青霉素酰化酶的凝胶团聚体状稳定生物催化剂及其制备方法

专利名称：青霉素酰化酶的凝胶团聚体状稳定生物催化剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂。本发明还涉及到使用 一种简易固化同时结合沉淀、交联及包埋的方法来制备生物催化剂，这种方法易于实现扩 大再生产，其中固化过程中使用的是无毒材料。
背景技术：
酶如果溶于水或水与其他共溶剂的混合液中，只能是单次使用的转化循环。为了 克服这个缺点，出现了固化技术。作为催化剂的酶在工业生产过程中使用越来越多，导致对酶的固化形式产生的需 求在不断增加。经常被称之为“生物催化剂”的固化酶被广泛用于工业有机合成和生物转 化。据2002年的调查，目前有130多个生物转化产业在大规模地使用生物催化剂，主要集 中在医药中间体和其它精细化学品的生产中。多年来广为接受的固化技术，有着显著地变 化和改进。今天，固化是针对特定用途及用于像加工固化抗体、大分子复合物和结构蛋白质 为目的而进行的，但是固化酶(生物催化剂)起着巨大的作用。生物催化剂是采用全活的或全死的细胞或其制得的酶来生产的。酶的来源可以是 不同植物和动物以及微生物。酶的生产规模集中扩大以及蛋白质工程的研究进展使得有可 能生产出商业规模经济可行的生物催化剂。酶的反应特别高效，它是基于酶的特定条件，例如特定的培养基、活性、对应选择 性、生产力、稳定性、最适PH和最适温度等等。缺乏作用稳定性以及相对较高的价格阻碍了 大量酶的商业化。如果能找到一个有效的固化方法，这个障碍是可以克服的。如果能够成 功，这将不仅可以提高选择性和作用稳定性，而且可以简易地分离，使酶可以重复利用并简 化下游加工。因此选择合适的固化方法来生产合适的生物催化剂变得至关重要。从概念上讲，固化有几种方法。其中包括吸附、载体捆绑、诱导和交联。物理吸附 依赖于酶和载体的亲和力。虽然简单，但是吸附作用微弱，酶可随时解吸和失去。载体捆绑 涉及通过离子或共价键连接酶和水的不溶物。这个过程有一个缺点，因为强的化学键会使 酶分子部分失活。另外，目标酶需要更加纯化，最终会提高催化剂的生产成本。第三种固化方法涉及在凝胶或由适当的有机或无机天然物或合成聚合物制成的 微胶囊中进行确定酶的诱导。这种方法的优点是由于改变了强共价键，因此不会使蛋白质 的失活。所选择凝胶基质或纤维形成的孔隙大小可适当调整，以容纳超高分子量的酶分子。 然而，通过选择性地允许小反应物分子的通过，从而排除了从载体中分离酶的其他可能。更 多的时候，诱导方法是与交联方法在一个数量配置下相结合，特异性的双功能剂如戊二醛 与蛋白质构成的大聚合物形成了分子共价键。交联还使包埋酶具有一定强度和物理力量； 此外，支持物通常似乎用于与整个细胞的相容包埋，所用的酶与那些用于共价捆绑的相比 具有低特异性和低纯度。这基本上使这个方法更符合成本效益。大量的文献表明可以用不同的材料和产品来形成固化酶。
一篇名为“利用基质孔隙与戊二醛交联从粪产碱菌中固化出药用的全细胞青霉素 G酰化酶”，程世伟等人，(生物技术通讯，2006年7月，28卷(14) :1129_1133)公开了当细 胞透过0. 3% (w/v) CTAB时，来自粪产碱菌的青霉素G酰化酶的活性增加7. 5倍。处理后的 细胞被聚乙烯醇与硼酸的交联体包埋，并与2% (ν/ν)戊二醛交联以增加稳定性。在固化系 统的大量反应中，青霉素G转化为6-氨基青霉烷酸的转化率为75%。15个循环后活性没 有降低，并且65%的酶活性保留到第31个循环时结束。美国专利号为4727030和4978619的专利也公开了凝胶基质用于酶或细胞的固 化近来，交联酶聚集体(CLEAs)作为固化酶，具有越来越重要的作用，并视为利用聚 合体进行固化的有利选择。但是，它的工业生产可行性需要进一步的评估，因为大多数酶的 CLEA粒子太小，会引起严重的过滤问题。虽然，CLEA具有高酶活的明显优点，但是这种操作 引起的过滤问题阻碍了商业上的开发。重要的工作已经在这一特定领域报道并公开，但是只有少数技术已成功地用于商 业水平。来源于微生物的青霉素酰化酶通常以固化形式应用于内酰胺抗生素的中间体 合成。文献报导，全细胞青霉素酰化酶催化剂，酶的固化通过包埋或共价交联纯化酶的形 式，包括基于交联酶晶体(CLEC)和交联酶聚集体CLEA的催化剂。