示 了早期胚胎发育和胚泡形成期间LacZ-GFP+mGC细胞的掺入。在8细胞阶段注入的大部分 GFP-IacZ细胞已在胚胎发育的第2天被掺入(箭头)，一些细胞尚未掺入(箭)。在第3. 5 天时，进一步发现GFP阳性细胞被掺入胚泡的内部细胞团(箭)中。图21E中作为全胚胎染 色展示了显示不同程度嵌合状态的四种嵌合胚胎。为了使内部器官可见，还显示了两种胚 胎(用星号标明)的纵向切片(图21F和21G)。图21H-21K显示切片器官中的嵌合模式， 图21L-210显示脑、心、肝和生殖腺脊中组织学切片中的嵌合细胞群体(嵌合的LacZ-GFP 细胞显示为蓝色)。图21P和21Q中分别展示了嵌合幼兽的组织中GFP和LacZ DNA的扩 增。标度棒图 21A 禾口 21C :50μπι ；图 21B 禾口 21D :25 μ m ；图 21E-21D 1250 μ m ；图 21H-21K 625 μ m； 21L-21N :50μπι ；图 210 :10ymo图22在流式细胞计数图中图解地描绘了从转基因0G2小鼠中新鲜分离的新生和 成年卵巢细胞，其中Oct-4启动子驱动GFP的表达。图22A显示成年卵巢生殖系干细胞，其 通过GFP的荧光强度图解地描绘。图22B显示新生卵巢生殖系干细胞，其通过GFP的荧光 强度图解地描绘。图22C图解地描绘了来自图22B的表达c-Kit的新生GFP阳性细胞的荧 光强度，所述细胞也已知为⑶117。图23描绘了出生后第2天转基因0G2小鼠的卵巢横向切片中可以通过绿色荧光 蛋白的表达来鉴定的生殖系干细胞。图23A和2 展示了总体荧光，图23C展示经计算机 强化的去除了自发荧光的图像。图M描绘了对从分离自0G2转基因小鼠的小鼠胚胎干细胞(第3道)、小鼠胚 胎成纤维细胞(MEF，第4道)、GFP-阳性生殖系干细胞(GFP+细胞，第5道)和GFP-阴性 (GFP-细胞，第6道)中分离的mRNA的RT-PCR分析结果。图25描绘了确立并作为集落在MEF细胞饲养层上生长的、经分离和基本纯化的卵 巢生殖系干细胞的显微镜图像。图25A展示了培养4天后的集落；图25B展示了第一类代表 性集落形态；图25C展示了第二类代表性集落形态；图25D展示了用胶原酶传代后的集落 形态；图25E展示了胶原酶传代后具有清楚确定边缘的第三类代表性集落形态；图25F展 示了胶原酶传代后具有不确定边缘的第四类代表性集落形态；图25G展示了传代#1后的集 落形态；图25H展示了传代#2后的集落形态；图251展示了传代#3后的集落形态；图25 J 和2 展示了传代M后两种不同放大率的卵巢生殖系干细胞集落。图沈描绘了经分离和基本纯化的卵巢生殖系干细胞的免疫细胞化学染色，所述 细胞被染色以揭示以下的表达多能干细胞标记物Oct-4 (图26A和^B，和验证正确染色 的阴性对照图^C)；多能干细胞标记物Nan0g(图26D和^E ；和验证正确染色的阴性对照图^F)；生殖细胞标记物VASA(图26G和^H)；和多能干细胞标记物碱性磷酸酶(图 26I-26K)。图27描绘了分化中的卵巢生殖系干细胞的图像。图27A展示了 GFP阳性细胞，其 类似于在雌性生殖细胞集落中心生长的初级卵母细胞；图27B展示了滤泡样结构的图像； 图27C展示了 GFP阳性细胞，其类似于在雌性生殖细胞集落附近生长的初级卵母细胞；并且 图27描绘了有颜色的集落。图观在散射图中图解地描绘了图27培养的卵巢细胞的细胞荧光尺寸分析的结 果，验证和表征了大(> 15mm)的卵母细胞样细胞图28A描绘了 MEF对照细胞(< 15mm)； 图28B描绘了图27的卵母细胞样细胞。图四描绘了精原干细胞和生殖系细胞标记物在成年灵长类睾丸中的免疫组织化 学定位。图30描绘了灵长类睾丸输精管的基底膜上用干细胞标记物阳性染色的细胞的分布。图31描绘了使用流式细胞计量术对灵长类生殖干细胞的表型表征。图32描绘了灵长类生殖系干细胞的流式细胞计量术分析。图33描绘了精原干细胞和生殖系细胞标记物在富集的灵长类生殖系细胞群体中 的免疫组织化学定位。图34描绘了不同的富集的灵长类生殖系细胞群体中GFRa阳性/VASA阳性的细 胞。图35描绘了灵长类生殖系干细胞亚群的羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯 (CSFE)活性。图36描绘了用白消安处理过的带有灵长类生殖系干细胞的灵长类睾丸的增殖。 图36A 用未分选的细胞移植的受体小鼠的输精管；图36B 通过三种标记物分选的细胞； 图36C :SSEA-4阳性分选的细胞；和图36D 假移植的对照睾丸。图37描绘了通过碘化丙啶染色的灵长类生殖系干细胞群体的流式细胞计量术测 定的DNA含量。图38描绘了对灵长类生殖系干细胞中PLZF表达的定量PCR分析。图39描绘了对灵长类生殖系干细胞中端粒酶活性的定量PCR分析。图40描绘了通过增殖细胞核抗原(PCNA)测定的增殖中的灵长类生殖系干细胞的 百分比。图41描绘了灵长类生殖系干细胞亚群的基因表达谱。图42描绘了在MEF饲养层上培养10天后扩展的灵长类生殖系干细胞集落的形 态。图43描绘了扩展的灵长类生殖系干细胞集落的形态。图44描绘了对扩展的灵长类生殖系干细胞集落的SSEA-4染色。图45描绘了对传代4后扩展的灵长类生殖系干细胞集落的GFR- α染色。图46描绘了对传代4后扩展的灵长类生殖系干细胞集落的α 6_整联蛋白染色。图47描绘了对传代4后扩展的生殖系干细胞集落的生殖细胞标记物VASA染色。图48描绘了分化为产多巴胺细胞之前的灵长类生殖系干细胞。图48Α描绘了培养5天的细胞；图48B描绘了添加维甲酸后的细胞；图48C描绘了在新鲜培养基中培养5天 后用维甲酸处理的细胞，图48D描绘了再培养15天后分化的细胞。图49描绘了对分化为产多巴胺细胞并针对多巴胺受体1 (图49A)、使灵长类细胞 核染色的人核蛋白(图49B)进行了染色的灵长类生殖系干细胞的免疫细胞化学分析和两 种标记物的共定位(图49C)。图50描绘了对分化为产多巴胺细胞并针对多巴胺受体2 (图50A)、使灵长类细胞 核染色的人核蛋白(图50B)进行了染色的灵长类生殖系干细胞的免疫细胞化学分析和两 种标记物的共定位(图50C)。图51描绘了对分化为产多巴胺细胞并针对酪氨酸羟化酶(图51A)、使灵长类细胞 核染色的人核蛋白(图51B)进行了染色的灵长类生殖系干细胞的免疫细胞化学分析和两 种标记物的共定位(图51C)。图52描绘了对分化为产多巴胺细胞并针对囊泡单胺转运蛋白(图52A)、使灵长类 细胞核染色的人核蛋白(图52B)进行了染色的灵长类生殖系干细胞的免疫细胞化学分析 和两种标记物的共定位(图52C)。图53描绘了对分化为产多巴胺细胞并针对多巴脱羧酶(图53A)、使灵长类细胞核 染色的人核蛋白(图53B)进行了染色的灵长类生殖系干细胞的免疫细胞化学分析和两种 标记物的共定位(图53C)。