新型葡萄糖脱氢酶的制作方法

专利名称：新型葡萄糖脱氢酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型葡萄糖脱氢酶(GDH)，其可以用作用于测量葡萄糖浓度的试 剂和葡萄糖传感器。本发明还涉及生产所述酶的方法，涉及用于定量葡萄糖的组合物，所述 组合物包含所述酶和含有所述酶的葡萄糖传感器。
背景技术：
NAD(P)-依赖性葡萄糖脱氢酶(EC 1. 1. 1. 47 ；以下，“葡萄糖脱氢酶”有时称为 “⑶H”，并且“NAD⑵-依赖性葡萄糖脱氢酶”称为“NAD⑵-GDH”)是一种主要用于血液葡 萄糖浓度测量的酶。该催化剂催化下述反应D-葡萄糖 +NAD (P) — D-葡糖酸 _ δ -内酉旨 +NAD (P) H葡萄糖氧化酶也已知为可以用于血液葡萄糖测量的一种酶。然而，据说该酶具 有这样的问题，即使用葡萄糖氧化酶进行葡萄糖浓度测量受溶解的氧浓度的影响，原因在 于该酶可以利用分子氧作为电子受体。由于葡萄糖脱氢酶不受该溶解的氧的影响，近年来 该酶已经用作血液葡萄糖测量的主要酶。⑶H酶包括NAD(P)-依赖性⑶H，吡咯并喹啉醌 (pyrroloquinoline quinone) (PQQ)-依赖性⑶H，和黄素-依赖性⑶H。PQQ-依赖性⑶H，诸 如鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)-来源的⑶H，具有底物特异性的问题，其中 PQQ-依赖性GDH与其与葡萄糖一样与麦芽糖反应。已知的黄素_依赖性GDH的实例包括土 曲霉(Aspergillus terreus)-来源的GDH0黄素-依赖性GDH具有比PQQ-依赖性GDH更 严格的底物特异性。然而，黄素-依赖性GDH不必然具有充分的底物特异性，因为相对于其 与葡萄糖的反应性，其与木糖的反应性约为9%。此外，黄素-依赖性GDH具有至多约50°C 的温度稳定性，这是不充分的。在已知类型的NAD(P)-GDH中，杆菌细菌(Bacillus bacteria) -来源的 NAD(P)-GDH是公知的。例如，已经报道枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)，赌状芽孢杆菌(Bacilluscereus)等作为生产GDH的菌株。尽管 所述细菌_来源的NAD (P) -GDH具有相对高的底物特异性，但是其热稳定性至多约为50°C， 因此是不充分的。超嗜热古细菌(Hyperthermophilic archaea)是系统分类为古细菌(Archeae)的 微生物，并且可以在90°C以上生长，或具有80°C以上的最适生长温度。来源于超嗜热古细 菌的酶通常具有高的耐热性。已经从超嗜热古细菌分离了许多耐热性酶，并且在工业上应 用。NAD(P)-GDH也分离自超嗜热古细菌，并且已经研究了其特征。在1986年、1989年和 1997年分别报道了硫磺矿硫化叶菌(Sulforobus solfataricus)-来源的⑶H(非专利文献 1)，嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)-来源的⑶H(非专利文献2)，和顽固热变形 菌(Thermoproteus tenax)-来源的⑶H(非专利文献3)。尽管这些酶具有极好的耐热性， 但是与细菌来源的酶相比，它们具有极差的底物特异性。当使用NADP作为辅酶时，硫磺矿 硫化叶菌_来源的GDH具有更广泛的底物特异性，并且在40mmol/L的底物浓度作用在半乳 糖或木糖上比作用在葡萄糖上更强。当使用NAD作为辅酶时，硫磺矿硫化叶菌-来源的GDH 对于葡萄糖的特异性相对增加，但是其针对木糖的活性仍然很高，即，相对于其针对葡萄糖的活性约为26%。当使用NADP作为辅酶时，嗜酸热原体(T. acidophilum)-来源的⑶H针 对半乳糖的活性相对于其针对葡萄糖的活性为70%。顽固热变形菌(T. tenax)-来源的GDH 也与木糖高度反应。在血液葡萄糖浓度测量中，使用具有低底物特异性和与除葡萄糖外的 物质的高反应性的GDH导致不准确的血液葡萄糖测量，并且因此是非常不利的。然而，来源 于超嗜热古细菌且具有80°C以上的高耐热性和针对葡萄糖的高特异性的NAD (P) -GDH尚是 未知的。非专利文献1 =Giardina P等，Biochem. J.(生物化学杂志)，卷239，第517-522 页(1986)非专利文献2 =Smith LD等，Biochem. J.(生物化学杂志)，卷261，第793-797页 (1989)非专利文献3 :Siebers B 等，Arch. Microbiol.(微生物学报)，卷 168，第 120-127 页(1997)

发明内容
发明要解决的问题因此，本发明的一个目的是提供一种葡萄糖脱氢酶，其是一种具有80°C以上的热 稳定性的非常稳定的酶，并且其基本上不作用于除葡萄糖之外的糖类，和提供生产所述酶 的方法和包含所述酶的用于定量葡萄糖的组合物。解决问题的方式本发明人从由日本鹿儿岛(Kagoshima)区Kodakara岛获得的温泉水中分离了属 于热变形菌属(Thermoproteus)的超嗜热古细菌，并且发现这些古细菌产生⑶H。本发明人 还发现所述GDH不仅具有极好的热稳定性，还具有非常高的底物特异性，与来源于超嗜热 古细菌的任何其它已知的GDHs不同。本发明人还成功地克隆了编码所述GDH的基因，并且 成功地表达了已经转移至大肠杆菌(Escherichia coli)的该基因。此外，本发明人发现可 以使用该酶测量葡萄糖浓度。基于这些发现完成了本发明。具体地，本发明包括下述特征。第1项一种葡萄糖脱氢酶，其具有基于其与葡萄糖的反应性，小于3%的针对麦 芽糖、半乳糖和木糖的反应性，并且具有80°C以上的温度稳定性。第2项根据第1项所述葡萄糖脱氢酶，其在葡萄糖氧化反应中利用烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)作为辅酶。第3项来源于超嗜热古细菌的葡萄糖脱氢酶，所述葡萄糖脱氢酶具有下述特性 (A)-(F)(A)温度稳定性90°C以下；(B)pH 稳定性4. 8-9. 7 ；(C)最适反应温度85°C ；(D)最适 ρΗ :9· 7 ；(E)辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)；(F)底物特异性当使用NADP作为辅酶时，所述葡萄糖脱氢酶基于其对葡萄糖的 活性，表现出2%以上且小于3%的针对木糖和麦芽糖的活性，和基于其对葡萄糖的活性，表现出1 %以上且小于2 %的针对半乳糖和甘露糖的活性，所述葡萄糖脱氢酶基本上不与 乳糖、山梨糖醇、和蔗糖反应；并且当使用NAD作为辅酶时，所述葡萄糖脱氢酶基本上不与木糖、麦芽糖、半乳糖、甘 露糖、乳糖、山梨糖醇、和蔗糖反应。第4项具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶。第5项包括由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列缺失、取代、插入、或添加一个或多 个氨基酸所形成的氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶，所述葡萄糖脱氢酶具有的活性基本上等于 具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶的活性。第6项编码第1-5项中任一项所述的葡萄糖脱氢酶的DNA。第7项包括第6项所述的DNA的表达载体，所述DNA被功能性偶联到在引入所述 DNA的宿主细胞中可操作的启动子上。第8项使用第7项所述的表达载体转化的转化微生物。第9项根据第8项所述的转化的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌 (Escherichia coli)0第10项用于生产第1-5项中任一项所述的葡萄糖脱氢酶的方法，其包括培养第 8或9项所述的微生物，并且从所得到的培养物收集葡萄糖脱氢酶。第11项用于定量葡萄糖的组合物，其包含第1-5项中任一项所述的葡萄糖脱氢 酶。第12项用于定量葡萄糖的方法，其包括使用第1-5项中任一项所述的葡萄糖脱 氢酶来定量葡萄糖。第13项包括由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列缺失、取代、插入、或添加一个或 多个氨基酸所形成的氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶，所述葡萄糖脱氢酶具有的活性基本上等 于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶的活性。发明效果本发明提供表现出极好的稳定性、基本上不与除葡萄糖外的糖类作用、并且不受 溶解的氧影响、因此能够准确测量血液葡萄糖水平和准确定量葡萄糖的GDH ；和包含所述 GDH的葡萄糖传感器以及包含所述GDH的、用于定量葡萄糖的组合物。实施发明的最佳方式本发明涉及来源于超嗜热古细菌且具有高稳定性和极好的底物特异性的GDH。所 述GDH特别具有下述特性。所述GDh具有这样的底物特异性，以致其具有基于其针对葡萄 糖的反应性，小于3%的针对麦芽糖、半乳糖、和木糖的反应性。所述GDH具有80°C以上、优 选85°C以上、更优选90°C以上的温度稳定性。更优选地，所述⑶H利用烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)作为辅酶。所述GDH更优选的特性详述 如下温度稳定性为90°C ；pH稳定性为4. 8-97 ；最适反应温度为85°C ；最适pH约为9. 7 ； 所述GDH利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)作为辅 酶起作用。所述GDH的底物特异性如下当使用NADP作为辅酶时，所述葡萄糖脱氢酶基于 其对葡萄糖的活性，表现出2%以上且小于3%的针对木糖和麦芽糖的活性，和基于其对葡 萄糖的活性，表现出以上且小于2%的针对半乳糖和甘露糖的活性，并且所述葡萄糖脱 氢酶基本上不与乳糖、山梨糖醇、和蔗糖反应。当使用NAD作为辅酶时，所述葡萄糖脱氢酶