青霉素酰化酶的固化通过二甲苯二胺与戊二醛(Poly-XDA-GA-PA)的交联，团聚 体(r) 7500包埋在凝胶和壳聚糖中，PGA-450FERMASE PA250，全细胞与聚乙烯亚胺交联，仅 举几例。美国专利号为5846762的权利要求利用含丙二醇的凝胶和含戊二醛的藻酸盐来 形成含有不同酶的包埋酶的凝胶珠。美国专利号为6060268的权利要求制备固化青霉素G酰化酶，通过与交联凝胶体 和其他诸如海藻酸胺、壳聚糖或聚乙烯亚胺的聚合物的交联共价连接。通过任何方式固化的酶已经出现，一个理想的工业固化酶需要符合若干标准，例 如可回收性、广泛适用性、成本效益、环境和安全问题。此外，固化的工业规模条件更加严 格，因为由于使用了多官能团的反应物，导致细胞或酶失活。此外，固化生物材料较低的物 理力量会阻碍孔隙的扩散极限，从而限制了催化剂的长时间使用。因此，固化酶的失活处理 也应该占据工业规模。这一点在某些酶的情况中尤其明显，像固化青霉素酰化酶成吨用于 生产半合成内酰胺抗生素，在中间体和最后药物分子的制备中都有用到。因此，需要开发一种高活性和作用稳定性的生物催化剂，在水解和催化合成中具 有多种用途，即在半合成内酰胺抗生素的生物转化领域，而本发明已经实现。

发明内容
如上文所述，本发明公开了一种稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂及其固 化方法。所述的固化方法的原理是沉淀部分纯化酶，同时使用如戊二醛等交联剂进行团聚， 并包埋到如凝胶等天然聚合物和如聚乙烯醇等合成聚合物的混合物中，然后在温和的温度 和ρΗ中进行有效的凝胶化，获得一种稳定的生物催化剂。因此所获得的这种稳定的生物催化剂是一种有效的固化产物，其中酶是留存于凝 胶基质中，而不会分散开来。所述的凝胶材料形成一种稳定的基质，该基质不仅能抗机械压力，防止酶活降低，还能增加酶反应物的转化总量，因此可以降低浓度梯度的最低值。
本发明一方面使用了 rE. coli REIII (pKA18)分泌的、具有高效水解活性的青霉素 酰化酶，还使用了 rE. coli BL21 CCM7394 (pKXIPl)和 rE. coliREXIII (pKXIPl)分泌的、具 有高效合成活性的新青霉素酰化酶，它能制备固化的、稳定实用、高效且作用稳定的生物催 化剂。本发明的一个选择性的方面是也可以使用全细胞。也可以使用相似的方法来固化 其它的酶，如脂肪酶、蛋白酶、醛缩酶、异构酶等。本发明的另一个方面是使用在低温下被硫酸铵充分沉淀后纯化的部分酶，其中硫 酸铵的浓度优选适用于每种酶，该浓度范围为20-50克/克蛋白质。然后沉淀形成的酶与 如戊二醛(GA)等双官能剂交联，形成稳定的团聚体。这种颗粒阶段含有非特定蛋白质，它 可以辅助交联，增加所形成的团聚体尺寸，使团聚体反复留存在包埋中不发生分散。缩写词6-APA 6-去乙酰氧基头孢烷酸7-ADCA 7_去乙酰氧基头孢烷酸PAA:苯乙酸rE. coli 重组大肠埃希菌w/w:重量比w/v 重量比体积ν/ν:体积比W:重量HPGMe :D-p-羟基苯甘氨酸甲酯PVA:聚乙烯醇GA 戊二醛U 活性单位活性的定义是指在单位时间里，标准条件下，为每种酶催化1微摩尔底物或催化 生成1微摩尔产物的量。


图1所示的是固化催化剂的稳定性(蓝线例1，例如:rE. coli REIII (pKA18)分 泌的酶沉淀，粉红线例2，rE. coli BL21 CCM 7394分泌的酶沉淀)。图2所示的是蛋白质浸析程度(蓝线例1，例如:rE. coli REIII (pKA18)分泌的 酶沉淀，粉红线例2，rE. coli BL21 CCM 7394分泌的酶沉淀)。图3所示的是生物催化剂的青霉素G水解活性曲线。图4所示的是反应温度对生物催化剂的青霉素G水解活性产生的影响。图5所示的是重复了 30个转化循环的阿莫西林的酶合成。图6所示的是重复了 50个转化循环的阿莫西林的酶合成。图7所示的是含有不同酯类的阿莫西林实例。