图M描绘了针对图49-53(图54A)、使灵长类细胞核染色的人核蛋白(图MB)的 阴性对照和共定位(图MC)。图55描绘了对分化为产多巴胺细胞并针对多巴胺转运蛋白(图55A)、使灵长类细 胞核染色的人核蛋白(图^B)进行了染色的灵长类生殖系干细胞的免疫细胞化学分析两 种标记物的共定位(图^C)。图56描绘了针对图55 (图56A)、使灵长类细胞核染色的人核蛋白(图56B)的阴 性对照和共定位(图56C)。图57描绘了用SSEA4(图57A)和VASA (图57B)染色的人TH-I和二者的合并(图 57C)。图58描绘了用GFR- α (图58Α)和VASA (图58Β)染色的ΤΗΤ2和二者的合并(图 58C)。图59描绘了针对VASA(图59A)和Nanog(图59B)染色的THT-I和二者的合并 (图 59C)。图60描绘了针对SSEA-4 (图60A)和α -6干扰素(图60Β)染色的人bHT_l和二 者的合并(图60C)。图61描绘了针对图57-60的阴性对照，其由仅用第二抗体染色的人睾丸切片组 成。图62描绘了移植进经白消安处理的受体小鼠睾丸中并在一个月后针对SSEA4(图 62A)和人核蛋白(图62B)进行染色的人THT-2SSEA4阳性磁珠分选的细胞，以及二者的合 并(图62C)。图63描绘了针对图62的阴性对照，其由仅用第二抗体染色的人睾丸切片组成。图64描绘了移植进经白消安处理的受体小鼠睾丸中并在一个月后针对α-6整联蛋白(图64A)和人核蛋白(图64B)进行染色的人THT-2SSEA4阳性磁珠分选的细胞，以及 二者的合并(图64C)。图65描绘了移植进经白消安处理的受体小鼠睾丸中并在一个月后针对 SSEA-4(图65A)和α -6整联蛋白(图65Β)进行染色的人THT-2SSEA4阳性磁珠分选的细 胞，以及二者的合并(图65C)。图66描绘了图64和65的阴性对照，其由仅用第二抗体染色的人睾丸切片组成。术语定义提供以下的术语定义，作为对读者有帮助的参考。本专利中使用的术语与本发明 相关时具有特定的含义。尽一切努力根据术语的常规和常见含义使用所述术语。然而，当 常见的常规含义与以下定义之间存在偏差时，下述定义优先于常见的用法。定型本文中使用的“定型”指，细胞被认为永久定型为特定功能。定型的细胞也 被称为“终末分化的细胞”。培养本文中使用的“培养”或“培养的”是指受控条件下的细胞繁殖，从而发生细 胞分裂和细胞数量的增加。去分化本文中使用的“去分化”指形式或功能上的专门性的丢失。在细胞中，去 分化导致较少定型的细胞。分化本文中使用的“分化”指细胞被改造为特定的形式或功能。在细胞中，分化 导致更为定型的细胞。胚胎本文中使用的“胚胎”指生长和分化早期阶段(特征为胚胎植入着床和原 肠胚形成)的个体，其中，确定并建立了三种胚层，通过胚层分化成为分别的器官和器官系 统。三种胚层是内胚层、外胚层和中胚层。胚胎干细胞本文中使用的“胚胎干细胞”指全能的、从发育中的胚胎(已达到附 着于子宫壁上的发育阶段)获得的任何细胞。在上下文中，胚胎干细胞和前胚胎干细胞是 等同的术语。类胚胎干细胞(类ESC)细胞是并非从胚胎直接分离出的全能细胞。类ESC 细胞可从经分离和扩展的原性细胞获得。扩展的本文中使用的“扩展的”是指生长中的细胞培养物，与其最初浓度相比其 细胞数增加。胎儿干细胞本文中使用的“胎儿干细胞”指专能的、从发育中的多细胞胎儿(不 再处于早期或中期器官生成阶段)获得的细胞。生殖细胞本文中使用的“生殖细胞”指，繁殖细胞，例如，精母细胞或卵母细胞或 将发育为繁殖细胞的细胞。生殖系前体干细胞本文中使用的“生殖系前体干细胞”是指繁殖细胞，例如精原 干细胞的前体或卵母细胞前体干细胞。生殖系干细胞本文中使用的“生殖系干细胞”是指繁殖细胞，例如精原干细胞 (SSC)或卵母细胞前体干细胞。生殖母细胞本文中使用的“生殖母细胞”是指来自11-22周妊娠的胎儿生殖细 胞，其尚未分化为精原干细胞，是有丝分裂休眠的，并且不再被认为是原生殖细胞。长期培养物本文中使用的“长期培养物”是指细胞在受控条件下繁殖长于至少两 个月或多于10代。优选地，长期培养物被培养多于4个月，多于6个月或多于1年。优选地，长期培养物被传代多于15代，多于18代或多于20代。长期培养物的持续时间高度依 赖于个体细胞，并且在细胞系之间可存在变异性。成熟本文中使用的“成熟”是指导向终未分化的细胞的经协调的生物化学步骤的 过程。专能本文中使用的“专能”指，细胞能产生数种其它细胞，但是这些类型数量有 限。专能细胞的例子是造血细胞-能发育为数种血细胞但是不能发育为脑细胞的血液干细 胞。专能成年祖细胞本文中使用的“专能成年祖细胞”指从骨髓中分离的、具有分化 为间质、内皮和内胚层谱系的潜力的专能细胞。多能本文中使用的“多能”指能产生除了胎盘细胞或子宫的其它支持细胞之外的 任何细胞类型的细胞。出生后干细胞本文中使用的“出生后干细胞”指从出生后的多细胞生物获得的任 何细胞。原生殖细胞本文中使用的“原生殖细胞”(PGC)指在胚胎发生早期存在的、预定 成为生殖细胞的细胞。原生殖系性干细胞本文中使用的“原生殖系性干细胞”(也简称为“生殖系性细 胞”，缩写为PGLSC)是指下述细胞，其来自于成年雄性或雌性繁殖组织，并且能够产生生殖 系干细胞及其后代，这通过其增殖在例如辐射或化学疗法后繁殖上不育的睾丸或卵巢组织 的能力证实。成年繁殖组织中生殖系性细胞可以是静止或活动分裂的。再程序化本文中使用的“再程序化”指重建细胞的遗传程序，使得细胞展示出多 能性，并且具有产生完全发育的生物的潜力。另外，所述再程序化给予经历再程序化的细胞 下述特征，所述特征在细胞的再程序化前状态中通常不表达或不存在。选择本文中使用的“选择”是指荧光活化的细胞分选、磁珠分选或收集带有具体 标记物谱的细胞的其它手段。性细胞本文中使用的“性细胞”是指来自哺乳动物雄性或雌性繁殖组织的二倍体 或单倍体细胞。这些细胞的代表性例子包括雄性生殖母细胞、雌性生殖母细胞、卵原细胞、 A型精原细胞和B型精原细胞。体细胞本文使用的“体细胞”是指除性细胞及其前体之外，体内的任何组织细胞。体干细胞本文中使用的“体干细胞”指二倍体专能或多能干细胞。体干细胞不是 全能干细胞。干细胞本文中使用的“干细胞”是指能够自我更新(经过大量细胞分裂循环同时 维持未分化的状态的能力)并且至少是专能(分化成为多于一种专门化细胞类型的能力) 的细胞。基本纯净的本文中使用的“基本纯净的”是指细胞群体，其中大于75%、大于 85%、大于90%、大于95%、大于98%或大于99%的细胞具有期望的特征。全能本文中使用的“全能”指，含有产生机体加胎盘的所有细胞所需的全部遗传 信息的细胞。人类细胞仅在受精卵最初的极少数次分裂期间具有这种全能能力。发明详述本发明公开提供了用于对下述生殖系干细胞进行分离、表征和扩展的方法，所述生殖系干细胞在生物学上是有用和专能的，并且具有与未损伤、出生前或胚胎干细胞的端 粒酶活性相当的端粒酶活性。