5基本上不与木糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、山梨糖醇、和蔗糖反应。基于所述GDH的氨 基酸序列，所述GDH具有37，000的估计分子量。根据基于16S核糖体RNA (16SrRNA)(对于真核细胞为18SrRNA)碱基序列的进化 系统树，生物体广泛地分类为三种生命域，即，真核(Eucarya)，细菌(Bacteria)，和古细菌 (Archaea)。术语“古细菌(archaeon) ”或“古细菌(archaea) ”用在本文中是指基于16SrRNA 进化树系统分类为“古细菌”域的生物体。此外，术语“超嗜热古细菌(hyperthermophilic archaeon) ”或“超嗜热古细菌(hyperthermophilicarchaea) ”定义为可以在90°C以上生长 的古细菌(archaeon)或古细菌(archaea)，或定义为其最适生长温度为80°C以上的古细菌 (archaeon)(archaea) 0本发明的GDH所来源的生物体没有限制，只要其是超嗜热古细菌，但是优选是分 类为这样的种属，或与该种属紧密相关的古细菌，所述种属选自由以下各项组成的组热网 菌属(Pyrodictium)，硫化叶菌属(Sulfolobus)，硫还原球菌属(Desulfurococcus)，热变 形菌属(Thermoproteus)，热丝菌属(Thermofilum)，和热原体属(Thermoplasma)，并且更 优选地是分类为热变形菌属的古细菌。更优选地，本发明的GDH所来源的生物体是具有下 述特征(A)-(G)的古细菌(A)所述古细菌包含SEQ ID NO. 3所示的碱基序列作为编码16SrRNA的基因组DNA 的碱基序列。(B)所述古细菌可以在80°C以上生长；最适生长温度为约90°C ；(C)所述古细菌在基因组DNA中具有58-62mol %的GC含量。(D)所述古细菌是严格的厌氧性细菌。(E)所述古细菌在加入硫代硫酸盐作为电子受体时表现出令人满意的生长。(F)所述古细菌可以在以下的NaCl浓度下生长。(G)所述古细菌是长杆形状的细菌，长为10-30 μ m且宽约为5 μ m。用在本文中时，术语“温度稳定性”定义为当将GDH以作为蛋白浓度计算的浓度 0. 17mg/mL 溶解在 50mM Tris-HCl，0. IM NaCl (pH 8. 0)中，并将所述 GDH 溶液加热 30 分钟 时，相对于加热前的GDH活性，加热后的GDH活性残存率。温度稳定性所指定的温度范围表 示在上述条件下所述⑶H表现出90%以上的活性残存率的温度范围。例如，表述“80°C以 上的热稳定性”意指，在将包含⑶H的溶液在80°C以上温育30分钟后，相对于加热前，所述 ⑶H保留其活性的至少90%。换言之，当将所述⑶H在预先确定的温度下温育30分钟时， 相对于温育前的活性，所述⑶H在温育后具有90%以上的活性的温度范围包括80°C以上的 温度。测量所述⑶H活性的方法如下。在优选实施方案中，术语本发明的葡萄糖脱氢酶的“热稳定性”意指，在将所述葡 萄糖脱氢酶在特定温度下热处理30分钟后，相对于其在热处理前的酶活性，其具有至少 90%的残存活性。例如，表述“80°C的热稳定性”意指，在将所述⑶H在80°C热处理30分钟 后，相对于其在热处理前的酶活性，热处理的⑶H保留其酶活性的90%以上。自然地，“80°C 的热稳定性”还意指，在低于80°C的温度热处理后，GDH保留90%以上的残存活性(S卩，所 述GDH具有热稳定性)。如上述，由特定温度限定的热稳定性意指，在将本发明的GDH在该 特定温度以下热处理后，所述⑶H具有90%以上的残存活性。因此，表述“80°C以上的热稳 定性”意指80°C以上的温度是热稳定性的上限。
在另一个优选实施方案中，术语本发明的葡萄糖脱氢酶的“热稳定性”意指，在将 所述葡萄糖脱氢酶在特定温度下热处理30分钟后，相对于其在热处理前的酶活性，其具有 至少95%的残存活性。例如，在该实施方案中，表述“80°C的热稳定性”意指，在将所述GDH 在80°C热处理30分钟后，相对于其在热处理前的酶活性，热处理的GDH保留其酶活性的 95%以上。自然地，“80°C的热稳定性”还意指，在低于80°C的温度热处理后，⑶H保留95% 以上的残存活性(即，所述GDH具有热稳定性)。本发明的⑶H具有至少80°C、优选至少85°C、更优选至少90°C的热稳定性。术语“底物特异性”在本文中提及时，以所述GDH在下述条件下氧化其底物的速率 进行评价底物浓度为150mmol/L，辅酶浓度为5mmol/L，pH 8. 0，和反应温度为60°C。更具 体地，按照下述测量GDH活性的方法，计算所述GDH针对除作为待评价的底物的葡萄糖外的 糖类的活性，并且将所述糖类的活性表示为百分数，将所述GDH针对作为底物的葡萄糖的 活性视为100 %。在本发明中，当基于GDH针对葡萄糖的活性，GDH针对底物的活性小于1 % 时，将所述GDH定义为与所述底物“基本上不反应”。术语“pH稳定性”在本文中提及时定义为，当将所述GDH以作为蛋白浓度计算的浓 度5μ g/mL溶解在含有0. lmol/L缓冲液的溶液中，并且将所述溶液在25°C温育24小时时， 温育后的活性相对于温育前的活性在残存率。对于PH稳定性指定的温度范围表示在上述 条件下所述GDH表现出90%以上的活性残存率的pH范围。例如，表述“pH稳定性4. 8-9. 7” 意指，在将⑶H在pH 4.8-9.7的缓冲液中温育24小时后，相对于温育前，所述⑶H保留其 活性的至少90%。换言之，当在预先确定的pH温育24小时后，相对于温育前的活性，所述 ⑶H具有90%以上的活性的pH范围包括4. 8-9. 7的pH值。本发明的GDH没有限制，只要其来源于超嗜热古细菌，并且具有上述特性。表述 “来源于超嗜热古细菌”意指在自然中存在的固有生产GDH的菌株为超嗜热古细菌。因此，由 通过例如遗传转化人工改造的细胞产生的任何GDH在本文中定义为来源于超嗜热古细菌， 只要所述GDH满足下述条件所述基因的碱基序列与在超嗜热古细菌基因组中固有存在的 基因的碱基序列相同；或所述基因的碱基序列是由超嗜热古细菌基因组中固有存在的基因 取代、缺失、插入或添加一个或多个碱基获得的序列，并且所述基因具有的活性基本上等于 本发明的GDH的活性。表述“活性基本上等于”意指，修饰的GDH的活性在实验误差内、或 等价于或大于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的⑶H的活性。本发明的优选实施方案提供包含由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成的多肽的 葡萄糖脱氢酶，或包含由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加一个或 多个氨基酸残基获得的氨基酸序列组成的多肽的葡萄糖脱氢酶。所述GDH可以由通过培养 所述⑶H所来源的超嗜热古细菌获得的培养物生产。所述⑶H还可以通过表达已经转移至 不同于所述GDH所来源的超嗜热古细菌的宿主生物体的基因而生产。当本发明的葡萄糖脱氢酶是在SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中具有一个或多个 氨基酸取代、添加、缺失、或插入的多肽时，所述氨基酸突变的数目和类型没有限制，只要它 们不影响葡萄糖脱氢酶活性，和上文提及的酶特性，诸如热稳定性，PH稳定性，和底物特异 性。突变的数目优选是多个，更具体地为1-30个，优选地为1-15个，更优选地为1-10个， 更优选地为1-5个，甚至更优选地为1-3个。