乳酸脱氢酶表达盒、转化酵母和乳酸的制造方法

文档序号:571425阅读:419来源:国知局
专利名称:乳酸脱氢酶表达盒、转化酵母和乳酸的制造方法
技术领域
本发明涉及乳酸脱氢酶表达盒、具有该盒的转化酵母和包括培养该酵母的乳酸的 制造方法,更具体的是,涉及高乳酸生产能力的乳酸脱氢酶表达盒、具有该盒的转化酵母和 包括培养该酵母的乳酸的制造方法。
背景技术
近年来,在向资源循环型社会构建的趋势下,以植物等的生物量作为原料的聚合 物备受关注。这其中,已经清楚了,聚乳酸(以下有时简称为“PLA”)作为生物量原料的聚 合物具有优异的性质。PLA的原料乳酸,通过培养以乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属 (Lactococcus)为代表的总称为所谓乳酸菌的微生物来制造。使用乳酸菌的乳酸的生产,其 由糖产生的乳酸收率和乳酸生产速度优异。但是,获得的乳酸为L-乳酸和D-乳酸的混合 物。因此,在光学纯度上存在问题。在PLA生产中使用的乳酸需要高光学纯度。人们尝试制造光学纯度高的乳酸。例如,人们尝试了采用转化酵母,生产L-乳酸 和D-乳酸(例如,专利文献1-3,非专利文献1)。酵母原本不具有生产乳酸的能力。在这 些文献中报道了,通过基因重组技术,将编码将丙酮酸转化为乳酸的乳酸脱氢酶的基因导 入酵母,获得了光学纯度非常高的乳酸。另一方面,在通过酵母进行的乳酸生产中,乳酸收 率、乳酸生产速度都比乳酸菌要差。因此,为了使用酵母以低成本生产乳酸,需要同时提高 乳酸收率、乳酸生产速度。为了使乳酸收率、乳酸生产速度一起提高,开发了一边用分离膜过滤具有乳酸生 产能力的酵母,一边进行培养的技术(参照例如专利文献4)。但是,即使采用这种技术,也 存在在培养过程中乳酸收率、乳酸生产速度都逐渐降低的问题。专利文献1 特表2001-516584号公报专利文献2 特开2003-93060号公报专利文献3 特开2005-137306号公报专利文献4 国际公开第2007/97260号小册子非专利文献1 Jshida, Takahashi 等人,J. Biosci. Bioeng, 101 (2),p. 172-177, (2006)

发明内容
发明要解决的问题本发明鉴于上述问题,其目的在于提供使得同时实现高的光学纯度、乳酸收率和 乳酸生产速度成为可能的、在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培 养中为了防止乳酸收率和乳酸生产速度降低所必要的编码乳酸脱氢酶的基因表达盒、具有 该盒的酵母和培养该酵母而制造乳酸的方法。用于解决问题的方法
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本发明人为了解决上述问题,进行了积极的研究,结果发现,在一边用分离膜过滤 具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中,通过一边用分离膜过滤具有乳酸脱氢酶表 达盒的酵母,其中所述乳酸脱氢酶表达盒含有培养开始后50小时以后基因表达量为全部 基因平均相对表达量的5倍以上的基因的启动子,一边进行培养,能够不导致乳酸收率和 乳酸生产速度降低,稳定地长时间连续培养,从而完成了本发明。也就是说,本发明为一种在启动子的下游连接了编码乳酸脱氢酶的基因的乳酸脱 氢酶表达盒,其特征在于该启动子是在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进 行连续培养中,培养开始后50小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的5倍以 上的基因的启动子。优选前述启动子为指数缺陷的抑制(suppression of exponential defect) 1基因(SED1基因)、细胞壁关联蛋白质2基因(CWP2基因)或烯醇化酶1基因 (EN01基因)的启动子,更优选地为包含选自以下(a) (c)的碱基序列的启动子。(a)包含序列号1 3任一项所示的碱基序列的启动子;(b)包含与含有序列号1 3任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严 格条件下杂交的碱基序列的启动子;(c)包含在序列号1 3任一项记载的碱基序列中,缺失、替代和/或添加了 1个 或多个碱基的碱基序列的启动子。根据本发明的其它优选方式为含有以下的选自(a)组的启动子和选自(b)组的编 码乳酸脱氢酶的基因的乳酸脱氢酶表达盒。