具体实施例方式下面将结合优选和选择性的实施例详细描述本发明，通过各种改变来辅助读者更 充分地理解评估本发明。因此本发明包括在低 温下通过盐析天然蛋白质溶液，形成部分可溶性沉淀，在交 联剂的辅助作用下进一步交联形成团聚体，从而获得沉淀团聚的酶。在一个优选的实施例中，本发明提供了一种稳定实用、高效且作用稳定的生物催 化剂，其制备方法包括以下步骤(a)在1°C _2°C的温度下，沉淀同时交联含有硫酸铵和戊二醛的酶液，获得交联的 酶团聚体；(b)使交联了硫酸铵和戊二醛的酶在18至23摄氏度，优选20至21摄氏度的高温 下进行转化而自己产生固化交联的酶团聚体；(c)在低温下，将所述的团聚酶于10% w/w的聚乙烯醇和10% w/w的凝胶混合溶 液中包埋；(d)然后在5°C的低温下继续凝胶化12个小时；(e)过150微米筛，得到凝胶酶，于是获得均勻分布的凝胶团聚体；(f)将戊二醛与凝胶团聚体在30°C，pH7. 5-7. 6中进一步的再交联30分钟，以提 高结构的稳定性。在优选的实施例中，所述的酶选自rE. coli REIII (pKA18)分泌的、具有高效水解 活性的青霉素酰化酶，rE. coli BL21 CCM7394 (pKXIPl)和rE. coliREXIII (pKXIPl)分泌的、
具有高效合成活性的新青霉素酰化酶。使用的沉淀剂主要是无机盐或生物聚合物或它们的溶液或混合物。其中是根据 沉淀的酶来进行选择的，并且沉淀不能对酶的活性和稳定性产生负面影响。一些公知且传 统使用的沉淀物包括季铵盐和聚乙二醇及其溶液，如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮和叔丁 醇。可以使用多胺，但这些都是公知的能与交联过程发生反应，因此优选使用硫酸铵。硫酸铵的使用量一般高于其水饱和浓度。据文献报道，百分率范围为10-80%。但 是，它必须用于特定的酶及相关过程。因此，在本实施例中，硫酸铵的浓度是根据酶液的蛋 白质浓度确定的。优选的浓度是20-30克/克蛋白质。因此，饱和浓度范围为50-70%。优 选在0-5°C，更优选1_2°C的低温下进行沉淀，形成凝胶团聚体。使pH7-7. 5维持30_60分钟，开始产生沉淀，5°C下继续12小时后使团聚更充分。离 心，分离出沉淀。酶分子数和它们在团聚物中的存在方式会明显影响酶活性。在团聚的过程 中会降低酶的溶解度。这时，酶会发生变性，于是就能优化确定过程中的团聚时间和温度。1_2°C下，在缓冲液中进行5分钟交联，同时加入交联剂加速交联。使用的缓冲液 为0. 1Μ、ρΗ为6. 5-7. 5的磷酸钠缓冲液，它用于优化酶。可以在一个实施例中选择上述方法中所述的交联时间、温度和戊二醛添加物来形 成一种不溶的沉淀，即交联后的酶团聚物(CLEA)。尽管有各种公知的交联剂，但是戊二醛是一种低廉且功能最多的试剂。已经 研究出适于每种酶的浓度范围。如果是青霉素酰化酶，能获得最好效果的浓度范围为 1.7%-2.0%。但是优选的浓度为终产物质量的1.7-1.8%。如果是新青霉素酰化酶，那么 选择相似，优选的浓度范围为1.0-1.5%。
本发明的优选实施例中使用了各种用于包埋过程的载体材料。可以使用有机物和 无机物，天然的或合成的、丙烯酰胺、壳聚糖、海藻酸钠、聚乙烯醇、凝胶。在合适的浓度中， 两种或两种以上的材料混合的混合物形成稳定的固化生物催化剂。最合适的载体还可以选 择性地用于产品开发。各种材料通常可以用于不同过程和酶的包埋。通常优选的材料是如丙烯酰胺的合 成物或如海藻酸钙、角叉菜胶、凝胶等天然物。选择那些能影响过程的因素。虽然如丙烯酰 胺的单体能相对形成无活性的聚合物，该产物可能含有未聚合的单体残留物，这可能会对 操作者带来危险，还需要处理问题。此外，聚合引发剂二甲氨基丙腈是剧毒，必须非常小心
处理。 温和条件下，在褐藻钙凝胶中形成包埋获得固化，该包埋广泛地用于全细胞的固 化。然而因为这些系统存在作用稳定性和酶浸析效果的内在问题，所以其提高的可能性较 小。除了丙烯酰胺、壳聚糖、海藻酸钙；凝胶也具有良好的潜在凝化性能。凝胶是一种 动物蛋白，往往会在某些温度的溶液中形成凝胶。根据所使用的凝胶黏度和凝胶强度，凝胶 可以与其他高分子材料混合来提高其强度。通过优化凝胶的浓度，并使用其它聚合物，可以 控制这种凝胶的孔径。此外PVA与酶的水溶液混合物在低温下形成一种脱水凝胶，其中凝胶可以模制成 需要的形状。然而，加入任何其他高分子材料还可以增加保水性和机械强度，但需要优化。由于丙烯酰胺一直被用作聚合剂，并且它使用时添加了(PVA)和凝胶；但其产物 的产量比没有使用含凝胶和聚乙烯醇的丙烯酰胺更低。其中一个原因就是聚合的不充分， 这可以从所形成的非常软的材料明显看出。这可能会导致酶从固化酶中滤去，使产量降低。 虽然可能会改善交联和聚合，但是通常会选择不使用危险材料，如丙烯酰胺。因此就无法进 行进一步的操作。当用壳聚糖代替PVA时会使终产物的稳定性较低。