当本发明的葡萄糖脱氢酶是在SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代的多肽时，所述氨基酸取代没有限制，只要它们不削弱葡萄糖脱氢酶活性和上 文提及的酶特性。然而，优选地，所述氨基酸取代是被相似氨基酸的取代。相似氨基酸的实 例包括下述芳香族氨基酸Phe，Trp，Tyr脂肪族氨基酸Ala，Leu,lie, Val极性氨基酸Gln，Asn碱性氨基酸Lys，Arg,His酸性氨基酸Glu，Asp具有羟基的氨基酸Ser，ThrSEQ ID NO. 2所示的多肽序列具有与已知的来源于顽固热变形菌的⑶H的序列的 高度同源性，即79%。然而，本发明的GDH在其非常高的底物特异性方面清楚地不同于已 知的GDH。根据上文列出的非专利文献3，来源于顽固热变形菌的已知的GDH在底物浓度为 40mmol/L时具有的针对木糖的活性高于针对葡萄糖的活性。相反，本发明的GDH，当利用 NADP作为辅酶时，甚至在更高底物浓度，即，150mmol/L时，具有基于其针对葡萄糖的活性， 小于3%的针对木糖的活性。当利用NAD作为辅酶时，本发明的GDH具有基于其针对葡萄糖 的活性，小于的针对木糖的活性。因此，所述GDH的特征是其与木糖的极低反应性。本 发明的GDH与已知的GDH之间的这种特性差异可能极大地归因于它们氨基酸序列的不同。 本发明的GDH的特征之一在于，其具有与SEQ ID NO. 2序列高度同源的氨基酸序列。特别 地，所述⑶H具有与SEQ ID NO. 2氨基酸序列80%以上的同源性，优选地85%以上的同源 性，和更优选地90%以上的同源性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的GDH具有 与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列95%以上的同源性，优选地98%以上的同源性，和更优 选地99%以上的同源性。本发明的⑶H可以通过适当地使用例如任一种下述方法获得(1)由某种来源提取所述GDH，然后纯化，所述来源为产生所述酶的细胞；(2)化学合成所述⑶H ；(3)从通过基因重组技术改造为表达所述⑶H的细胞纯化所述⑶H ；和(4)使用不含细胞的转录/翻译系统，由编码所述GDH的核酸生化合成所述GDH。例如，用于生成产生本发明的GDH的天然细胞的方法的一个实例如下。首先，由有 利于超嗜热古细菌生长的环境，即高温环境，如火山地区、深入地表面下、海底热液出口、和 存在温泉的地区收集样品，并且将所述样品接种在合适的培养基中，并且在80°C以上培养。例如，由天然产生⑶H的细胞分离/纯化⑶H可以按下述进行。将产生⑶H的细 胞均勻分布(homogenized)在适当的缓冲液中，并通过超声波、表面活性剂处理等获得细 胞提取液。然后，可以通过适当组合在蛋白质分离和纯化中常用的分离技术进行GDH的纯 化。所述分离技术的非限制性实例包括利用溶解性差异的方法，诸如盐析和溶剂沉淀；利用 分子量差异的方法，诸如透析、超滤、凝胶过滤、不改性的聚丙烯酰胺电泳(PAGE)、和十二烷 基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)；利用电荷的方法，诸如离子交换层析和羟基磷灰 石层析；例如特异性亲和性的方法，如亲和层析；利用疏水性差异的方法，如反相高效液相 色谱；和利用等电离点差异的方法，如等电子聚焦。通过化学合成生产⑶H可以通过使用肽合成仪，基于例如SEQ IDN0. 2所示的氨基酸序列，合成其序列的全部或一部分来进行。例如，肽合成方法可以是固相合成或液相合 成。目的蛋白可以通过缩合可以形成本发明的GDH的部分肽或氨基酸与其余部分而产生。 当产物包含保护基团时，去除该保护基团。缩合和去除保护基团按照已知方法进行，例如， 按照在下述文献(1)和(2)中所述的方法进行(I)M. Bodanszky 禾口 M. A. Ondetti， Peptide Synthesis(月太合成)， IntersciencePublishers,纽约(1966)(2) Schroeder 和 Luebke，The Peptide (肽)，Academic Press (学术出版社)，纽 约(1965)。这样获得的本发明的GDH可以根据已知的纯化方法进行纯化/分离。纯化方法的 实例包括溶剂提取、蒸馏、柱层析、液相色谱、重结晶、以及它们的组合。当通过上述方法获得的⑶H为游离实体时，可以根据已知的方法或利用已知方法 的方法将其转化为适当的盐。相反，当所述GDH以盐获得时，可以按照已知的方法或利用已 知方法的方将所述盐转化为游离实体或另一种盐。优选地，本发明的GDH可以通过克隆(或化学合成)编码所述GDH的蛋白的核酸， 并且通过由包含携带所述核酸的表达载体的转化体的培养物分离/纯化GDH而产生。克隆酶基因可以典型地根据下述方法进行。由产生所述酶的细胞或组织完全或部 分纯化需要的酶，并且通过Edman分析和质谱法确定N端的氨基酸序列。通过使用蛋白酶 或以序列特异性方式分解肽的化学物质部分消化所述酶获得的寡肽的氨基酸序列同样通 过Edman分析和质谱法确定。合成具有与由此确定的部分氨基酸序列相对应的碱基序列的 寡核苷酸，并且使用该寡肽作为探针，通过菌落(或斑)杂交从由产生该酶的细胞或组织制 备的cDNA或基因组DNA文库克隆编码该酶的DNA。备选地，使用完全或部分纯化的酶的全 部或一部分作为抗原，按照常规方法制备针对该酶的抗体，并且通过抗体筛选从由产生该 酶的细胞或组织制备的cDNA或基因组DNA文库克隆编码该酶的DNA。当具有与目的酶的酶特性相似的酶特异性的酶的基因已知时，可以访问，例如， NCBI BLAST主页(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，搜索与所述已知基因的碱基序 列具有同源性的序列，基于已经找到的碱基序列制备如上所述的探针，并且通过菌落(或 斑)杂交克隆编码目的酶的DNA。备选地，可以基于已经找到的碱基序列合成适当的寡核苷酸作为引物，并且利用 聚合酶链式反应(以下简写为“PCR”)或反转录酶_PCR(以下为“RT-PCR”)，利用由产生 GDH的细胞制备的基因组DNA片段、总RNA、或mRNA片段作为模板，进行直接的扩增。这样获得的DNA的碱基序列可以使用已知的测序技术如Maxam-Gilbert法或双脱 氧链终止法确定。更优选地，编码本发明的⑶H的核酸为，例如，包含SEQ ID NO. 1所示的碱基序列 的核酸(当所述核酸为RNA时，“t”替换为“U”)；或为包含在严格条件下与SEQ ID NO. 1所 示的碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的核酸，编码与由SEQ ID NO. 2所示的氨基 酸序列组成的上述多肽相同的特性的多肽的核酸。特别地，所述多肽具有通过SDS-PAGE估 测的分子量37，000，温度稳定性为90°C以下，pH稳定性为4. 8-9. 7，最适反应温度为85°C， 最适PH为约9. 7，和底物特异性是这样的，即其基本上不针对麦芽糖、半乳糖、木糖、乳糖、 山梨糖醇、和甘露糖作用。所述多肽利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二
9核苷酸磷酸(NADP)作为辅酶起作用。在严格条件下与SEQ ID NO. 1所示的碱基序列杂交 的核酸的实例包括这样的核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO. 1所示的碱基序列具有60%以 上的同源性、优选70%以上的同源性、更优选地80%以上的同源性、更优选地90%以上的 同源性、且最优选地95%以上的同源性的碱基序列。在本文中，碱基序列的同源性可以使用同源性计算算法NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local AlignmentSearch Tool (国家生 物技术信息中心碱基局部比对搜索工具))在下述条件下(预测值=10 ；允许缺口 ；过滤= ON ；匹配得分=1 ；错配得分=-3)来计算。上述关于氨基酸序列的同源性计算算法还可以 作为确定碱基序列同源性的另一种优选的算法实例提及。杂交可以按照已知的方法或利用已知方法的方法进行，例如，在Molecular Cloning (分子克隆)，第 2 版(J. Sambrook 等.，Cold Spring HarborLab. Press (冷泉港实 验室出版社)，1989)中所述的方法。当使用商购的文库时，杂交可以按照在所附的手册中 所述的方法进行。杂交可以优选地按照严格条件进行。严格条件的实例如下钠盐浓度约19-约40mM，并且优选约19-约20mM ；温度 约50°C -约70°C，且优选地60°C -约65°C。特别地，约19mM的钠盐浓度和约65°C的温度 是优选的。本领域技术人员可以容易地通过改变杂交溶液的盐浓度，杂交反应的温度、探针 浓度、探针长度、错配数目、杂交反应时间、洗涤溶液的盐浓度、洗涤温度等而将杂交条件调 整至需要的严格性。