(a)(1)包含序列号1 3任一项所示的碱基序列的启动子;(2)包含与含有序列号1 3任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严 格条件下杂交的碱基序列的启动子;(3)包含在序列号1 3任一项所示的碱基序列中缺失、替代和/或添加了 1个或 多个碱基的碱基序列的启动子;(b)(1)包含序列号4 6任一项所示碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因;(2)包含与含有序列号4 6任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严 格条件下杂交的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因;(3)包含在序列号4 6任一项所示的碱基序列中缺失、替代和/或添加了 1个或 多个碱基的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因。本发明的其它优选方式为在染色体中具有至少一个上述任一乳酸脱氢酶表达盒 的转化酵母。优选地,选自指数缺陷的抑制1基因(SED1基因)、细胞壁关联蛋白质2基因 (CWP2基因)或烯醇化酶1基因(EN01基因)的至少一个基因被上述乳酸脱氢酶表达盒替 代的酵母。上述转化酵母优选属于酵母属(Genus Saccharomyces)。上述转化酵母如果是酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),贝Ij更为优选。此外,本发明还提供了包括培养上述转化酵母的培养步骤的乳酸的制造方法。优 选地,前述培养步骤为用分离膜过滤培养液、从滤液中回收乳酸、再将未滤过液保持在或返 流到培养液中,并在培养液中追加培养基的连续培养。
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发明的效果本发明中,一边用分离膜过滤具有乳酸脱氢酶表达盒的酵母一边进行培养,其中 所述乳酸脱氢酶表达盒包含在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续 培养中,培养开始后50小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的5倍以上的基因 的启动子。其结果是,能够以高收率、高生产速度、长时间稳定地进行高光学纯度的乳酸的 生产。附图的简要说明[

图1]图1是用于说明本发明中使用的膜分离型的连续发酵装置的一个实施方式 的概要侧面图。[图2]图2是用于说明能够在本发明中使用的其它膜分离型连续发酵装置的一个 实施方式的概要侧面图。[图3]图3是用于说明本发明中使用的分离膜元件的一个实施方式的概要斜视 图。[图4]图4是用于说明本发明中使用的其它分离膜元件的其它实施方式的概要斜 视图。[图5]图5是用于说明表达载体pTRSll的图。符号的说明1发酵反应槽2分离膜元件23水位差控制装置4第2标签序列5搅拌机6液位传感器7培养基供给泵8 pH调整溶液供给泵9 pH传感器·控制装置10温度调节器11发酵培养液循环泵12膜分离槽13支持板14流路材料15分离膜16 凹部17集水管18分离膜束19上部树脂密封层20下部树脂密封层21支持框22集水管
用于实施发明的最佳方式[乳酸脱氢酶表达盒]本发明的乳酸脱氢酶表达盒是编码乳酸脱氢酶的基因(Idh基因)连接在启动子 下游的乳酸脱氢酶(LDH 乳酸脱氢酶,以下称为“LDH”)表达盒,在一边用分离膜过滤具有 乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中,前述启动子为培养开始后50小时之后基因表 达量为全部基因平均相对表达量的5倍以上的基因的启动子的乳酸脱氢酶表达盒。 本说明书中所谓“ldh基因”是指编码具有将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)和丙酮酸转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和L-乳酸或NAD+和D-乳酸 的活性的LDH的基因。作为本发明中使用的Idh基因,只要是编码具有上述活性的LDH的Idh基因, 可以使用任意一种,但优选是乳酸菌和枯草杆菌等细菌来源的Idh基因和人、牛、青蛙、 疟原虫等真核生物来源的Idh基因。