据报道，壳聚糖与凝胶混合用 于固化(团聚)，但是凝胶和壳聚糖的浓度需要进一步优化，以增加终产物的量。为了克服上述的缺点，本发明使用了聚乙烯醇，它与凝胶一起作为聚合体用于青 霉素酰化酶的固化，它与丙烯酰胺、海藻酸钙或壳聚糖相比能形成更好的包埋聚合体。本发明所使用的聚乙烯醇，其分子量为125000，粘度为35_50cs。所使用的凝胶为 药用凝胶。优选使用分子量超过100000的高分子量PVA。商用PVA具有幅度较广的分子量分布，其分散度指数的范围为2到5。分子量会影 响很多性能，如粘度、可结晶性、机械强度和扩散性。PVA的分子量与聚合度直接成正比。聚合度会影响PVA在水中的溶解度。具有高 聚合度和水解能力的PVA，其分子量超过77000，其中疏水的醋酸基削弱了其相邻羟基的内 分子氢键。因此，当温度升高70°C以上，就会发生分散。它在加入到酶中之前必须冷却。药用的PVA可与如戊二醛等通常不溶于水的试剂进行交联。PVA可以形成水凝胶， 它作为亲水基与聚合体交联。PVA的这种特殊性尤其能用于固化，因为它往往会保持水分， 防止酶发生脱水，使其保持活性状态。由于大分子形式的PVA可以形成一种带交联剂的凝 胶，因此适于在本实施例中使用。另一个聚合物，凝胶广泛地用于食品和制药工业。凝胶具有天然的胶粘性，有助于颗粒的团聚。凝胶溶液在这个过程作为粘结剂，用于形成含有活性剂、粘结剂、稀释剂和助 流剂的大团聚体。在粒状过程中使用凝胶可以有效地减少了细小粒子，保持了生理惰性。在 聚合物的悬浮液中凝胶是用于控制颗粒的大小，并防止颗粒发生聚结。使用的凝胶为溶液形式，其浓度在10到20%之间，用热水溶解凝胶，从而在加入 酶进行固化之前形成一种纯净的溶液。PVA和凝胶浓度均作为适于凝胶化的前聚物，并且 在本发明的方法中已经根据需要的产物性能进行了优化。聚乙烯醇的浓度是终产物重量的 4. 5-7. 5%，其中凝胶的浓度为1_5%，优选为聚乙烯醇重量的1. 2-1. 5倍此外，聚合物的包埋是通过与如戊二醛(GA)等双功能剂进行交联来完成的。GA已 被广泛地报导作为交联剂使用。通过优化用于某个特定酶的戊二醛浓度，来维持其催化活 性，于是可以获得一个相对稳定的产物。GA与蛋白质分子的氨基基团一起形成席夫碱，从而 有助于更好的交联，通过减少硼氢化钠和席夫碱获得不可逆转的连接，这里发现不适用于 青霉素酰化酶，因为它失去了酶的稳定性。在本发明的方法中，凝胶是蛋白质，凝胶的使用进一步增强了 GA的连接，从而获 得更好的包埋和稳定产物。本发明所述的产品和方法都具有显著的优点，因为这些原料都是现成无毒的，可 能会存在较小的处理问题，因此具有商业化的可能，本发明方法的使用可延伸到其他酶。通过与天然酶参数的比较，可以确定青霉素酰化酶或新型青霉素酰化酶固化的效 果。在水解和合成方面，这些酶的活性比天然酶的更高。其重量和活性产率是工业水平可 接受的。本发还包括包埋剂，聚乙烯醇和凝胶混合溶液的准备。在温水中制备每种单独试 剂的溶液，然后加热到90°C使之充分溶解。将上述准备的每种溶液加入到5°C，用 带有聚四氟乙烯刀片的架空搅拌器搅拌使搅拌速度达到200rpm的聚合酶溶液中，形成凝 胶。青霉素酰化酶固化中使用的PVA和凝胶的比例范围为1 1. 1到1 1.5，优选1 1.3。 凝胶还可以在5°C下保存12小时，使其发生冻结。在这段时间里，未反应的戊二醛可以与凝 胶发生反应，这似乎会使凝胶硬化，改进产物的结构。然后将形成的凝胶体在30目筛中机 械过滤，以获得合适大小的球形凝胶珠。在所有的形状中优选球形珠，因为它的面积/体积 比最大，本方法也可以选择获得同样效果的不同形式。这些凝胶珠在30°C的温度、7. 2-7. 5 的PH中进一步与0. 5% -0. 75%的戊二醛进行再交联40分钟。这种进一步的交联改进了 产物的稳定性，防止任何酶和辅助材料被滤去，因此在本方法中是一个至关重要的步骤。辅 助材料或蛋白质的过滤情况可以通过对波长为280nm到600nm时的吸光率进行检测得知。 然后水洗凝胶珠，除去残留的未反应的试剂和单体。再用水洗，并将固化产物储存在含有 500ppm泥泊金乙酯的50mM磷酸缓冲液中。终产物即固定化生物催化剂，其15-20%的干重 中含有颗粒，其中98%的颗粒大小为100-300微米。在另一个实施例中，生物催化剂用其他压缩材料的混合物制备。一种含有 15%的丙烯酰胺，N, N-亚甲基丙烯酰胺和凝胶混合溶液。溶液中含有的每种成分比为 19 1 10。在丙烯酰胺的固化中，可以加入催化剂使聚合充分进行，常用的催化剂有TEMED 和1，2_ 二甲氨基丙腈。在另一个实施例中，用TEMED代替1，2_ 二甲氨基丙腈，获得产率不同的生物催化齐IJ，但是该生物催化剂的进一步使用受到限制，因为其材料具有毒性。