编码本发明的GDH的DNA可以获自热变形菌属的超嗜热古细菌的基因组DNA或 RNA(cDNA)，如上所述。备选地，可以通过化学合成DNA链，或通过合成部分重叠的短寡DNA， 并且利用PCR连接所述寡DNA来获得编码⑶H的DNA，由此构建编码⑶H基因全长的DNA。 化学合成或组合地利用PCR构建全长DNA的优点在于，所用的密码子可以根据引入所述基 因的宿主跨(across)所述基因的全长来设计。编码同一氨基酸的密码子不是统一地使用 的；密码子的使用率(usage)根据生物体物种而不同。通常，在特定生物物种中高度表达的 基因包含在该生物中常用的密码子。相反，通常的情形是存在不常用的密码子防止具有低 表达水平的基因得到高度表达。关于外源基因的表达，已有许多案例报道，在所述案例中， 通过用宿主生物体中常用的密码子替换基因序列中的密码子增加外源基因的表达水平。因 此，预测所用密码子的这种改变提高外源基因的表达水平。因此，需要将编码本发明⑶H的DNA的密码子改变为更适合于引入所述DNA的宿 主的密码子(即，该宿主中常用的密码子)。每种宿主中的密码子使用率(usage)定义为 该宿主生物体基因组序列中存在的所有基因中所用的每种密码子的比例，并且表示为，例 如，每1000个密码子使用的每种密码子的次数。对于完整基因组序列尚未知的生物体，密 码子使用率可以近似由该生物体代表性基因的序列计算。关于用于重组的宿主生物体中 的密码子使用率的数据是可获得的，例如，在Kazusa DNA研究所(Kazusa DNA Research Institute)主页上公布的密码子使用率数据库(Codon Usage Database)中。备选地，使用 者可以参考公开各种生物体中的密码子使用率的参考文献，或者可以自己确定关于要用的 宿主生物体的密码子使用率数据。参考所获得的密码子使用率数据，以及要引入到宿主中 的基因序列，可以将在该宿主生物体中不常用的密码子替换为编码相同氨基酸的常用密码 子。
引入编码本发明的⑶H的DNA的宿主细胞没有限制，只要已经为其建立了重组表 达系统，如下述。优选的宿主细胞的实例包括微生物，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，和其它细 菌，放线菌(Actinomycetes)，曲霉菌属(Aspergillus)，和酵母，以及昆虫细胞，动物细胞 和高等植物细胞。优选大肠杆菌(例如，K12菌株和B菌株)。以K12菌株为例，大肠杆菌 中常用密码子的实例包括下述GGT或GGC用于Gly ；GAA用于Glu ；GAT用于Asp ；GTG用于 Val ；GCG 用于 Ala ；CGT 或 CGC 用于 Arg ；AGC 用于 Ser ；AAA 用于 Lys ；ATT 或 ATC 用于 Ile ； ACC 用于 Thr ；CTG 用于 Leu ；CAG 用于 Gln ；和 CCG 用于 Pro。其中密码子已经替换为宿主中常用的密码子的编码⑶H的DNA可以是，例如，通过 用在大肠杆菌K12菌株中常用的密码子替换编码来源于热变形菌属古细菌的GDH的DNA的 密码子而获得的DNA，并且编码与所述GDH的氨基酸序列相同的氨基酸序列。本发明还提供包含编码本发明的⑶H的DNA的重组载体。本发明的重组载体没有 限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中的保持其复制或自主复制。所 述重组载体包括质粒载体和病毒载体。使用适当的限制酶和连接酶，或者，如果需要，另外 使用连接体或连接DNA，可以容易地通过将编码本发明GDH的DNA与已知的克隆载体或本 领域可用的表达载体连接而制备重组载体。备选地，如果编码GDH的DNA是使用DNA聚合 酶如Taq聚合酶扩增的基因片段，所述聚合酶在扩增末端添加一个碱基，则该DNA可以通过 TA克隆连接到载体上。质粒载体的实例包括大肠杆菌来源的质粒，如pBR322，pBR325, pUC18，和pUC19 ； 酵母来源的质粒，如PSH19和pSH15 ；和枯草芽孢杆菌来源的质粒，如pUBl 10，pTP5， 和pC194。病毒载体的实例包括噬菌体如λ噬菌体；乳多空病毒(papovaviruses) 如SV40和牛乳头瘤病毒(bovin印apillomavims) (BPV)；反转录病毒，如莫洛尼鼠白 血病毒(Moloneymurine leukemia virus) (MoMuLV)；以及动物与昆虫病毒，如腺病毒 (adenovirus) (AdV),腺伴随病毒(adeno-associated virus) (AAV),痘苗病毒(vaccinia virus)，禾口杆状病毒(baculovirus) ο更特别地，本发明提供一种GDH表达载体，其包含在靶细胞内功能启动子的控制 下的编码⑶H的DNA。本文所用的载体没有限制，只要其包含启动子区，该启动子区能够在多种原核和/或真核宿主细胞中起作用以控制位于 该启动子区下游的基因的转录(例如，在大肠杆菌宿主细胞的情形中，trp启动子，Iac启动 子，IecA启动子，等等；在枯草芽孢杆菌宿主细胞的情形中，SPOl启动子，SP02启动子，penP 启动子，等等；在酵母宿主细胞的情形中，PH05启动子，PGK启动子，GAP启动子，ADH启动子， 等等；在哺乳动物宿主细胞的情形中，病毒启动子如SV40-来源的起始启动子，MoMULV-来 源的长末端重复，腺病毒-来源的起始启动子，等等)；和关于该基因的转录终止信号，S卩，终止子区；其中所述启动子区和终止子区通过至少一个限制酶识别位点连接，其优选是包含仅在 该位点位置切断载体的特有限制性位点的序列。优选地，所述载体还包含用于选择转化体的选择性标记基因(所述选择性标记 基因包括赋予药物抗性的基因，诸如四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、潮霉素、和膦丝菌素 (phosphinothricin)抗性；和通过营养突变补偿的基因)。此外，当待插入的编码⑶H的
11DNA不包含起始密码子和终止密码子时，优选地使用在启动子区下游和终止子区上游分别 包含起始密码子(ATG或GTG)和终止密码子(TAG，TGA，TAA)的载体。当使用细菌作为宿主细胞时，除了启动子区和终止子区之外，表达载体典型地需 要包含能够在宿主细胞中自主复制的复制子。启动子区在启动子邻近处包含操纵子和 Shine-Dalgamo (SD)序列。当使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主时，表达载体优选地还包含增强子序 列，⑶H mRNA的5’和3’非翻译区，聚腺苷酸化位点，等。引入所制备的重组载体的宿主生物体的实例包括已经为其建立了重组表达系统 的宿主生物体，例如，微生物，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，和其它细菌，放线菌，曲霉属，和 酵母菌，以及昆虫细胞，动物细胞和高等植物细胞。其中，由于大肠杆菌的极好的蛋白表达 能力，大肠杆菌是优选的。例如，可以通过电穿孔将重组质粒引入。在通过使用氯化钙等进 行化学处理使得细胞成为感受态的情形中，可以通过应用热激将重组质粒引入。可以通过 寻找表达⑶H活性和表达包含所述靶DNA的载体的标记基因如多种药物抗性基因中的任一 种的微生物而选择向其转移靶重组质粒的宿主微生物。例如，可以选择在适于药物抗性基 因的选择性培养基上生长并且还表达⑶H的微生物。可以通过在培养基中培养包含这样制备的⑶H表达载体的转化体，并且由得到的 培养物收集GDH而生产本发明的GDH。优选地，所述培养基包含宿主细胞(转化体)生长所需要的碳源或者无机或有机 氮源。碳源的实例包括葡萄糖，葡聚糖，可溶淀粉，和蔗糖；无机或有机氮源的实例包括铵 盐，硝酸盐，氨基酸，玉米浆，蛋白胨，酪蛋白，肉提取物，脱脂大豆，和马铃薯提取物。所述培 养基可以任选地包含其它营养素，例如，无机盐(例如，氯化钙、磷酸二氢钠、和氯化镁)，维 生素，和抗生素(例如，四环素、新霉素、氨苄青霉素、和卡那霉素)。培养按照本领域已知的方法进行。依据宿主细胞所用的特定的培养基和培养条件 在下文作为举例给出，但是本发明所用的培养条件决不限于此。当使用细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等作为宿主时，合适的培养基的实例为包含 上述氮源的液体培养基。优选地，所述培养基具有5-9的pH。当宿主为大肠杆菌时，优选 的培养基的实例为LB培养基和M9培养基[Miller. J.，Exp. Mol. Genet (实验分子遗传学杂 志)，第 431 页，ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港实验室)，和纽约(1972)]。培养 可以典型地在14-43°C进行约3-约72小时，需要时，在通风和搅拌条件下培养。