本发明提供了用于生殖系干细胞的鉴定和分离的方法。生殖 系干细胞群体和来自其中的细胞系表达不同的胚胎干细胞和生殖干细胞标记物谱。一种生殖系干细胞群体——生殖系干细胞(生殖系前体细胞)的Oct-4阳性/ c-Kit阳性亚组——在从新生或成年小鼠睾丸中分离并在生长因子的混合物中培养时，能 够产生表达多能胚胎(ES)干细胞标记物(Oct-4、Nanog、Sox2、Rex-I、Dppa5、SSEA-IJJ^i 磷酸酶)和高端粒酶活性二者的细胞系。相反，生殖系干细胞(生殖系性细胞)的c-Kit阴 性亚组能够使通过用化学治疗药物白消安处理而不育的小鼠睾丸增殖。Oct-4阳性/c-Kit 生殖系前体细胞在诱导型分化方案后分化为多种谱系，包括搏动的心肌细胞、神经细胞和 软骨细胞。该数据清楚地显示了生殖系干细胞中存在不同群体，所述群体中只有生殖系前 体c-Kit阳性/Oct-4阳性细胞能够产生具有ESC-样特性的专能细胞系。另外，本发明提供了生殖系干细胞的不同亚群，其在确定的培养条件下维持时产 生下述细胞系，所述细胞系具有多能特征，但是与胚胎干细胞不同，其不形成畸胎瘤。这些 高度有用的特性提供了用于治疗引用的高品质干细胞的有价值的潜在来源。存在有力的证据表明，干细胞能够体外分化为组织特异性细胞类型。另外，多能干 细胞已显示了在移植进入组织后成为专能干细胞的潜能。因此，本公开提供了用于提供功 能性免疫相容性(immimocompatible)多能和专能干细胞以及衍生组织细胞的方法和组合 物，所述细胞用于细胞再生、重建、修补和复原疗法中。在一个实施方案中，从人胎儿生殖母细胞中提供了生物学有用的专能或多能细 胞，所述细胞具有最小的氧化损伤和与胚胎干细胞相当的端粒酶活性。另外，本文公开的培 养的胎儿生殖母细胞是免疫豁免的，并且适用于治疗应用。胎儿生殖母细胞来自于存在于 睾丸输精管的衬里中(在雄性中)的原性细胞，并且代表了原性细胞和精原干细胞(雄性 中)或卵母细胞(磁性中)之间的分化状态。胎儿生殖母细胞是从妊娠11和22周之间的 胎儿中分离的，其未受衰老和细胞分裂作用的损伤。因此，胎儿生殖母细胞将基因组保持在 接近生理学初原的状态。本文公开的一些实施方案提供了鉴定、分离和制备原生殖系干细胞的方法。本文 的方法涉及从睾丸细胞样品中收集c-kit阴性细胞。在替代性的实施方案中，方法涉及从 睾丸细胞样品中收集c-Kit阴性、α-整联蛋白阳性和Thy-I阳性的细胞。c-kit+/α 6-整 联蛋白+/Thy-I+细胞能够使不育(不繁殖)的睾丸增殖，产生精原干细胞(SSC)、精原细胞 和精子。然而，从小鼠中分离的c-kit+/α 6-整联蛋白+/Thy-I+生殖系干细胞不能够产生 专能干细胞，或者谱系定型的组织细胞，例如神经元、心肌细胞、软骨细胞、骨细胞和内皮细 胞。一些实施方案提供了鉴定、分离和制备生殖系前体细胞的方法。本文的方法涉及 从睾丸细胞样品中收集c-Kit阳性细胞。在一些替代性的实施方案中，方法涉及从睾丸细 胞样品中收集c-Kit阳性和Oct-4阳性的细胞。c-kit+/0ct-4+细胞不能使不育(不繁 殖)的睾丸增殖产生SSC、精原细胞和精子。然而，c-Kit+/0ct-4+生殖系前体细胞能够产 生专能干细胞，以及谱系定型的组织细胞，例如神经元、心肌细胞、软骨细胞、骨细胞和内皮 细胞。根据本发明的教导制造的多能干细胞可用于治疗性目的，因为它们能够在长期培养物中繁殖，冷藏保存用于未来使用，或者它们可以分化为专能或组织特异性的细胞谱系。本发明的实施方案提供了为了用于细胞再生/修复疗法，使多能和专能生殖系干 细胞进一步成熟或分化的方法。另外，成熟和分化方法提供了治疗细胞，所述细胞可被用于 治疗或代替出生前和出生后器官中受损的细胞。根据本发明的教导制造的生殖系干细胞可在用于细胞再生/修复疗法的大范围 治疗性应用中使用。例如，但不旨在限制，本发明的生殖系干细胞可以被用于补充天然干 细胞由于衰老或消除疗法(ablation therapy，例如癌症放射疗法和化学疗法)而衰竭的 动物组织中存在的专能干细胞。在另一非限制性的例子中，生殖系干细胞可以分化为产多 巴胺细胞并用于治疗Parkinson’ s病。在另一个非限制性的例子中，本发明的生殖系干细 胞可用于器官再生和组织修复中。在本发明的一个实施方案中，生殖系干细胞可用于修复 受损的肌肉组织，包括营养不良的肌肉和被局部缺血事件例如心肌梗死损伤的肌肉。在本 发明的另一个实施方案中，本文公开的生殖系干细胞可以被用于在动物(包括人)中改进 创伤性伤害或外科手术之后的瘢痕形成。在该实施方案中，本发明的生殖系干细胞被全身 (例如静脉内)施用，并迁移至受损细胞分泌的循环中的细胞因子所募集的新鲜受伤的组 织位点。在本发明的另一个实施方案中，生殖系干细胞可以被局部施用至需要或修复或再 生的治疗位点。成熟或发育中的个体的生殖系细胞含有可以传递给儿童的遗传材料。例如，性细 胞(例如精子或卵子)是生殖系的一部分。性细胞的前体和成为合子的所有阶段也是生殖 系的一部分，所述合子是个体由其发育而来的细胞。不处于生殖系内的细胞是体细胞。例如，哺乳动物肝的所有细胞是体细胞。如果 生殖系中存在突变或其它遗传改变，则其可以被传递给后代，但是体细胞中的改变则不会。就其能够无限繁殖的意义而言，生殖系细胞是永生的。该功能部分由端粒酶赋予。 端粒酶致力于延长染色体的DNA引物，允许不终止的复制。相比而言，体细胞仅能够分裂 30-50次，因为它们不含有端粒酶。端粒酶水平和复制能力之间存在反相关。在一个实施方 案中，本文的生殖系细胞表达高水平的端粒酶。高水平的端粒酶被定义为端粒酶的量是胚 胎干细胞的端粒酶量的20-100%。本文公开的生殖系细胞从来自哺乳动物的性腺组织中分离，所述哺乳动物包括但 不限于啮齿类、家养动物、狗、猫和灵长类。术语“灵长类”包括但不限于人。生殖系细胞以多种生殖系、配体和多能细胞标记物的表达或它们表达的缺乏为基 础来分离。生殖系细胞标记物包括但不限于VASA、髓细胞性白血病锌因子(PLZF)、胶质衍 生的神经营养因子受体 α 1 (GFR- α 1)、α 6_ 整联蛋白、Thy-I、SSEA-4、CD9、CD90、CD49f、 Dolichos biflourus凝集素(DBA)、神经细胞黏附分子(NCAM)、生殖细胞核抗原I(GCNAl) 禾口 DAZL0多能细胞标记物包括但不限制于0ct_4(P0U5Fl)、Nanog、碱性磷酸酶、TRA1-60、 TRA1-81。另外，也可以基于生殖系和/或多能干细胞基因的表达来分离生殖系细胞。生殖 系干细胞基因包括但不限于端粒酶、VASA、c-RET、Nan0g和GFRa -1。多能细胞基因包括但 不限于 Oct-4、Nanog、Dppa-5、Sox2、碱性磷酸酶和 Crypto。本文展示的其它一些实施方案包括生殖系细胞某些群体的长期培养，从而产生长期的专能或多能细胞系。