在另一个实施例中，用PVA和壳聚糖代替凝胶、丙烯酰胺和N，N-亚甲基丙烯酰胺 的混合物。制备生物催化剂是为了研究它们在合成6-APA方面的重复利用性。生物催化剂的干重用水分测定仪(赛多利斯)检测，将0. 3-0. 5g样品在干燥铝平 板上展开并在105°C下加热30分钟。此外，通过25mM的青霉素G和50mM的磷酸钠缓冲液在PH8. 0、37°C下进行碱滴定， 就可以用本发明所得的生物催化剂测定青霉素G酰化酶的活性。同样，通过25mM的头孢菌素G溶液和50mM的磷酸钠缓冲液在PH8. 0、37°C下进行 碱滴定也可以测定头孢菌素G水解活性。此外，阿莫西林的合成活性是在PH6，3、40°C中用44Mm6_APA和66mMHPGMe测定的。 反应进行30分钟，然后用HPLC分析，其中HPLC分析是用迪马液相色谱柱(Inertsil C8)， 流动相的流动速率为1. 2ml/min，峰值为215nm。用于固化形成生物催化剂产物的酶是青霉素酰化酶和新青霉素酰化酶。它们是上 述大量重组的E. coli分泌的酶经过浓缩获利的。终产物的重量为加入的每种酶重量的1. 4-2. 0倍，干重在15-20%之间。重组E. coli REXIII (pKA18)分泌的青霉素酰化酶固化产生生物催化剂，该生物催 化剂的产率为45-65%，其中产率是指整个过程中活性的增加量。在另一优选的实施例中，生物催化剂的性能是通过重复转化循环地用于将青霉素 G水解生成6-APA进行检测的。青霉素G的水解是在250ml带有搅拌器、PH和温度传感 器的反应器中进行，在28°C时青霉素G的浓度为8%，并且生物催化剂和青霉素G钾盐的 湿重比为1 lw/w。加入2M氨水溶液使PH保持不变。消耗剩余的氨水溶液少于100 μ 1 时，反应终止。过滤使反应体积减小，然后加入新的青霉素溶液与之前的生物催化剂一 起用于下一个循环。形成的6-ΑΡΑ用HPCL测定，具体使用Zorbax SB C18柱，流动相为 0. 05ΜΚΗ2Ρ04 (ΡΗ7. 0)乙腈的比例为70 30，流动速率为lml/min，检测峰值为215nm，结 果显示至少在50个循环后，活性也几乎没有降低。同样在另一个实施例中，制备生物催化剂的研究与使用4. 5%的头孢菌素G进行 头孢菌素G水解相似。生物催化剂在50次重复转化循环中重复用于水解。反应时间为 45-50分钟，头孢菌素G转化为7-ADCA的摩尔含量为86%到87%，纯度为97% -98%。使 用与上述青霉素G相似的方法进行分析测定。rE.coli BL21 CCM7394 (pKXIPI)和 rE. coli REIII (pKXIPI) (DVK 品种)分泌的新 青霉素酰化酶也进行类似的固化。生物催化剂涉及阿莫西林合成活性的产率为45-65%，其 中产率是指整个过程中活性的增加量。每种生物催化剂的性能是通过使用每种生物催化剂在30-50个合成阿莫西林的 重复转化循环中使用进行检测的。6-ΑΡΑ和HPGMe能够作为底物，在重复的转化循环中使用同一生物催化剂催化合 成阿莫西林，其中的催化能力是用6-ΑΡΑ的转化百分率来表示的。在一个典型的反应中， 使用的酶量相当于15U/ml-20U/ml在25°C，PH6. 3条件下的反应混合物，该混合物中含有 180mM的6-APA和320mM的HPGMe。HPLC测定反应，其中采用迪马液相色谱柱(InertsilC8)，流动相的流动速率为1. 2ml/min，检测峰值为215nm。每种生物催化剂在酶化阿莫西林 系统中使用30-50次的重复转化循环后，其反应活性仍然保持在90%以上。6-APA在每次 循环中的转化率为85-97%。而阿莫西林在每次循环中的摩尔产率在75-85%。本发明制备的生物催化剂，其干重时的青霉素水解活性为800_2100U/g，干重时的 头孢菌素G活性为1500-1800U/g，而干重时的阿莫西林合成活性为110-350U/g。本发明 制备的生物催化剂中青霉素G水解活性的产率为45-65%，其中产率是指 整个过程中活性的增加率。下文通过非限制性实例详细说明本发明的方法，同时强调在实验中对方法进行各 种变化，并对产物开发和应用的各个阶段会涉及的各种参数进行分析。