当宿主为 枯草芽孢杆菌时，培养可以典型地在30-40°C进行约16-约96小时，需要时，在通风和搅拌 条件下培养。当宿主为酵母时，培养基的实例为Burkholder基本培养基[Bostian. KL.等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报)，77，4505 (1980) ]，pH 优选为 5-8。培养 可以典型地在约20-约35°C进行约14-约144小时，需要时，在通风和搅拌条件下培养。当宿主为动物细胞时，培养基的实例为包含约5-20%胎牛血清的基本必需培养 基(MEM) [Science (科学)，122，501 (1952)]，Dulbecco 改良的 Eagle 培养基(Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium) (DMEM) [Virology (病毒学)，8，396 (1959) ]，RPMI1640 培养基 [J. Am. Med. Assoc.(美国医学学会杂志)，199，519 (1967)]，和 199 培养基[Proc. Soc. Exp. Biol. Med.(实验生物医学学会学报)，73，1(1950)]。培养基的pH优选为约6-约8。培养 可以典型地在约30-约40°C进行约15-约72小时，需要时，在通风和搅拌条件下培养。
当宿主为昆虫细胞时，培养基的实例为包含胎牛血清的Grace’ s培养基[Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报)，82，8404 (1985)]，具有优选约5-约8的pH。 培养可以典型地在约20-约40°C进行15-100小时，需要时，在通风和搅拌条件下培养。GDH的纯化可以通过根据存在GDH活性的级分适当组合各种常用的分离技术而进 行。培养基中存在的GDH可以通过离心或过滤该培养物获得培养物上清(滤出液)，并 且使用已知的分离方法从该培养物上清中分离GDH而分离/纯化，所述已知的分离方法适 当选自，例如，盐析、溶剂沉淀、透析、超滤、凝胶过滤、不改性的PAGE、SDS-PAGE，离子交换层 析，羟基磷灰石层析，亲和层析，反相高效液相色谱，和等电子聚焦。存在于胞质中的GDH可以这样分离/纯化通过离心或过滤培养物收集细胞，将细 胞悬浮在适当的缓冲液中，通过例如超声波、溶菌酶处理、冷冻/解冻、渗透压休克、和/或 使用Triton-XlOO等进行表面活性剂处理而分裂(裂解)该细胞和细胞器，然后通过离心、 过滤等去除碎片，从而产生可溶级分，并且按照上述方法处理所述可溶级分。快速且容易地获得重组GDH的优选方式的实例是这样的方法，其中通过遗传改 造，将编码可以吸附至金属离子螯合物的氨基酸(例如，由碱性氨基酸如组氨酸、精氨酸， 或蓖麻毒蛋白组成的序列，其中优选组氨酸)的DNA序列添加至包含⑶H编码序列的部分 (优选在N或C端)，并且将得到的物质在宿主细胞中表达；然后，基于所述氨基酸序列对金 属离子螯合物的固定支持物的亲和性，从细胞培养物中具有GDH活性的级分分离/收集所 述GDH。可以向GDH编码序列引入编码可以吸附至金属离子螯合物的氨基酸序列的DNA序 列，例如，按下述在克隆编码GDH的DNA的过程中，使用杂合引物进行PCR扩增，其中将所 述DNA序列连接至编码GDH的C-端氨基酸序列的碱基序列；或者通过将编码GDH的DNA符 合读框地插入到在终止密码子之前包含所述DNA序列的表达载体。用于纯化的金属离子螯合吸附剂这样制备，即通过使过渡金属，如二价离子如钴、 铜、镍或铁，或三价离子如铁或铝，并且优选是含有钴或镍的二价离子的溶液，与附着了配 体的基质接触，所述配体例如，亚氨基二乙酸(iminodiacetic acid) (IDA)基团，氨基三乙 酸(nitrilotriacetic acid) (NTA)基团，或三(羧甲基)乙二胺(tris (carboxymethyl) ethylenediamine) (TED)基团，由此使所述过渡金属与所述配体结合。螯合吸附剂的基质部 分没有限制，只要其为普遍不溶的支持物。备选地，亲和纯化可以使用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、 HA、FLAG肽等作为标签进行。上述纯化步骤可以任选地包括这样的处理，如膜浓缩，在减压下浓缩，和加入激活 剂和/或稳定剂。由于本发明的GDH具有极佳的耐热性，使得来源于其它宿主细胞的污染 蛋白热变性并且允许GDH活性得以保留的热处理对于充分提高GDH纯度是特别有效的。尽 管在这些步骤中所用的溶剂没有限制，但是优选的溶剂为在约6-约9范围的pH具有缓冲 能力的各种缓冲液，诸如磷酸钾缓冲液、tris-盐酸缓冲液、和Good缓冲液。当这样获得的⑶H为游离实体时，按照已知的方法或利用已知方法的方法，可以 将其转化成盐。当GDH作为盐获得时，按照已知的方法或利用已知方法的方法，可以将该盐 转化为游离实体或另一种盐。纯化的酶在工业上可以以液体形式使用，或者可以是粉末或颗粒状的。液体酶的
13粉末化可以按照常规方法通过冷冻干燥进行。此外，本发明的⑶H可以利用与编码⑶H的DNA互补的RNA作为模板，并且使用不 含细胞的蛋白翻译系统，包括兔网织红细胞裂解物、麦芽裂解物、大肠杆菌裂解物等，通过 体外翻译而合成。编码本发明的⑶H的RNA可以通过按照常规方法纯化编码本发明的⑶H的mRNA 而获得。备选地，编码本发明的GDH的RNA可以通过使用编码所述GDH的DNA作为模板制 备cRNA，并且使用包括RNA聚合酶的不含细胞的转录系统而获得。可以使用商购的不含细 胞的蛋白转录/翻译系统，或者可以按照已知的方法制备不含细胞的蛋白转录/翻译系统； 具体地，例如，可以按照Pratt J.M.等，“Transcription and Tranlation (转录和翻译)”， Hames B. D.和 Higgins S.J.编，IRL 出版社(IRL Press)，牛津 179-209 (1984)中所述的 方法制备大肠杆菌提取物。商购的细胞裂解物的实例如下来源于大肠杆菌的细胞裂解物 包括大肠杆菌S30提取物系统(由Promega (普洛麦格)供应)，和RTS 500快速翻译系统 (RTS 500Rapid Tranlation System)(由Roche (罗氏)供应)；来源于兔网织红细胞的细 胞裂解物包括兔网织红细胞裂解物系统(由Promega(普洛麦格)供应)；和来源于麦芽的 细胞裂解物包括PR0TEI0STM(由T0Y0B0供应)。上述中优选的是麦芽裂解物。制备麦芽裂解物的可用的方法的实例为记述在Johnston F. B.等，Nature (自 然)，179 :160-161(1957)中的方法，和记述在 Erickson A. H.等，Meth. Enzymol.(酶学方 法)，96 :38-50(1996)中的方法。用于蛋白合成的系统或装置的实例包括批次法[Pratt，the J. M.等.(1984)，同 前]；用于合成不含细胞的蛋白的连续系统，其中向反应系统中连续供应氨基酸、能源等 [Spirin A. S.等，Science (科学)，242 1162-1164 (1988)]；透析(Kigawa 等，日本分子生 物学学会第 21 次年会(the 21stAnnual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan),WID6)；和双层法(PR0TEI0S 麦芽不含细胞的蛋白合成核心试剂盒的使用说明；由 T0Y0B0供应)。可用的方法的其它实例包括这样的方法，其中在需要时，向合成反应系统 中提供模板RNA、氨基酸、能源等，并且在需要时，使合成的或降解产物从该反应系统中流出 (日本未审查的专利公布号2000-333673)。本发明还提供包含本发明的⑶H的用于定量葡萄糖的组合物，和使用本发明的 GDH测量葡萄糖浓度的方法。在本发明中，葡萄糖水平可以通过下述多种方法测量。本发明用于测量葡萄糖水 平的试剂，葡萄糖测定试剂盒，和本发明的葡萄糖传感器可以采取多种形式，诸如液体形式 (溶液、混悬液等)、通过例如真空干燥或喷雾干燥获得的粉状形式、和冷冻_干燥的形式。 冷冻_干燥方法没有限制，并且可以按照常规方法进行。替代作为冷冻_干燥的产物，包含 本发明的酶的组合物还可以采用通过复原所述冷冻-干燥的产物而获得的溶液的形式。用于测量葡萄糖水平的试剂本发明用于测量葡萄糖水平的试剂典型地包括本发明的⑶H，辅酶，缓冲液，用于 准备校正曲线的葡萄糖标准溶液，以及使用说明。优选地，所述试剂包括测定所需要的试 剂，如介质(mediator)。葡萄糖测定试剂盒本发明的葡萄糖测定试剂盒典型地包括该测定所需要的试剂，如本发明的GDH、辅酶、缓冲液、介质等、用于准备校正曲线的葡萄糖标准溶液、以及使用说明。本发明的试剂盒 可以作为，例如，冷冻_干燥的试剂或处于适当的储液中的溶液提供。葡萄糖传感器本发明的葡萄糖传感器使用碳电极、金电极、钼电极等作为电极，在电极上固定了 所述GDH。