这其中,作为细菌来源,可以适当使用干酪乳杆 菌(Lactobacillus casei),植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),保力口利亚乳杆 胃(Lactobacillus bulgaricus), Lactobacillus sasei,德 Εξ If lif (Lactobacillus delbrueckii),约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii),瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus),弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus),嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus), 乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),嗜热 脂肪芽孢杆菌(Bacillus stcarothermophilus)来源的Idh基因。此外作为真核生物 来源,可以适当使用米根霉(Rhizopus oryzae),人(Homo sapiens),牛(Bos taurus), 非洲爪蟾(Xenopus laevis),家犬(Canis familiaris)、密西西比短吻鍔(Alligator mississippiensis)、灰色短尾负鼠(Monodelphis domestica)、中华鳖(Pelodiscus smensi s)、白斑角鲨(Squalus acanthias)、恶性疟原虫(Plamodium falciparum)、间日 疱原虫(Plamodium vivax)、三日疱原虫(Plamodium marariae)、蛋形疱原虫(Plamodium ovale)来源的Idh基因。本发明中使用的Idh基因中还包括由于遗传多态性和诱变等产生的变异型基 因。这里所谓的遗传多态性,是由于基因上的自然突变导致基因的碱基序列部分发生变 化。此外,所谓诱变,是指通过人工在基因中导入变异,例如,使用定点诱变导入用试剂盒 (Mutan-K(TakaraBio公司制))的方法、使用随机突变导入用试剂盒(BD Diversify PCR Random Mutagenesis (CL0NTECH 公司制))的方法等进行。作为本发明中使用的克隆Idh基因的方法,没有特别的限制,可以使用已知的方 法。例如,基于已知的基因信息,可以列举使用PCR(聚合酶链反应)法扩增取得必需的遗传 区域的方法,以同源性和酶活性为指标从基因组文库或cDNA文库中克隆的方法等。此外, 还可以是基于已知的蛋白质信息化学合成或基因工程合成的方法。作为本发明中使用的乳酸脱氢酶(LDH)表达盒,只要是在具有该LDH表达盒的细 胞内,由Idh基因经mRNA能够表达LDH的碱基序列即可,并没有特别限定。优选为连续具 有启动子、Idh基因和终止子的碱基序列。这里,所谓终止子,是指使由基因向mRNA转录终 止的序列,通常是指存在于染色体中的基因的3末端侧的下游序列。
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本发明中使用的“具有乳酸生产能力的酵母”,是可以通过同化葡萄糖、蔗糖、果糖 等糖来生产乳酸的酵母,优选是通过基因重组导入了 Idh基因的酵母。这里,对向酵母导入Idh基因的方法进行说明。作为向酵母导入Idh基因的方法, 可以列举在表达载体中整合有Idh基因的Idh基因表达载体转化酵母的方法、在染色体上 的目标位置通过同源重组插入Idh基因的方法、或通过非同源重组在染色体中随机插入 Idh基因的方法等。作为整合Idh基因的表达载体,可以使用广泛应用于酵母的表达载体。广泛应用 于酵母的表达载体是指具有酵母细胞内自主复制所必需的序列、大肠杆菌细胞内自主复制 所必需的序列、酵母选择标记和大肠杆菌选择标记,而且为了使整合的Idh基因表达,理想 的是还具有调节其表达的操纵基因、启动子、终止子或增强子等所谓的调节序列。这里,所谓酵母细胞内自主复制所必需的序列,是指例如酵母的自主复制起始点 (ARSl)和着丝粒序列的组合、或酵母的2μπι质粒的复制起始点的序列。所谓大肠杆菌内 自主复制所必需的序列,是例如大肠杆菌的ColEl复制起始点的序列。此外,作为酵母选 择标记,可以列举URA3或TRPl等营养需求性互补基因或G418抗性基因或新霉素抗性基 因等耐药基因。大肠杆菌的选择标记可以列举氨苄青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因等 抗生素抗性基因。作为调节序列,只要是可以表达Idh基因的调节序列,则没有特别限制, 作为一个例子,可以列举酸性磷酸酶基因(ΡΗ05)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH1,2,3)、 醇脱氢酶基因(ADH1,2,3,4,5,6,7)基因、半乳糖代谢类基因(GAL1,7,10)、细胞色素c基 因(CYCl)、磷酸丙糖异构酶基因(TPIl)、磷酸甘油酸激酶基因(PGKl)、磷酸果糖激酶基因 (ΡΠ(1)、丙酮酸脱羧酶基因(PDC1,5,6)等的启动子序列和TDH3基因等的终止子序列。