实施例1酶液的制备用硫酸铵将青霉素酰化酶从rE. coli REIII (pKA18)分泌的5°C、PH7. 5的蛋白质 萃取液中沉淀出来，从而部分纯化青霉素酰化酶，然后以250rpm的转速搅拌30分钟，接着 在5°C、4000rpm的转速下离心过滤得到酶沉淀。硫酸铵的用量为每克蛋白质20克，蛋白质 的确定是根据使用BSA的缩二脲反应。产生的黏团干重为42-45%，用缓冲液1 1地稀 释，其中缓冲液是PH为7. 5的0. IM磷酸钠缓冲液稀释。制备10% w/w的聚乙烯醇溶液(PVA)将PVA(分子量为125000)置于预先已称重的玻璃容器中进行称重。向其中加水， 并搅拌热水浴使PVA充分溶解，直至获得一种澄清的溶液。制备凝胶溶液(10% w/w)将凝胶(胰化凝胶，SD有限公司)置于预先已称重的玻璃容器中进行称重。向其 中加水，并搅拌热水浴使凝胶充分溶解，直至获得一种澄清的溶液。制备0. 1M、PH为7. 5磷酸钠缓冲液称取4. 5g磷酸二氢钠和10. 4g磷酸氢二钠，然后加入1000毫升蒸馏水将其溶解。 最后得到PH为7. 5的溶液。取4. Og上述酶液(水解活性1000单位/毫升，150毫克蛋白质/毫升)置于冰水 浴中搅拌至获得一种均勻的悬浮液。加入ι. O毫升、25%的戊二醛并搅拌5分钟(即交联 时间)。同时，分别加入上述制得的PVA溶液和凝胶，并混合2分钟。持续搅拌反应混合物 直到形成凝固凝胶团聚体。5°C下至少冷却12-18小时。将产生的凝胶团聚体切成碎块，并 过500微米(30目)筛。水洗凝胶团聚体以去除未反应的试剂和聚合物残留物。然后，将 团聚体加入到含PH 7. 5,0. IM的磷酸钠缓冲液的0. 5% ν/ν戊二醛溶液中，25°C下搅拌30 分钟。最后水洗并将固化产物储存在含有500ppm尼泊金乙酯的50mM磷酸钠缓冲液中。终产物即固化生物催化剂，其15-20 %的干重中含有颗粒，其中98 %的颗粒大小 为100-300微米。重量产量是所加入的酶重量的1.4-1. 5倍。生物催化剂中青霉素G水解活性的产 率为45-65%，其中产率是指整个过程中活性的增加率。通过25mM的青霉素G和50mM的磷酸钠缓冲液在PH8. 0下进行碱滴定来测定青霉 素G酰化酶的活性。
实施例IA用12L、pH 7. 5、0· IM的磷酸钠缓冲液(缓冲液如实施例1所述制备)稀释2000g 实施例1所述的糊状酶。稀释后，青霉素G水解活性为464单位/毫升，溶液中的蛋白质含 量为16. 5毫克/毫升。这种酶悬浮液在21°C持续搅拌，同时用40%氢氧化钠溶液将酶悬 浮液的PH调整为7.5。缓慢向每升悬浮液中加入527克固体硫酸铵，加入的时间需要超过20分钟，并用 40%氢氧化钠溶液将酶悬浮液的pH调整为7. 5。21°C下再缓慢地加入388毫升戊二醛(25% w/v溶液)，加入的时间为30分钟，并 用40%氢氧化钠溶液将酶悬浮液的pH调整为7. 5。产生的悬浮液再额外搅拌1小时(即 CLEA的形成时间)。用同体积的IM氯化钠溶液重复六次地清洗不溶性沉淀物。将产生的 交联团聚体过200微米的筛。水溶解活性的产率11000单位/克干重)为50%，重量产量 是 91%。实施例IB用12L、pH 7. 5、0· IM的磷酸钠缓冲液(缓冲液如实施例1所述制备)稀释2000g
实施例1所述的糊状酶。稀释后，青霉素G水解活性为464单位/毫升，溶液中的蛋白质含 量为16. 5毫克/毫升。这种酶悬浮液在21°C持续搅拌，同时用40%氢氧化钠溶液将酶悬 浮液的PH调整为7.5。缓慢向每升悬浮液中加入527克固体硫酸铵，加入的时间需要超过20分钟，并用 40%氢氧化钠溶液将酶悬浮液的pH调整为7. 5。25°C下再缓慢地加入243毫升戊二醛(25% w/v溶液)，加入的时间为30分钟，并 用40%氢氧化钠溶液将酶悬浮液的pH调整为7. 5。产生的悬浮液再额外搅拌1小时(即 CLEA的形成时间)。用同体积的IM氯化钠溶液重复六次地清洗不溶性沉淀物。将产生的 交联团聚体过200微米的筛。水溶解活性的产率(16000单位/克干重)70%，重量产量是 87%。实施例2在实施例1所述方法中多次提到的酶沉淀物是rE. coli BL21 CCM 7394 (阿莫西 林合成活性为210U/g，蛋白质为0. 143g/g)分泌的。终产物即固化生物催化剂，其17-21% 的干重中含有颗粒，其中98%的颗粒大小为100-300微米。