固定方法的实例包括使用交联剂的方法，将GDH包进聚合物基质中的方法，用透 析膜覆盖GDH的方法，和使用光致交联的聚合物、传导聚合物、氧化还原聚合物等的方法。 备选地，所述GDH可以与辅酶如NAD或NADP、或电子介质如二茂铁或其衍生物一起固定在聚 合物中或吸附/固定在电极上。本发明的GDH可以与作为辅酶的NAD或NADP —起固定在 电极上，备选地，所述GDH可以在不存在辅酶的条件下固定在电极上，并且辅酶可以作为另 一层或在溶液中提供。典型地，使用戊二醛将本发明的GDH固定在碳电极上，并且随后通过 用具有胺基的试剂处理而封闭戊二醛。葡萄糖浓度可以按下述测量。将包含缓冲液、GDH和作为辅酶的NAD或NADP的反 应溶液置于处于恒定温度的池中，并且保持温度恒定不变。向其中加入包含葡萄糖的样品， 并且在给定温度下反应给定的小时数。在该时间内，监测340nm处的吸光度。可以基于预 先用具有标准浓度的葡萄糖溶液准备的校正曲线，计算样品中的葡萄糖浓度。在速率测量 的情形中，葡萄糖浓度由每单位时间吸光度的增加速率来计算。在终点测量的情形中，葡 萄糖浓度由直到样品中所有的葡萄糖被氧化时测量的吸光度的增加来计算。此外，当使用 可见光区的量热法定量葡萄糖时，还可以加入适当的介质和着色剂。例如，可以通过加入 2,6-二氯靛酚(2，6-dichlorophenolindophenol) (DCPIP)等，并且监测 600nm 处吸光度的 减少而定量葡萄糖。备选地，可以通过加入吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate) (PMS) 作为介质，和加入硝基四唑蓝(nitrotetrazolium blue) (NTB)作为着色剂，并且通过测量 570nm处的吸光度，由此确定产生的二甲脂(diformazan)而确定葡萄糖浓度。所用的介质 和着色剂决不限于上述提及的那些。葡萄糖浓度还可以按下述测量。将缓冲液置于处于恒定温度的池中；加入辅酶，并 且需要时，加入介质；并且保持温度恒定不变。铁氰化钾、吩嗪硫酸甲酯等可以用作介质。 其上已经固定了本发明的GDH的电极用作工作电极，并且使用对电极(例如，钼电极)和参 比电极(例如，Ag/AgCl电极)。向碳电极施加特定的电压；在电流变得恒定后，加入包含葡 萄糖的样品，并且测量电流的增加。可以根据由具有标准浓度的葡萄糖溶液准备的校正曲 线计算样品中的葡萄糖浓度。GDH活性测量的实例在本发明中，除非另外指明，按照下述方法测量GDH活性。将900 ii L 反应溶液(90mmol/L N- 二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)，5mmol/L ^ -NADP+, 150mmol/L D-葡萄糖)转移到有盖石英池中，并且在60°C预热5分钟。将15yL ⑶H溶液与该反应溶液混合，并且在60°C反应3分钟；在反应过程中，测量340nm处的吸光 度。由吸光度改变的线性部分计算每分钟吸光度的增加(A0Dtest)。作为空白检验，将缓冲 液代替⑶H溶液与该反应溶液混合，并且如上述在60°C温育3分钟；记录340nm处的吸光 度，并且计算每分钟吸光度的变化(△( _■)。将这样获得的值代如下述方程，并且计算活 性值(U/mL)。此处，一单位(U)定义为在存在底物的条件下，每分钟还原1微摩尔辅酶的酶 量。
活性(U/mL)= [ ( A 0DTEST- A 0DBLANK) X 0. 915 X 稀释倍数]/ (6. 22 X 1. 0 X 0. 015)其中915 加入⑶H溶液后混合物的体积(mL)；6. 22 :NADPH的毫摩尔分子消光系数(cm2/微摩尔)；0:光径长度(cm);和015 加入的⑶H溶液的液体体积(mL)。蛋白质量化本文所引用的蛋白质的量通过Bradford法测量。更具体地，使用由Bio-Rad供应 的蛋白浓度测量试剂盒Bio-Rad蛋白测定(Bio-Rad ProteinAssay)，并且按照试剂盒所附 的手册进行测量。利用使用牛血清白蛋白(BSA)准备的校正曲线确定蛋白浓度。因此，本 文所引用的蛋白质的量根据BSA等价物计算。
实施例以下参考下述实施例具体描述本发明；然而，本发明不限于这些实施例。〈实施例1>超嗜热古细菌的培养和⑶H的纯化本发明人从鹿儿岛区的Kotakara岛的温泉水中分离的超嗜热古细菌。从其 16SrRNA的碱基序列，推测该菌株为分类为热变形菌属中的细菌菌株，其具有下述特征 (A)-(G) :(A)该细菌包含SEQ ID NO. 3所示的碱基序列作为编码16SrRNA的基因组DNA的 碱基序列；⑶该细菌可以在80°C以上生长；最适生长温度约为90°C ； (C)该细菌在基因组 DNA中具有58-60mol %的GC含量；(D)该细菌是严格厌氧性的；(E)该细菌在加入硫代硫 酸盐作为电子受体时表现出令人满意的生长；(F)该细菌可以在以下的NaCl浓度下生 长；和(G)该细菌是长杆形状的，长为10-3011111且宽约为511111。将具有上述特征的所述菌 株命名为热变形菌属(Thermoproteus sp.)GDH_l 菌株(Thermoproteus sp. GDH1)。为了培养⑶Hl，将包含下述成分的培养基置于无氧手套式操作箱中0.5%胰蛋 白胨，0. 5%酵母提取物，0. 5%硫代硫酸钠，0. 5%氯化钠，0. 005%硫化钠，和作为溶解的氧 的指示剂的刃天青(resazurin) (5mg/L)。然后，通过重复进行氮气置换而去除培养基中的 氧。将上述分离的菌株接种在该培养基中，并且在85°C静止培养3天。然后，将生长的微 生物细胞传代培养至其中向上述培养基组成中加入终浓度为0. 5%的葡萄糖的培养基中， 并且将这些细胞在85°C无氧培养3天。使用高速冷却离心机离心培养物(7L)，并且去除上 清，由此收集微生物细胞。将这些微生物细胞悬浮在20mL 50mM的磷酸钾缓冲液(pH 7. 0) 中。将该混悬液放置在冰上，并且使用超声波粉碎器(T0MY SEIKO CO.，LTD，UD-201)以3的 输出水平和40%的占空因数(duty cycle)处理10分钟，由此破碎微生物细胞。将破碎的 细胞溶液进行离心分离，以去除固体残渣，这样获得粗提液。将硫酸铵溶解在该粗提液中， 至终浓度为30%，并且在室温下搅拌20分钟，由此沉淀污染蛋白。通过离心分离去除沉淀 的蛋白。然后，向其中加入硫酸铵并且溶解，至终浓度为48%。将该溶液在室温下搅拌20 分钟，由此沉淀包含⑶H的级分。通过离心分离去除上清，并且将这样获得的⑶H级分溶解 在20mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中。将得到的溶液应用到柱体积为6mL的Resource Q(GE Healthcare (GE卫生保健))柱上，以将污染蛋白吸附在该柱中，并且使⑶H流过该柱。将硫酸铵溶解在该流过液中，至终浓度为22. 8%。将得到的溶液应用到疏水的Resource ISO柱(GEHealthcare (GE卫生保健)，体积为6mL)上，并且吸附在其上。吸附的蛋白用浓 度为22. 8%到0%的硫酸铵梯度洗脱，收集具有⑶H活性的级分。将级分用Superdex 200 作为分离柱和包含tris(50mM)和氯化钠(0. 15mM) WpH 7. 0的缓冲溶液作为洗脱缓冲液 进一步凝胶过滤。将这样获得的GDH级分用作纯化的溶液。〈实施例2>克降GDH基因将实施例1中获得的⑶H溶液(IOyL)与等量的2XSDS样品缓冲液(IOmM 1^8-此1，10%甘油，2%305，0. 溴酚蓝，2% (ν/ν) 2-巯基乙醇，pH 6.8)混合，并且将该 混合物在100°C煮沸10分钟。然后，将混合物应用至12. 5%丙烯酰胺凝胶上，并且在40mA 电泳，然后使用CBB Stain One (NACALAI TESQUE, INC.) CBB染色凝胶。将样品中的主要 条带从染色的凝胶上切下，并且通过质谱仪分析其肽序列。基于这样获得的推断氨基酸序 列，设计包含混合碱基的简并PCR引物，并且使用基因组DNA作为模板进行PCR反应。将该 PCR反应溶液应用至琼脂糖凝胶上进行电泳，并且用溴化乙锭染色。然后，在UV照射 下将与扩增的GDH基因的内部片段所对应的条带切下。然后，使用Wizard SV凝胶和PCR 净化系统(PCR Clean-up System) (Promega KK.)，从切下的凝胶块提取并纯化DNA。使用 TArget Clone Plus (T0Y0B0 Co.，Ltd. (T0Y0B0 有限公司))，按照 TA 克隆法，将获得的 DNA 片段连接至试剂盒所附带的克隆载体PTA2上。将连接产物加入到大肠杆菌JM109感受态 细胞(Τ0Υ0Β0 Co.，Ltd. (Τ0Υ0Β0有限公司)，高感受态JM109)中，通过热激转化，涂到包含 100 μ g/mL氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上，并且在37°C培养过夜，以形成转化的菌落。