这些细胞系可以用作分化为组织特异性谱系的细胞来源。本文的 生殖系细胞的长期培养包括以下步骤以生殖系和/或多能细胞标记物和生殖系和/或多 能基因的表达或表达的缺乏为基础，分离基本纯净的想要的生殖系细胞群体；在实施例部 分中公开的生长培养基中培养细胞，所述培养基允许持续的细胞分裂同时维持未分化的专 能或多能状态。本文所述的长期培养物可以被冷藏保存，以备后续使用。在某些实施方案中，经分离的、基本纯净的生殖系细胞或生殖系细胞系群体可以 被用于再生药物中的治疗应用。根据本文的教导，本文公开的生殖系细胞的某些亚群能够 产生专能或多能细胞系的长期培养物，并且适合用作用于再生疗法的分化的细胞的来源。 本文公开的生殖系细胞的其它亚群能够形成更加分化的生殖系细胞，例如精原干细胞、精 原细胞、精子、卵原细胞和卵母细胞。所述第二细胞亚群能够使不育的繁殖器官体内增殖。将经分离的基本纯净的生殖系干细胞群体移植进受体中可以通过使用本领域常 规技术人员已知的标准注射手段通过直接注射来完成，在另一实施方案中，可以将对精原 细胞分化提供激素刺激的支持细胞例如Leydig或krtoli细胞与生殖系干细胞一起转移 至受体睾丸中。这些被转移的支持细胞可以是未经修饰的，或者可以经遗传修饰。这些被 转移的支持细胞可以是供体或受体睾丸自体的或异源的。可以通过简单的实验确定转移流 体中优选的细胞浓度，但是其很可能在每ml约IO3-IOltl个细胞的范围内。注射手段可以被 引入输出管、睾丸网或输精管中，任选地借助于泵来控制压强和/或体积，或者该递送可以 手动进行。也可以向载体流体中掺入合适的燃料或气泡(直径小于1mm)，使得易于鉴定被 移植的生殖系干细胞到达睾丸的满意递送。可以使用类似的方法将雌性起源的生殖系干细 胞递送至卵巢。合适的细胞移植运载体是本领域常规技术人员已知的，并且可包括分子例如血清 白蛋白、胆固醇和/或卵磷脂、硒和无机盐以及血清组分和/或生长因子和/或细胞因子。 典型地，细胞移植运载体具有大致为生理学的PH，即7. 0到7. 6。如本文所公开产生产生的生殖系细胞可被用于治疗多种疾病或损伤适应征，取决 于细胞组合物的需要。递送途径由疾病和需要治疗的位点确定。对局部应用而言，可能期望 在局部位点应用细胞组合物(例如通过将针置入该位点的组织中，或者通过放置定时释放 的植入物或贴片)；而在更急性疾病的临床处理中，可能期望将本发明细胞组合物全身施 用或局部施用进器官中。对其它适应征而言，本发明细胞组合物可以通过下述施用途径递 送，所述途径包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、脑室内、皮下和皮内注射，以及通过鼻内 或支气管内滴注、经皮递送或胃肠递送。用于接种物的优选的治疗性细胞组合物和剂量会 随着临床适应征而变化。接种物可典型地由冷冻的细胞制备物制备，例如通过融化细胞并 将其悬浮于生理学可接受的稀释剂例如盐水、磷酸盐缓冲的盐水或组织培养基中来制备。 必然会根据被治疗的患者的状况而发生一些剂量变化，并且在任何事件中，医师会确定个 体患者的适当剂量。本发明细胞组合物可以在单次或多次剂量中，单独施用或与一种或多种可药用载 体组合施用。合适的药物载体可包括惰性生物递送凝胶或生物可降解半固体基质，以及稀 释剂或填充剂、无菌水性溶液和多种无毒溶剂。受试药物可接受的载体通常发挥三种功能 (1)保持和防腐本发明细胞组合物中的细胞；( 将细胞保留在需要再生、重建或恢复的组 织位点处；和C3)促进医生易于处理本文的组合物，例如但不限于改善可注射的组合物的特性或外科植入物的处理。通过将本发明细胞组合物与可药用载体组合形成的药物组合物 可以以多种剂型(例如可注射的溶液等等)施用。需要时，受试药物载体可含有额外成分例 如粘合剂、赋形剂等等。必要时，受试水性溶液优选地被适当地缓冲，并且首先用充足的盐 水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。本发明细胞组合物的这类水性溶液可尤其适用于静脉内、 肌内、皮下和腹膜内注射。使用的受试无菌水性介质可以通过本领域技术人员公知的标准 技术获得。为了在一个或多个本文的方法中使用，可能期望稳定本发明细胞组合物，例如但 不限于提高其保质期、存活力和效力。用于防腐、储存和运输防腐溶液中冷冻细胞的方法是 本领域已知的。改进细胞组合物的保质期稳定性(例如在室温下或4°C)可以通过添加赋 形剂来完成，所述赋形剂例如a)疏水剂(例如甘油)；b)非连接的糖(例如蔗糖、甘露糖、 山梨糖醇、鼠李糖、木糖)；c)非连接的复合碳水化合物(例如乳糖)；和/或d)抑菌剂或 抗生素。用于接种物的优选的组合物和本文方法中使用的剂量会随着临床适应征而变化。 接种物典型地可以由治疗时实践的医师从浓缩的细胞溶液制备，例如通过将储存溶液中浓 缩的冷冻细胞悬浮液融化然后稀释在生理学可接受的稀释剂(例如磷酸盐缓冲的盐水或 组织培养基)中来制备。必然会根据被治疗的患者的状况而发生一些剂量变化，并且在任 何事件中，医师会确定个体患者的适当剂量。每单位剂量的本发明细胞组合物的有效量取决于体重、生理学和选择的接种方案 等等。本发明细胞组合物的单位剂量是指受试悬浮液中的细胞数。通常根据本发明的实践 施用给有需要的受试者的细胞数会在约IO5/位点到约IO9/位点的范围内。单一的单位剂 型和多用途的剂型被认为属于本公开的范围。在一些替代性的实施方案中，本公开提供了递送本发明细胞组合物的不同途径， 所述途径可适用于不同的疾病状态和需要治疗的位点。对于局部、椎管内、肌内或直肠内应 用而言，可能期望在细胞防腐药膏剂、软膏剂或软化剂药物组合物中在局部位点应用受试 细胞，或者放置经过浸渍的绷带或者皮肤定时脂溶性贴片。对于直肠内应用而言，可能期望 在栓剂中应用本发明细胞组合物。在其它一些实施方案中，对于肺器官重建、再生和恢复而 言，可能期望通过鼻内或支气管内滴注(例如适合在喷雾器中使用的药物组合物)施用本 发明细胞组合物。还考虑了用于不育症等等的再生药物治疗中尿道和阴道使用的栓剂。在 一个实施方案中，利用本发明细胞的迁移(例如在直肠中上皮衬里细胞中的细胞以定时释 放形式迁移进入间质组织和进入血流)能力，通过栓剂施用受试药物组合物。当常规施用 方法在某些患者中无效并且期望更连续的再生、重建或恢复治疗来源时，以连续形式施用 本发明细胞组合物，例如通过可植入的小型泵施用(例如用于在患有1型胰岛素依赖型糖 尿病的患者中递送胰岛素)。或者在其它一些情况下，可能期望在更长的时间段中递送本发 明细胞组合物，例如通过输注递送。在某些替代性的实施方案中，方法可以涉及本发明细胞组合物的静脉内大量注射 剂或灌注剂的施用，或者可涉及在手术期间(或之后)施用，或预防性施用。在某些其它一 些实施方案中，本发明的施用可涉及组合疗法，例如本发明的细胞组合物和第二药物的组 合疗法，所述第二药物包括但不限于抗凝血剂、抗感染剂或抗高血压剂。总而言之，本发明可以在不同的疾病/创伤状态用作细胞替代疗法，包括但不限 于治疗Parkinson’ s病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化(ALS) ,Alzheimer's病、囊性纤维化、纤维肌痛、糖尿病、不连接性骨折、皮肤的美容或重建手术、软骨和骨、心肌梗死、中风、 脊索创伤、外伤性损伤、不育症，和重建、再生和恢复受损和衰老的组织。