生物催化剂的重量产量为所加入的酶重量的1. 5-2. 0倍。使用44mM6-APA和66mM HPGMe,在PH6. 3和40°C下测定阿莫西林合成活性。该反应进行30分钟后，用HPLC分析。 其中HPLC分析是用迪马液相色谱柱(InertsilCS)，流动相的流动速率为1. 2ml/min,峰值 为 215nm。生物催化剂中阿莫西林合成活性的产率为40-45%，其中产率是指整个过程中活 性的增加率。实施例3在实施例1所述方法中多次提到的酶沉淀物是rE. coli REIII (阿莫西林合成活 性为410U/gm，蛋白质为0. 164gm/gm)分泌的。终产物即固化生物催化剂，其17-23 %的干 重中含有颗粒，其中98%的颗粒大小为100-300微米。生物催化剂的重量产量为所加入的酶重量的1. 5-1. 8倍。生物催化剂中阿莫西林合成活性的产率为55-65%，其中产率是指整个过程中活性的增加率。合成活性是用实施例 2所述的方法测定的。实施例4如实施例1所述的制备固化生物催化剂，但使用不同浓度的戊二醛并采用不同的 交联时间。表1中列出了不同的戊二醛浓度和交联时间所产生的固化生物催化剂的水解活 性表 1

权利要求
使用固化同时结合沉淀、交联及包埋的方法制备一种稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂，其特征在于所述的固化方法包括以下步骤(a)在1℃ 2℃的温度下，沉淀同时交联含有硫酸铵和戊二醛的酶液，获得交联的酶团聚体；(b)使交联了硫酸铵和戊二醛的酶在18至23摄氏度，优选20至21摄氏度的高温下进行转化而自己产生固化交联的酶团聚体；(c)在低温下，将所述的团聚酶于10％w/w的聚乙烯醇和10％w/w的凝胶混合溶液中包埋；(d)然后在5℃的低温下继续凝胶化12个小时；(e)过150微米筛，得到凝胶酶，于是获得均匀分布的凝胶团聚体；(f)将戊二醛与凝胶团聚体在30℃，pH7.5 7.6中进一步的再交联30分钟，以提高结构的稳定性。
2.如权利要求1所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其特 征在于所述的酶溶液为青霉素酰化酶，该青霉素酰化酶是由含有质粒PKA18的rE. coli REIII分泌的。
3.如权利要求1所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其特征 在于所述的酶溶液为新的青霉素酰化酶，该青霉素酰化酶是由含有质粒pKXIPl的rE. coli BL21 CCM 7394 分泌的。
4.如权利要求1所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其特征 在于所述的酶溶液为新的青霉素酰化酶，该青霉素酰化酶是由含有质粒PKXIPl (DVK品种) 的rE. coli REIII表达的无色杆菌属分泌的。
5.如权利要求1所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其特征 在于硫酸铵的浓度为10-50克/克蛋白质，优选为20-30克/克蛋白质。
6.如权利要求1所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其特征 在于用于交联及再交联的戊二醛的体积浓度为1. 7-2. 0%，优选为0. 5-0. 7%。
7.如权利要求1所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其特征 在于聚乙烯醇的浓度为终产物重量的4. 5-7. 5%。
8.如权利要求1所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其特征 在于凝胶的浓度为1_5%，优选为聚乙烯醇重量的1.2-1. 5倍。
9.如权利要求1或2所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其特 征在于所述的生物催化剂的重量为所加入的酶重量的1. 4-1. 5倍。
10.如权利要求1或2或3所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方 法，其特征在于所述的生物催化剂的重量为所加入的酶重量的1. 5-2. 0倍。