将 多个菌落接种到5mL LB培养基(包含100 μ g/mL氨苄青霉素)中，并且培养过夜。使用 Quantum Pr印少量制备试剂盒(Bio-Rad Laboratories, Inc. (Bio-Rad 实验室公司))，按 照试剂盒手册，从培养物提取质粒。通过分析每种提取的质粒的插入片段的碱基序列，确定 预期GDH基因的部分碱基序列。然后，基于所确定的序列，设计针对该内部区域序列之外的 引物。使用该引物和LA PCR体外克隆试剂盒(TAKARA BIO INC.)，扩增⑶H基因的5‘和 3'末端区域，并且确定它们的碱基序列；由此确定该基因的完整碱基序列。所确定的碱基 序列显示在SEQ. ID NO. 1中，并且推定的氨基酸序列显示在SEQ. ID N0. 2中。〈实施例3>构建GDH表达载体将设计具有在GDH基因起始密码子处具有NdeI位点和紧接GDH基因终止密码子 后具有BamHI位点的序列的引物用于进行以超嗜热菌基因组DNA作为模板的PCR反应。将 反应溶液应用与琼脂糖凝胶，电泳，并且用溴化乙锭染色。然后，在UV照射下切下所扩 增的⑶H基因条带。然后，从切下的凝胶块提取和纯化DNA。使用TArget Clone Plus，将 获得的DNA片段插入到试剂盒所附带的克隆载体pTA2中(pTA2TGDHl)。进行下述操作，以 在不改变待编码的氨基酸的条件下，用另一种碱基序列替换存在于GDH基因内部的所插入 的 NdeI 位点(CATATG)。使用具有包括 5，-AGCACGGCATTTGGGGGCTCC-3，(SEQ. ID N0. 4) 和5，-GGAGCCCCCAAATGCCGTGCT-3，(SEQ. ID N0. 5)的碱基序列的寡DNA作为引物，使用上 述获得的PTA2TGDH1作为模板，在热循环仪中进行与PCR类似的反应。然后，向其中加入 Dpnl，相对于反应溶液其量为2质量％，将混合物在37°C处理1小时。由此，消化了模板(PTA2TCDH1)。将该DpnI处理的溶液加入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Τ0Υ0Β0 Co.，Ltd.， 高感受态JM109)中，通过热激转化，涂到包含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上， 并且在37°C培养过夜，以形成转化的菌落。将多个菌落分别接种到5mL LB培养基(包含 100 μ g/mL氨苄青霉素)中，并且培养过夜。使用Quantum Prep少量制备试剂盒，从所述培 养物提取质粒。分析这样获得的每种质粒的碱基序列，以验证编码GDH氨基酸序列中位置 113处的异亮氨酸的密码子由ATA转化成ATT，即，在⑶H基因序列位置339处的A替换为 T，并且将产物指定为具有修正序列的质粒pTA2TCDH2。用NdeI和BamHI对该pTA2TCDH2进 行限制酶处理，并且在琼脂糖凝胶中电泳，切下包含GDH基因(分别在5’和3’端具有 NdeI和BamHI切割末端)的凝胶块。然后，使用WizardSV凝胶和PCR净化系统，提取并且 纯化DNA。将该DNA与已用相同的限制酶处理的表达载体pET21a混合。将该混合的溶液与 等量的LigationHigh (Τ0Υ0Β0 Co.，Ltd. (Τ0Υ0Β0有限公司))混合，并且在16°C温育30分 钟进行连接。将该连接溶液加入到大肠杆菌JM109感受态细胞中，通过热激转化，涂到包含 100 μ g/mL氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上，并且在37°C培养过夜，以形成转化的菌落。在 这些转化的菌落中，将通过菌落直接PCR验证包含插入物的那些菌落接种在5mL LB培养基 (包含100 μ g/mL氨苄青霉素)中，并且培养过夜。使用质粒提取试剂盒，由通过离心分离 培养物获得的微生物细胞提取质粒。分析每种质粒的插入物的序列，以验证所述质粒包含 正确的基因序列。将该质粒指定为表达载体(pET21aTCDH2)。〈实施例4>GDH基因表汰和纯化按照大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Stratagene)所附的手册，将在实施例3 中获得的pET21aTGDHl进行热激，以获得转化的菌株。将这些转化的菌落悬浮在处于8个 检测管中的5mL LB培养基(包含100 μ g/mL氨苄青霉素)中，并且在37°C摇动培养过夜。 将这样获得的培养物接种到4个2L体积的Sakaguchi瓶中，每个瓶包含800mL LB培养基 (具有100 μ g/mL氨苄青霉素)，从而使每个瓶中接种SmL的培养物。将这些瓶在37°C以 120rpm摇动3小时。然后，当细胞浊度在660nm处达到约0. 6时，向其中加入IPTG，至终浓 度为0. ImM。然后，继续在37°C以120rpm摇动培养4小时。使用高速冷却离心分离机离心 分离培养物，并且通过倾析去除上清。将这样获得的微生物细胞悬浮在70mL 50mM Tris-盐 酸缓冲液+0. IM NaCl(pH 8.0)中。将该混悬液使用超声波粉碎器(T0MYSEIK0 CO.，LTD, UD-201)以4的输出水平和40%的占空因数(dutycycle)处理20分钟，由此破碎微生物细 胞。将破碎的细胞溶液进行离心分离，以去除残渣，由此获得粗提液。将这样获得的粗提液 在85°C处理30分钟，以使污染蛋白变性，所述污染蛋白然后通过离心分析去除。使上清级 分通过用50mM Tris-HCl · 0. IM NaCl (pH 8. 0)缓冲的Resource Q柱，然后在其中溶解硫 酸铵，相对于流过液其量为21. 3质量％。将该溶液吸附到用50mM Tris-HCl · 22. 8%硫酸 铵(pH 8.0)缓冲的Resource ISO柱上，并且通过将硫酸铵浓缩液的浓度减至0%进行梯度 洗脱，从而收集⑶H级分。将这些级分使用Superdex 200进一步进行凝胶过滤，并且将这 样获得的⑶H级分用作纯化的重组⑶H溶液。通过SDS page的CBB染色证实该纯化的溶 液是显示单一条带的纯化产物。〈实施例5>重组0)H的辅酶浓度依赖性和底物浓度依赖性
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使用在实施例4中获得的⑶H，确定本发明的⑶H在60°C和pH 8. 0的最大反应速 率(Vmax)和米氏常数(Michaelis constant) (Km)。计算方法如下改变底物浓度和辅酶 浓度，以通过按照上述活性测量实施例的方法测量活性，并且由使用双倒数作图通过最小 二乘法确定的直线计算常数。结果，当使用NAD作为辅酶时，关于NAD的米氏常数(Km)为 10. 3mM，关于葡萄糖的米氏常数(Km)为66. 9mM。在IM葡萄糖浓度的最大反应速率(Vmax) 为1670U/mg。此外，当使用NADP作为辅酶时，关于NADP的米氏常数(Km)为0. 075mM,关于 葡萄糖的米氏常数(Km)为5. 27mM。在5mM辅酶浓度的最大反应速率(Vmax)为333U/mg。 从关于每种辅酶的米氏常数看来，推测本发明的GDH主要使用NADP作为其体内活性的辅 酶；然而，当使用NAD时，最大反应速率高约5倍。〈实施例6>重组⑶H的温度稳定件使用实施例4获得的⑶H研究温度稳定性。将蛋白浓度为0. 17mg/mL的⑶H溶液 (溶解在50mM Tris-HCl，0. lM，NaCl，pH 8. 0)在50°C _95°C范围内的温度下加热30分钟， 并且将加热前的活性与加热后的活性进行比较。加热后活性相对于加热前活性的比率(活 性残存率)如