然 而,表达载体并不限于此。通过在上述表达载体的启动子下游导入Idh基因,可以获得能够表达Idh基因的 载体。通过用后述的方法将获得的Idh基因表达载体转化酵母,可以在酵母中导入Idh基 因。此外,通过在染色体中插入Idh基因,能够在酵母中导入Idh基因。在染色体中插 入Idh基因的方法没有特别限制,有以下方法,如通过后述的方法将含有Idh基因的DNA转 化酵母,通过非同源重组将Idh基因插入到染色体中随机的位置处的方法,通过同源重组 将含有Idh基因的DNA导入到目标位置的方法等。优选的是通过同源重组的方法。作为将含有Idh基因的DNA通过同源重组插入染色体中目的位置的方法,可以列 举使用被设计成在含有Idh基因的DNA的上游和下游添加与导入目的位置同源的部分的引 物进行PCR,用后述方法将获得的PCR片段转化酵母的方法,但不限于此。此外,为了容易地 进行转化株选择,优选在上述PCR片段中含有酵母选择标记。这里使用的调整PCR片段的方法,可以通过例如下述(1) (3)的步骤1 3的 步骤进行。而且,这里,对于在丙酮酸脱羧酶1基因(PDC1基因)启动子下游导入Idh基因 的方法进行例示。(1)步骤1 以在Idh基因的下游连接了终止子的质粒作为模板,以引物1,2作为 引物对,通过PCR扩增含有Idh基因和终止子的片段。这里,引物1被设计成添加40bp以 上与PDCl基因的上游侧同源的序列,基于来源于质粒中终止子下游的序列来设计引物2。(2)步骤2 以具有酵母选择标记的质粒例如pRS424、pRS426等作为模板,以引物
73,4作为引物对,通过PCR扩增含有酵母选择标记的片段。这里,引物3被设计成添加30bp 以上与步骤1的PCR片段的终止子下游序列具有同源性的序列,引物4被设计成添加40bp 以上与PDCl基因的下游侧同源的序列。(3)步骤3 通过以步骤1,2中获得的PCR片段的混合物作为模板,以引物1,4作 为引物对,进行PCR,获得了在两末端添加了对应于PDCl基因的上游侧和下游侧的序列的 含有Idh基因、终止子和酵母选择标记的PCR片段。此外,在作为LDH表达盒导入染色体时,上述步骤1中使用的PCR模板质粒,采用 携带了任意启动子、Idh基因和终止子的质粒,引物1只要被设计成在导入目的位置添加 40bp以上的同源序列,且能够扩增启动子、Idh基因、终止子即可。在酵母中导入上述获得的Idh基因表达载体或PCR片段时,可以使用转化、转导、 转染、共转染或电穿孔等方法。具体有例如,采用醋酸锂的方法和原生质体法等。作为获得的转化株的培养方法,可以使用例如,记载于M. D. Rose等人,"Methods In Yeast Genetics,,,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)等中的己知的方法。 导入了 Idh基因表达载体或PCR片段的酵母,可以根据表达载体或PCR片段具有的酵母选 择标记,通过在营养非添加培养基或药剂添加培养基中培养进行选择。本发明的所谓“一边用分离膜过滤一边进行连续培养”是指,用分离膜过滤培养 液,从滤液中回收生产物,与此同时将未滤过液保持在或返流到前述培养液中,并且在前述 培养液中追加发酵原料的连续培养。使用的分离膜优选为多孔性膜,并希望其不容易发生 培养时使用的酵母导致的堵塞,而且过滤性能具有长期间稳定持续的性能。本发明中使用 的分离膜的材质为陶瓷或有机高分子,优选为有机高分子。接着,就本发明中的“基因表达量为全部基因平均相对表达量的5倍以上的基因” 进行说明。本发明中所谓基因表达量,是指由基因转录的信使RNA(mRNA)量,所谓全部基因 的平均相对表达量,优选登录在酵母属基因组数据库(http://Vww.yeastgenome.org/)的 全部基因的平均表达量,即使缺少1个或多个基因也没关系。也就是说,所谓“基因表达量 为全部基因平均相对表达量的5倍以上的基因”是指mRNA量为全部基因的平均mRNA量的 5倍以上的基因。此外,本发明的本质在于使用基因表达量更多的基因的启动子,因此优选 基因表达量为全部基因平均相对表达量的7倍以上、更优选10倍以上的基因。本发明中,作为测定全部基因的平均相对表达量的方法,可以列举Northern印迹 法、qPCR(定量PCR)法、实时PCR法或DNA微阵列法等。前面3种方法是通常测定各个基 因表达量的方法,而DNA微阵列法中,进行固定在阵列上的探针和预先用荧光标识的mRNA之间的 杂交,通过用专用扫描仪测定荧光强度,可以同时测定携带在阵列上的全部基因的表达量, 因此优选DNA微阵列法。在用扫描仪进行的荧光强度的测定中,理想的是用发生荧光强度 的饱和度的斑点数尽可能少,而且全体荧光强度提高的激光强度进行测定。