实施例下述实施例用于阐述本发明的一种或多种实施方式，但它们不被认为是将本发明 限制到下述范围。实施例1分离人胎儿牛殖母细胞妊娠11-22周流产的胎儿由批准的诊所捐赠，并保持在无菌条件下。将性腺去掉 被膜，将一个性腺置于2. 5mL磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中并用无菌剪刀剪碎。将剪碎的性 腺组织与2. 5mL 2x胶原酶溶液(每升DPBS (-) 2mg胶原酶和20个单位的DNase I) 一起在 摇动水浴中于37°C孵育30分钟。在解离周期中，将样品研磨数次以促进组织的解离。解离 后添加ImL胎牛血清使胶原酶失活，并将样品再研磨一次。然后将样品在400xg下离心5 分钟，并将细胞以每毫升5-7. 5 X IO5重悬于添加生长因子的PM-10 培养基中，如2007年3 月30日提交的共同未决的美国专利申请号11/694,687中所公开，所述申请含有的关于干 细胞培养的所有内容通过引用并入本文。PM-10 培养基公开于2006年7月17日提交的 美国专利申请No. 11/488，362中，所述申请含有的关于细胞繁殖所需的生长促进因子的所 有内容并入本文。实施例2人胎儿生殖母细胞的长期培养物在培养开始时，经分离的胎儿生殖母细胞显示高水平的碱性磷酸酶染色(图1A)。 然后在STO/c(养料细胞)平板上或无养料条件下培养生殖母细胞，用于集落形成。或者， 在SYO养料细胞上培养之前，可以在涂布了明胶的平板上，在添加PM-10 生长因子的培养 基中培养生殖母细胞。培养两周后，人胎儿生殖母细胞形成“蘑菇”集落(图1B)。此时将蘑菇集落转移 至新鲜的STO平板上。1-3代后，蘑菇集落形成生长晕，表明集落在扩展(图1C)。这些生 长晕在SY0养料上继续生长，并形成类似于人胚胎干细胞集落的扁平集落(图1D)。每两周在无血清培养基(PM-10 +生长因子)中将培养的生殖母细胞传代至新鲜 的STO细胞上用于进一步扩展。实施例3培养的人胎儿生殖母细胞对多能标记物的表达存在生长因子的长期培养物改变了生殖母细胞的基因表达谱，因此，培养的生殖 母细胞表达通常会在多能干细胞中表达的标记物(图2和4)，包括碱性磷酸酶(图2A)、 SSEA-4 (图 2B)、TRAl-60(图 2C)、TRA1-81 (图 2D)、Oct-4 和人线粒体蛋白质(MP，图 2E)， 和Nanog和人MP (图2F)。人MP被用作人特异性标记物。图3描绘了长期培养的生殖母细胞(图3A :HF-89-p2集落；图:HF_22-p7集 落)，它们在无血清和无养料的条件下培养，使得它们在再程序化或培养过程中不与动物制 品接触，并且不被免疫原性的非人分子污染。图4描绘了多种多能性相关标记物例如0ct-4、NanOg、SOX2和Rexl在扩展的生殖母细胞中的表达。这些标记物的表达指出这些细胞具有治疗潜能。图5描绘了人生殖母细胞长期培养物中的端粒酶活性。端粒酶活性存在于不处于 活性衰老中并且具有无限自我更新能力的细胞中。图6和图9显示，培养的生殖母细胞是多能的。在这些图中，扩展的生殖母细胞聚 集成为胚状体(图6A和6B)，并且针对与来自三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)之一或 所有的细胞类型相关的标记物和/或基因筛选胚状体(图6C和图9)。实施例4人胎儿生殖母细胞长期培养物分化为组织特异件细胞来自实施例2的人胎儿生殖母细胞可以分化为大量不同的细胞类型。为了产生心细胞，随后将细胞涂布在之前用0. 明胶处理过的6cm组织培养皿 中，并在含氮杂-2’-脱氧胞苷酸(AZA)的培养基中，在标准0)2细胞培养物培养箱中于34°C 到42°C的温度下培养30天，所述培养基在30天中每隔一天更换。以约0. 1 μ M到9. 0 μ M 的浓度向ΡΜ-10 中添加氮杂-2’ -脱氧胞苷酸。本文所述含AZA的培养基是分化方法的 一个示范性的实施方案。本领域技术人员应当知道，含AZA的培养基的组分浓度能够变化 并仍然达到期望的结果。在含AZA的培养基中培养约35天后，人胎儿生殖母细胞分化，并 且针对心标记物心α肌动蛋白阳性染色(图7Α)。为了产生星形胶质细胞，在PM-SHH培养基(含200ng/ml声波刺猬蛋白(sonic hedgehog protein)的PM-IO培养基)中，将来自实施例2的分离的经培养的人生殖母细胞 于34°C培养对天，之后使用单克隆抗-GFAP抗体通过荧光免疫组织化学测定胶质细胞标记 物(胶质原纤维酸性蛋白，GFAP)的表达(图7E)。人胎儿生殖母细胞被指示为体外分化成 神经细胞，包括GFAP+胶质细胞。因为对胎儿睾丸中胶质细胞的存在而言没有已知的证据， 所以GFAP+胶质细胞从性腺细胞分化而来。除了星形胶质分化以外，如神经丝的表达所证明的，人胎儿生殖母细胞在PM-SHH 培养基中也分化成神经元细胞(图7F)。少突胶质细胞如下从经培养的人胎儿生殖母细胞中分化而来。为了测定半乳糖 脑苷脂-C(Gal-C)表达(图7G)，将人胎儿生殖母细胞涂布在涂有纤连蛋白的盖玻片上，所 述盖玻片置于低葡萄糖、含GlutaMax (Invitrogen)和40MCDB-201培养基的DMEM中，并 补充ITS+LA-BSA(10 μ g/mL来自牛胰腺的胰岛素、5. 5 μ g/mL人转铁蛋白(基本不含铁)、 5ng/mL亚硒酸钠、0. 5mg/mL牛血清白蛋白和4. 7 μ g/mL亚油酸)、InM地塞米松、100 μ M抗 坏血酸，并用200ng/mL声波刺猬(SHH)和lOOng/mL FGF-8处理3天，然后更换为含20ng/ mL BDNF的N2补充物。对照细胞在涂有0. 2%明胶的盖玻片上培养而不添加SHH和FGF-8， 所述盖玻片置于低葡萄糖、含GlutaMax 、含2% FBS、MCDB-201 40%的DMEM中，并补充有 ITS+LA-BSA、InM地塞米松和100 μ M抗坏血酸。人胎儿生殖母细胞也可以分化为软骨细胞、骨细胞和肝细胞。图7Β描绘了人胎儿 生殖细胞成为表达肌动蛋白的平滑肌细胞的定向分化。图7C描绘了人胎儿生殖细胞成为 软骨细胞的定向分化，这通过阿利新蓝染色证明，所述阿利新蓝靶向存在于软骨细胞中的 葡萄糖胺聚糖。图7D描绘了已定向分化为神经元的人胎儿生殖细胞，这通过β微球蛋白 III的表达证明。图7Η描绘了已定向分化为表达巢蛋白的神经祖细胞的人胎儿生殖细胞。 这些神经祖细胞可以进一步分化为神经元谱系的其它更终端分化的细胞。