图1所示。本发明的酶在90°C显示出96%的活性残存率，在95°C显示出85% 的活性残存率.〈实施例7>重组⑶H反应谏率的温度依赖件使用实施例4获得的GDH研究反应速率的温度依赖性。使用变化的反应温度85°C， 80°C，6(TC，37°C，和25°C，通过按照上述活性测量实施例的方法来研究在每一反应温度的 活性。表1显示该结果。该酶在约85°C表现出最高活性。发现该酶甚至在室温下表现出活 性。例如，在37°C活性为40U/mg，在25°C为18. 6U/mg。[表1] 〈实施例8>重组GDH的DH稳定件使用实施例4获得的GDH研究pH稳定性。所用的缓冲溶液为0. IM柠檬酸缓冲液 (pH 4. 3-6. 2)，0. IM磷酸钾缓冲液(pH 6. 1-8. 1)，0. IM N-二 (羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 7. 9-8. 8)，和0. IM甘氨酸缓冲液(pH 8. 8-10. 6)。将⑶H添加到每种缓冲溶液中，至终浓度为5 μ g/mL,并且在加入后立即测量活性。将⑶H溶液进一步在25°C温育24小时，并且测 量温育后的活性。温育后活性相对于温育前活性的比率(活性残存率)显示在图2中。本 发明的⑶H在5. 8-9. 2的pH范围内没有经历活性降低，并且在4. 8-9. 7的pH范围内表现 出90%以上的活性残存率。〈实施例9>重组⑶H反应谏率的DH依赖件使用实施例4获得的GDH研究反应速率的pH依赖性。活性通过按照活性测量实 施例中的方法测量。作为与所述活性测量实施例中所示的反应溶液的成分中的N-二(羟 乙基)甘氨酸相对应的缓冲液成分，对于PH 6. 5-7. 9使用磷酸钾，对于pH 7.9-8.8使用 N- 二(羟乙基)甘氨酸，对于pH 8. 6-9. 7使用CHES，并且对于pH 9. 8-10. 2使用甘氨酸。 图3是显示相对活性的图，其中假定最高活性为100。关于本发明的GDH的最适pH范围分 布在碱性一侧。活性在PH 9. 7最高。〈实施例10>重组⑶H的底物特异件研究实施例4获得的GDH与各种糖的反应性。在上述活性测量实施例中所示的反 应溶液的成分中使用5mM NADP或NAD作为辅酶，和150mM糖如葡萄糖、木糖、半乳糖、麦芽 糖、乳糖、山梨糖醇、蔗糖、和甘露糖作为底物，测量活性。表2显示与每种底物的相对活性， 其中假定与葡萄糖的活性为100。当使用NADP作为辅酶时，基于与葡萄糖的特异性活性，与 木糖和麦芽糖的特异性活性约为2%，并且与半乳糖和甘露糖的特异性活性约为1%。几乎 没有观察到与乳糖、山梨糖醇、和蔗糖的反应。另一方面，当使用NAD作为辅酶时，基于与葡 萄糖的特异性活性，与木糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、山梨糖醇、和蔗糖的特异性活性 小于1%。特别地，考虑到该酶与半乳糖和木糖的反应性，发现与来源于超嗜热古细菌的已 知的GDH相比较，该酶具有极佳的底物特异性。[表2]底物 在存在NAD的条件下 在存在NADP的条件下葡萄糖100100
木糖0. 12. 2
半乳糖> 0.11. 1
麦芽糖> 0.12. 4
乳糖0. 30. 1
山梨糖·淳> 0.10. 2
蔗糖> 0.10. 2
甘露糖> 0.11. 2〈实施例11>重组0)H反应速率的钾离子浓度依赖性使用实施例4获得的GDH研究反应速率的钾离子浓度依赖性。使用向活性测量 实施例中所示的反应溶液成分中加入不同浓度的KCl的反应溶液，测量GDH活性。在将没 有KCl的活性假定为100的情形中的相对活性如下在KCl浓度为0. lmol/L时为129 ；在 0. 2mol/L时为133 ；在0. 5mol/L时为146 ；且在1. Omol/L时为150。发现本发明的GDH活性随着钾离子浓度增加而增加，并且在钾离子浓度范围0. 5mol/L以上时，活性保持几乎是 相同的。〈实施例12>使用重组0)H定量葡萄糖作为用于葡萄糖定量的试剂，制备包含下述成分的pH 8.0的溶液0. lmol/L N- 二(羟乙基)甘氨酸，0. 5mol/L KCl,20mmol/L β -NAD，和lU/mL⑶H(在实施例4中获 得；活性按照上述活性测量实施例测量)。将该试剂(900 μ L)置于石英池中，放置在处于温 箱内的(incubator-housed)吸收分光光度计中，并且在25°C预热5分钟。然后，向其中加 入葡萄糖溶液(15 μ L)，以获得这样的溶液，其中在所述溶液中葡萄糖的终浓度为2，5，10， 和15mmol/L，并且在每种葡萄糖浓度下在25°C进行反应3分钟，从而监测340nm处吸光度 的变化。由3分钟内吸光度变化的线性部分计算每分钟吸光度的增加，并且减去在代替葡 萄糖加入蒸馏水时发生的吸光度变化。将得到的值(AmAbs/分钟)绘图(图4)。葡萄糖 浓度沿着横轴绘图，并且AmAbs/分钟沿着纵轴绘图。绘图点的轨迹绘出一条直线。通过 最小二乘法确定的回归线决定系数为R2 = 0. 9993。因此，验证了可以使用本发明的GDH来 准确定量葡萄糖浓度。工业适用性本发明生产的葡萄糖脱氢酶可以提供为用于测量血液葡萄糖水平的试剂，和提供 为用于血液葡萄糖传感器和葡萄糖定量试剂盒的物质。附图简述图1显示包括与SEQ ID NO :2相同的氨基酸序列的大肠杆菌重组⑶H的温度稳定 性。纵轴显示活性残存率(在每一温度下热处理30分钟后的相对活性，其中假定热处理前 的⑶H活性为100% )，并且横轴显示在热处理过程中的温度。图2显示包括与SEQ ID NO :2相同的氨基酸序列的大肠杆菌重组⑶H的pH稳定 性。纵轴显示活性残存率(在每一PH条件下在25°C加热24小时后的相对活性，其中假定热 处理前的⑶H活性为100% )，并且横轴显示反应溶液的pH。数据使用用于pH 4. 3-6. 2的 0. IM柠檬酸缓冲液；用于pH 6. 1-8. 1的0. IM磷酸钾缓冲液；用于pH 7. 9-8. 8的0. IMN-二 (羟乙基)甘氨酸缓冲液；和用于PH 8. 8-10. 6的0. IM甘氨酸缓冲液获得。图3显示包括与SEQ ID NO 2相同的氨基酸序列的大肠杆菌重组⑶H的pH依赖 性性。纵轴显示相对活性(在每一 PH条件下的相对活性，其中假定最高活性为100%)，并 且横轴显示反应溶液的pH。数据使用用于pH 6. 5-7. 9的磷酸钾缓冲液；用于pH 7.9-8.8 的N- 二(羟乙基)甘氨酸缓冲液；用于pH 8. 6-9. 7的CHES缓冲液；和用于pH 9. 8-10的 甘氨酸缓冲液获得。图4显示使用标准葡萄糖溶液为包括与SEQ ID NO :2相同的氨基酸序列的大肠杆 菌重组GDH准备的校正曲线。纵轴显示每分钟340nm处吸光度的增加率(AmAbs/分钟)， 并且横轴显示反应溶液中的葡萄糖浓度。
2权利要求
一种葡萄糖脱氢酶，其具有基于其与葡萄糖的反应性，小于3％的针对麦芽糖、半乳糖和木糖的反应性，并且具有80℃以上的温度稳定性。
2.根据权利要求1所述葡萄糖脱氢酶，其在葡萄糖氧化反应中利用烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)作为辅酶。
3.来源于超嗜热古细菌的葡萄糖脱氢酶，所述葡萄糖脱氢酶具有下述特性(A)-(F)(A)温度稳定性90°C以下；(B)pH稳定性4. 8-9. 7 ；(C)最适反应温度85°C；(D)最适pH 9. 7 ；(E)辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)；(F)底物特异性当使用NADP作为辅酶时，所述葡萄糖脱氢酶基于其对葡萄糖的活性， 表现出2%以上且小于3%的针对木糖和麦芽糖的活性，和基于其对葡萄糖的活性，表现出 1 %以上且小于2 %的针对半乳糖和甘露糖的活性，所述葡萄糖脱氢酶基本上不与乳糖、山 梨糖醇、和蔗糖反应；并且当使用NAD作为辅酶时，所述葡萄糖脱氢酶基本上不与木糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、 乳糖、山梨糖醇、和蔗糖反应。
4.具有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶。
5.包括由SEQID NO. 2所示的氨基酸序列缺失、取代、插入、或添加一个或多个氨基酸 所形成的氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶，所述葡萄糖脱氢酶具有的活性基本上等于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶的活性。
6.编码权利要求1-5中任一项所述的葡萄糖脱氢酶的DNA。
7.包括权利要求6所述的DNA的表达载体，所述DNA被功能性偶联到在引入所述DNA 的宿主细胞中可操作的启动子上。
8.使用权利要求7所述的表达载体转化的转化微生物。
9.根据权利要求8所述的转化的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)ο
10.用于生产权利要求1-5中任一项所述的葡萄糖脱氢酶的方法，其包括培养权利要 求8或9所述的微生物，并且从所得到的培养物收集葡萄糖脱氢酶。
11.用于定量葡萄糖的组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的葡萄糖脱氢酶。
12.用于定量葡萄糖的方法，其包括使用权利要求1-5中任一项所述的葡萄糖脱氢酶来定量葡萄糖。
全文摘要
本发明提供一种葡萄糖脱氢酶，其是一种具有80℃以上的热稳定性的非常稳定的酶，并且其基本上不作用于除葡萄糖外的糖类。本发明还提供用于生产所述酶的方法，和用于使用所述酶来定量葡萄糖的组合物。本发明提供一种葡萄糖脱氢酶，其具有基于其与葡萄糖的反应性，小于3％的针对麦芽糖、半乳糖、和木糖的反应性，并且具有80℃以上的温度稳定性。
文档编号C12N9/04GK101918553SQ20088012411
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月26日 优先权日2008年1月7日
发明者今中忠行, 相场洋志, 西矢芳昭, 迹见晴幸 申请人:东洋纺织株式会社;国立大学法人京都大学