11.如权利要求1或2或3或4所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的 方法，其特征在于所述的生物催化剂的重量为所加入的酶重量的1. 5-1. 8倍。
12.如权利要求1或2所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其 特征在于生物催化剂在干重时的青霉素水解活性为1800-2100U/g，而其在干重时的头孢菌 素 G 活性为 1500-1800U/g。
13.如权利要求1或2所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其特征在于生物催化剂是重复转化循环地用于水解青霉素G，转化为6-APA的青霉素G为 0. 52摩尔，并且至少经过50个循环后其活性仍未降低。
14.如权利要求1或2所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其 特征在于生物催化剂是重复转化循环地用于水解青霉素G，转化为7-ADCA的青霉素G，其摩 尔含量为78%，并且至少经过50个循环后其活性仍未降低。
15.如权利要求1或2所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方法，其 特征在于生物催化剂中青霉素G水解活性的产率为45-65%，其中产率是指整个过程中活 性的增加率。
16.如权利要求1或2或3所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方 法，其特征在于生物催化剂在于重时的青霉素水解活性为800-900U/g，而其在干重时的阿 莫西林合成活性为110-200U/g。
17.如权利要求1或2或3所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的方 法，其特征在于生物催化剂中青霉素G水解活性的产率为40-45%，其中产率是指整个过程 中活性的增加率。
18.如权利要求1或2或3或4所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的 方法，其特征在于生物催化剂在干重时的青霉素活性为1100-1500U/g，而其在干重时的阿 莫西林合成活性为250-350U/g。
19.如权利要求1或2或3或4所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的 方法，其特征在于生物催化剂中青霉素G水解活性的产率为40-45%，其中产率是指整个过 程中活性的增加率。
20.如权利要求1或2或3或4所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的 方法，其特征在于生物催化剂是重复转化循环地用于6-APA和HPGMe进行酶合成阿莫西林 的过程中。
21.如权利要求1或2或3或4所述的制备稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂的 方法，其特征在于生物催化剂是重复转化循环地用于6-APA和HPGMe进行酶合成阿莫西林 的过程中。
全文摘要
本发明公开了一种稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂及其固化方法。所述的固化方法的原理是沉淀部分纯化酶，同时使用如戊二醛等交联剂进行团聚，并包埋到如凝胶等天然聚合物和如聚乙烯醇等合成聚合物的混合物中，然后在温和的温度和pH中进行有效的凝胶化，获得一种稳定的生物催化剂。用这种方法固化的酶包括rE.coliREIII(pKA18)分泌的青霉素酰化酶，rE.coli BL21CCM7394(pKIPl)和rE.coli RE III(pKXIPl)表达的无色杆菌属分泌的新青霉素酰化酶。
文档编号C12P37/04GK101970654SQ200880125518
公开日2011年2月9日 申请日期2008年11月14日 优先权日2008年11月14日
发明者W·R·维亚萨蕊亚妮, 克斯利柯·帕维尔, 崔普提·克里斯纳肯特·爱莎, 贝克·斯塔尼拉夫, 阿努帕玛·达特拉 申请人:酵素生物技术有限公司;微生物研究所