对软骨细胞分化而言，将人胎儿生殖母细胞涂布于SingleQuots 培养基中
(Cambrex)涂有0. 2 %明胶的平板上，在培养基更换之前即刻向培养基中添加20% FBS和 10ng/mL TGF-3 β。对照细胞在低葡萄糖、含L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM中培养， 补充 20% FBS0对骨细胞分化而言，将人胎儿生殖母细胞涂布在低葡萄糖、含L-谷氨酰胺和青霉 素/链霉素的DMEM中涂有0. 2 %明胶的平板上，补充20 % FBS并添加IOOnM地塞米松、 0. 25ηΜ抗坏血酸和IOmM B-甘油磷酸。每2_3天更换培养基。将对照细胞涂布在低葡萄 糖、含L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM中涂有0. 2%明胶的平板上，补充20% FBS0图8和10通过对经分化的细胞中表达的基因的RT-PCR分析，描绘了生殖母细胞 成为神经元谱系细胞的定向分化。图11通过对经分化的细胞表达的基因的RT-PCR分析， 描绘了生殖母细胞成为肌肉谱系细胞类型的定向分化。实施例5麻隨瞧■销胞騰·斜口躺可以安全地用于再生性药物中的多能细胞系的产生在细胞替代性疗法中具有巨 大的潜在影响。在这一方面，胚胎干细胞(ESC)被认为是潜在的细胞来源，因为它们能够无 限繁殖并且可以分化成所有三种胚层的表型。来自于组织的成年干细胞也被认为是基于细 胞的疗法的替代性来源，这尤其是因为它们在移植后不形成畸胎瘤，并且它们保持分化为 相同组织谱系的表型的能力。成年干细胞也可以被诱导而横向分化为不同谱系的细胞型， 或者被再程序化而成为用于可能的临床应用的多能干细胞。在所有成年干细胞中，只有生 殖系干细胞(GSC)保留了将原有的遗传信息传递给后代的能力。若干项证据表明，GSC通 过正常发育期间发生的再程序化过程获得多能性。因此，GSC理论上是产生多能或专能成 年干细胞系的模型。最近有报道称，专能生殖细胞系是由新生和成年小鼠睾丸产生的。这些细胞看 起来显示出与ES细胞相似的分子和功能特征，并且在被注射进免疫缺陷小鼠中时产生畸 胎瘤。然而，在不同实验室产生的细胞系显示不同的发挥生殖干细胞功能的能力。例如， Kanatsu-Shinohara 等(Cellll9 :1001-1012,2004)生产的细胞不显示精原干细胞(SSC) 特性，而 Guan 等(Nature 440 1199-1203，2006)和 Seandel 等(Nature doilO.1038/ nature06129,2007)生产的细胞则增殖受体睾丸，表明它们保留其SSC功能性。另外，这些 研究未最终展示SSC或生殖系干细胞中的不同亚群是否是多能生殖细胞系的来源。为了明 确地鉴定和监测培养中的生殖系干细胞，使用下述转基因小鼠模型，所述模型表达由生殖 系特异性Oct-4启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)。结合八聚体的转录因子-3/4(0ct-4) 最初被鉴定为胚胎干细胞和生殖系特异性标记物。Oct-4的表达由近端启动子、生殖特异 性远端增强子和维甲酸应答元件调节。原肠胚形成时，Oct-4表达被下调，并且之后仅在原 生殖细胞中维持。雄性和磁性的原生殖细胞(PGC)在其增殖和迁移至生殖脊时继续表达 Oct-4。在雄性中，生殖细胞中的表达持续整个胎儿发育，并且在出生后在增殖的生殖母细 胞、原精原细胞(prospermatogonia)和未分化的精原细胞中保持。使用该模型，通过分选Oct-4-GFP生殖细胞分离了纯生殖系干细胞的群体。然后 以c-Kit受体分子的表达为基础，再细分Oct-4阳性生殖细胞。酪氨酸激酶受体C-Kit及 其配体干细胞因子(SCF ；也已知为Kit配体或Meel因子)是PGC生长和存活的关键调节器。C-Kit从PGC的初始隔离到达到生殖脊期间均在PGC中表达。在出生后小鼠睾丸中， 据报道c-Kit可以用作未分化和分化中的A型精原细胞分化的标记物。Oct-4和c-Kit的 组合允许分离生殖系干细胞中的两种不同群体一种含有更原始的生殖细胞或生殖系祖先 (0ct-4+/ckit+)，其它含有预定成为SSC(0ct-4+/c-Kit-)并且能够再生不育睾丸的生殖 系干细胞。在培养之前和之后分析这些细胞的分子和表型特征，并且比较它们在具有生长 因子混合物的确定的培养条件下产生专能细胞系的能力。另外，使用精原干细胞移植技术 评价这些亚群和它们派生的mGC株系使受体睾丸增殖的功能性。雄性生殖干细胞(GSC)通过精原干细胞(SSC)的自我更新和定型至分化的精原细 胞的产生维持精子生成。在某些体外条件下，据报道来自新生和成年小鼠睾丸的GSC均能 产生专能干细胞(mGC)系，所述专能干细胞系具有与ESC类似的特征和分化潜能。然而，在 不同实验室产生的mGC显示不同的生殖细胞特征，例如一些保留它们的SSC特性，一些则将 所述特性完全丢失。因此仍然存在下述可能性，衍生的专能生殖细胞系可来自于小鼠睾丸 中存在的不同亚群的生殖系干细胞。为了研究这一问题，使用在生殖细胞特异性Oct-4启 动子控制下表达GFP的转基因小鼠模型。关于对转录因子Oct-4和c-Kit受体的表达，在 生殖系干细胞中找到了两种不同的群体。只有小鼠生殖系干细胞的0ct-4+/c-Kit+亚类在 从新生或成年睾丸中分离并在生长因子的符合混合物中培养时产生下述细胞系，所述细胞 系表达多能ES标记物(即Oct-4、Nanog、Sox2、Rex-I、Dppa5、SSEA-I、碱性磷酸酶)，显示 高端粒酶活性，并且在诱导型分化方案后分化为多种谱系，包括搏动的心肌细胞、神经细胞 和软骨细胞。所述数据清楚地显示生殖系干细胞中不同群体的存在，所述群体中只有生殖 系祖先能够产生具有一些多能特征的专能细胞系。材料和方法在本实施例末尾展示。为了富集生殖系干细胞，将新生和成年睾丸组织在涂有明胶的培养皿上培养2小 时，获得差异黏附以去除体细胞而不去除生殖细胞。在差异黏附后，可以回收含有GFP阳性 细胞(新生中4-10% ；成年中0. 01-0. 05% )的细胞悬浮液(图12A-C)。GFP和c-Kit的 表达之间存在相关(图12F-12H)。在培养皿上含有所述生长因子混合物的干细胞培养基中培养收获的新生生殖细 胞。培养若干天后初始GFP信号(图13A)消失(图13B)。之后，细胞经历不同的形态改 变，形成不具GFP信号的持续生长的链样集落(图13C-D)。通过集落内GFP阳性细胞的出 现指出的Oct-4的上调在培养3-4周后出现(图13F)。培养2-4周后，将GFP阳性集落机 械转移进下述培养皿中，所述培养皿在补充有15% FBS的相同培养基中含有经细胞色素C 处理的鼠胚胎成纤维细胞饲养层(MEF;见下文)。通过机械转移至新的MEF培养物而传代 3-4次后，集落确立并且能够从培养平板上酶促(胶原酶lmg/ml，5-10分钟)取出用于进一 步扩展和/或储存于液氮中。为了从成年小鼠衍生细胞系，使用FACS分选在差异黏附后收 获的GFP阳性细胞，并直接在MEF上培养。使用0G2或0G2_lacZ小鼠总计产生19个细胞系 (10个新生和9个成年)。所有的细胞系或者表达GFP (14个株系)，或者表达GFP-LacZ (5 个株系)(图13G-13I)。另外，从新生野生型⑶-1小鼠中产生mGC株系表明该方法不限于转基因0G2小 鼠。所选择的细胞系已被冻/融和繁殖多于40代，估计的细胞倍增时间为72小时(使用 手动细胞计数和GFP分选二者(图14))。在培养期间的不同时间点(第2天，图14A ；第5天，图14B ；第9天，图14C ；第15天，图14D)，通过FACS分析GFP阳性细胞数(图14E)。通过FACS将C-kit阳性/GFP阳性细胞与c_Kit阴性/GFP阳性细胞分离(图 12D-E)，并在MEF养料上培养。只有c-Kit阳性群体产生mGC集落，并且c-Kit阴性池不 能产生细胞系。在该研究中使用的生长因子中，GDNF的去除产生更小的集落，表明GDNF在 mGC自我更新中的作用。相反，FGF2的去除导致集落的分化，表明FGF2在mGC维持其未分 化阶段中的可能作用。LIF或EGF的去除不影响mGC的扩展或分化。mGC集落中的大部分细胞表达0ct-4(图15A-15D)、Nanog (图15E-15H)、 SSEA-I (图 15M-150)和 VASA (图 15I-15L)。它们也表达多能基因 Sox2、DPPa5、Rex_l、eRas 和Cripto,以及生殖系特异性标记物，包括Stella、Dazl、Vasa和cRet (图15Q)。另外，通 过Western印迹分析证实了 0ct_4、Nanog和Sox2的表达(图15P)。第20代的小鼠细胞系显示高端粒酶活性(图16A，与ESC类似)和正常核型00， XY)(图 16B)。还在培养之前和之后分析了 mGC的全局基因表达和印迹模式，并与ESC比较。有趣 的是培养条件未改变测试的所有DMR(差异甲基化区域)中mGC的印迹模式。与仅显示部 分产雄(androgenetic)印迹的小鼠ESC相反，mGC清楚地展示100%的产雄印迹模式(图 17)。稍微令人惊讶的是，微阵列分析显示mGC的全局基因表达谱在培养之前和之后具有 87%的相似性。当mGC聚集形成胚状体(EB)时，在9_15天内观察到原肠胚形成。EB中的细胞表达 早期发育标记物，包括E-钙黏着蛋白和层粘连蛋白1(极化的上皮的标记物，图18B-18C)， Zicl、PAX6和Soxl (早期外胚层标记物，图18D和18F)，GATA4和FoxA2 (早期内胚层标记 物，图18E-18F)和Brachyury、BMP4和C0L2A1 (早期中胚层标记物，图18F)。在培养中，mGC 集落自发地分化为表达心肌细胞(图18G-18J)、脂肪细胞(图18K)和神经细胞(图18L 和18M)标记物的表型。自发地分化为心肌细胞的一些细胞展示至多3天的有节律的收缩。 使用定向分化方案，可以将mGC株系诱导以分化为代表神经祖先(巢蛋白，neuroDl)、神经 元(MAP2、NF-68、GAD67)和胶质细胞(GFAP、MBP、A2B5、04、NG2)的神经细胞，如图 19A-G 和 19J中所示。它们也可以被诱导以形成心肌细胞(肌钙蛋白1、心肌球蛋白、结蛋白、Nkx2. 5、 GATA4，图191和19L)或软骨细胞(胶原Xal，和通过阿利新蓝染色，图19H和19K)。在单独的使用mGC的分化研究中，在培养物中的7个集落内计数使用或不使用神 经标记物染色的细胞(核)数量，平均百分比估计为=GFAP+细胞17. 6%，Tuj-Γ细胞2. 5%, MAP-2+细胞2. 3%。一般而言，与mGC相比，通过这些方案在ES细胞中诱导的分化高得多。移植后四周，对照动物以及接受Oct-4阳性/c-Kit阳性细胞的动物的睾丸显示在 大部分输精管中无精子生成。然而，接受新鲜分离的Oct-4阳性/c-Kit阴性睾丸细胞的小 鼠中80%显示在整个睾丸中一些程度的精子生成，表明细胞悬浮液中功能性SSC的存在。 只有生殖系干细胞的c-Kit-阴性亚群在受体睾丸中建群。图20M-20R和表1中展示了用 培养后和培养前的生殖系干细胞移植后的睾丸再生。图20M中展示了免疫缺陷小鼠的正常 睾丸的横向切片。白消安处理后一个月，大部分输精管的内源精子生成衰竭(图20N)。尽 管用Oct-4-阳性/c-Kit-阴性细胞移植的小鼠的输精管中73%显示一些程度的精子生成 (图200)，但是接受Oct-4-阳性/c-Kit-阴性细胞的小鼠的大部分输精管横向切片是空的 (图20P)。图20R中展示了 Oct-4-阳性/c-Kit-阴性细胞移植后不久CSFE-标签为阳性的集落。在用mGC移植的受体小鼠睾丸的大部分输精管中未发现精子生成，表明这些细胞 不具有SSC特性(图20Q)。表1.受体小鼠睾丸中生殖系干细胞亚群和专能生殖细胞系移植后精子生成的重 建
权利要求
1.由经分离的性腺细胞组成的经分离的生殖系细胞群体，其特征是表达至少一种选自下组的标记物，所述组由生殖系干细胞表面标记物GFR-α 1、 α 6-整联蛋白、Thy-U SSEA-4、CD9、Dolichos biflourus 凝集素(DBA)、生殖细胞标记物 VASA和DAZL，和精原干细胞标记物PLZF组成；表达至少一种选自下组的生殖系干细胞基因，所述组由端粒酶、VASA、c-RET、GFR- α 1、 DAZL禾口 PLZF组成；禾口表达高水平的端粒酶。
2.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞是雄性的。
3.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞是雌性的。
4.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞是哺乳动物的。
5.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞分离自胎儿。
6.权利要求5的经分离的生殖系细胞群体，其中所述胎儿为妊娠11和22周之间的。
7.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞分离自出生后的个体。
8.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞任选地表达选自Oct-4、 Nanog和碱性磷酸酶的多能标记物。
9.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞表达针对GFR-α1和α6_整 联蛋白二者的细胞表面标记物。
10.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞表达针对Thy-I和α6-整 联蛋白二者的细胞表面标记物和编码端粒酶的基因。
11.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞表达针对SSEA4、GFR-CI1的 细胞表面标记物和生殖细胞标记物VASA。
12.权利要求11的经分离的生殖系细胞群体，其中大于约50%的细胞表达GFR-α1和 VASA 二者。
13.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞不表达至少一种选自下组 的标记物，所述组由黏附/活化分子(EpCAM)和c-Kit组成。
14.根据权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞表达Oct-4和c-Kit二 者，并且显示至少一种选自由下组的特性，所述组由以下组成约72小时的细胞周期倍增时间；以高于胚胎干细胞(ESC)中表达的水平表达生殖系特异性基因；以低于ESC的水平表达多能性基因；与白血病抑制因子(LIF)或成纤维细胞生长因子(FGM)相比，其自我更新更加依赖于 胶质细胞依赖性神经营养因子(GDNF)；和低于ESC的SSEA-I表达水平。
15.权利要求14的经分离的生殖系细胞群体，其中所述多能基因选自由0ct-4、NanOg、 Dppa-5、Sox2、碱性磷酸酶和Crypto组成的组。
16.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞分离自雄性，不表达c-Kit 并且能够分化为生精细胞。
17.权利要求16的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞表达α-整联蛋白和 Thy-I 二者。
18.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞分离自雌性，并且能够分化 为卵母细胞样细胞。
19.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述端粒酶活性至少是胚胎干细胞 端粒酶活性的20%。
20.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述端粒酶活性至少是胚胎干细胞 端粒酶活性的50%。
21.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞是多能的。
22.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞是专能的。
23.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞能够分化为外胚层细胞、内 胚层细胞和中胚层细胞。
24.权利要求23的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞能够分化为产多巴胺的细胞。
25.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞不能形成畸胎瘤。
26.权利要求1的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞分离自灵长类睾丸，并且所 述细胞表达Hiy-1、α 6-整联蛋白和SSEA-4，而不表达c-Kit。
27.权利要求沈的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞还表达GFRα、Nanog和 VASA0
28.权利要求沈的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞能够分化为生精细胞。
29.权利要求3的经分离的生殖系细胞群体，其中所述细胞表达Oct-4、Nanog、碱性磷 酸酶和VASA。
30.包含权利要求1的生殖系细胞的长期细胞培养物。
31.分离生殖系干细胞群体的方法，所述方法包括下述步骤选择显示出生殖系干细胞表面标记物表型的性腺细胞；以及确定所述性腺细胞表达至少一种生殖系干细胞基因。
32.权利要求31的方法，其中所述性腺细胞表达Oct-4和c-Kit二者。
33.权利要求31的方法，其中所述性腺细胞是雄性性腺细胞。
34.权利要求31的方法，其中所述性腺细胞是雌性性腺细胞。
35.权利要求31的方法，其中所述生殖系表面标记物表型包括至少一种选自下组的表 型，所述组由上皮细胞黏附/激活分子(EpCAM)阴性，⑶NF受体(GFR-a 1)阳性，c-Kit阴 性，Dolichos biflourus 凝集素(DBA)阳性，CD9 阳性，CD90 阳性，CD49f 阳性，SSEA4 阳性 和α 6-整联蛋白阳性组成。
36.权利要求31的方法，其中所述生殖系干细胞基因选自由端粒酶、VASA、c-RET, GFR- α 1、DAZL 和 PLZF 组成的组。
37.权利要求31的方法，其中选择生殖系干细胞表面标记物表型的步骤包括选择不 表达c-Kit但表达⑶90和⑶49f 二者的细胞。
38.权利要求31的方法，其中选择生殖系干细胞表面标记物表型的步骤包括选择不 表达c-Kit但表达SSEA4的细胞。
39.权利要求31的方法，其中选择生殖系干细胞表面标记物表型的步骤包括选择不 表达c-Kit但表达SSEA4、CD90和CD49f所有的细胞。
40.权利要求31的方法，其中选择生殖系干细胞表面标记物表型的步骤包括选择表 达α 6-整联蛋白和⑶90 二者但不表达c-Kit的细胞。
41.权利要求31的方法，其中所述细胞还表达SSEA-4。
全文摘要
本发明提供了对来自于胎儿和成年哺乳动物的生殖系细胞干细胞的分离、表征和繁殖。本发明还公开了具有不同表型的经分离的生殖系细胞群体，其中亚群能够形成专能细胞或多能细胞的长期培养物，或者能够分化为成熟的生殖系细胞并且再增殖不育的繁殖器官。专能生殖系细胞或多能生殖系细胞也适用于分化成用于治疗的目的的组织特异性的体细胞。
文档编号C12N5/074GK102105579SQ200880102383
公开日2011年6月22日 申请日期2008年8月7日 优先权日2007年8月7日
发明者托马斯·V·罗马斯, 查德·马科, 法里波茨·伊扎德亚尔, 詹森·帕基奥罗缇 申请人:普里梅真比奥特斯公司