这种激光强度 在每份测定样本都不同,可以通过简单的研究来测定。作为本发明中使用的DNA微阵列,只要是携带了酵母全部基因的微阵列即可,没 有特别的限制,可以合适地使用Affymetrix公司制造的“GeneChip”或东丽公司制造的 “ 3D-Gene ” 等。优选 “ 3D_Gene ”。这里,将“基因表达量为全部基因平均相对表达量的5倍以上的基因”定义为,使用DNA微阵列测定全部基因的荧光强度,显示比这些基因的平均值大5倍以上的值的基因。 而且,将“基因表达量为全部基因平均相对表达量的7倍以上的基因”定义为显示出大7倍 以上的值的基因。此外,还将基因表达量为全部基因平均相对表达量的10倍以上的基因” 定义为显示出大10倍以上的值的基因。本发明中,所谓在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养 中,培养开始后50小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的5倍以上的基因的启 动子是指,在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中,培养开始 后50小时之后的某个时间点,取样酵母,使用从该酵母提取的全RNA,通过用上述DNA微阵 列进行测定能够确定的基因的启动子。本发明中所谓“启动子”,是指与由基因向mRNA的转录开始相关的碱基序列,通常 是指存在于染色体中的基因的5末端侧的上游序列。作为启动子的碱基序列长度,优选为 1 3000bp、更优选1 lOOObp,只要是能够起始存在于下游的基因的mRNA转录的碱基序 列即可,没有特别限定。此外,使启动子的转录活性提高的变异和操作是已知的,本发明中 还包括通过已知方法改变的启动子。本发明中,作为在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养 中,培养开始后50小时后基因表达量为全部基因平均相对表达量的5倍以上、优选7倍以 上、更优选10倍以上的基因的启动子,可以列举CDC19(细胞分裂周期19)基因,IPPl (无机 焦磷酸酶1)基因、ARFl (ADP-核糖基化因子1)基因,CUP5基因、RPL28(核糖体蛋白L28) 基因、TRX2(硫氧还蛋白2)基因,HSP104(热休克蛋白104)基因,AHPl (烷基过氧化氢还原 酶1)基因,YMR122W-A,CIT1 (柠檬酸合酶1)基因,RPS15 (核糖体蛋白S15)基因,ALD4(醛 脱氢酶4)基因,YPL225W,HSP26(热休克激蛋白26)基因,PGKl (磷酸甘油酸激酶1)基因, SEDl (指数缺陷的抑制1)基因,MFAl (交配因子1)基因,HYP2 (含hypusine的蛋白质2)基 因,HSP12(热休克蛋白12)基因,QCR6(泛醇细胞色素C还原酶复合物6)基因,HXKl (己糖 激酶1)基因,TDH3(甘油醛3磷酸脱氢酶3)基因,ENOl (烯醇化酶1)基因,BGL2(i3葡聚糖 酶2)基因,YJL133C-A,QCR8(泛醇细胞色素C还原酶复合物8)基因,FBAl (果糖1,6-二磷 酸醛缩酶1)基因,CWP2(细胞壁关联蛋白质2)基因,CCW12(细胞壁关联蛋白质12)基因, TMAlO (翻译机制相关蛋白10)基因,SIP18基因,H0R7 (高渗透压应答7)基因,CCW14(细 胞壁关联蛋白质14)基因,PIR3(含内部重复的蛋白13)基因,CYS3(胱硫醚酶3)基因, CDC48(细胞分裂周期48)基因,LYS20(高柠檬酸合酶20)基因,HSP31 (热休克蛋白31)基 因,ARG5,6(乙酰谷氨酸激酶5,6)基因,RPS24A(40S核糖体蛋白S24)基因,RPL29(核糖体 蛋白L29)基因,RPL24A (核糖体蛋白L24)基因,ADH4(醇脱氢酶4)基因,MUPl (蛋氨酸吸 收1)基因,RPLl IB (核糖体蛋白Ll 1B)基因,THI4 (硫胺生合成4基因)基因,RPL24B (核糖 体蛋白L24B)基因,RPSOA (40S核糖体蛋白质SA)基因,RPL27A(核糖体蛋白质L27A)基因, RPL16A(核糖体蛋白质L16A)基因,RPS21B (40S核糖体蛋白质S21B)基因,RPS5 (40S核糖 体蛋白质S5)基因,H0M6(高丝氨酸脱氢酶6)基因,PDC5(丙酮酸脱羧酶5)基因,THI7(硫 胺生合成7)基因,MET17(半胱氨酸合酶17)基因,ECM40(氨基酸N-乙酰基转移酶40)基 因,ARGl (精氨酸酶1)基因、ZPSl (锌· pH/调控的表层蛋白质1)基因,IDH2 (异柠檬酸脱 氢酶2)基因的启动子,尤为优选SEDl基因、CWP2基因或ENOl基因的启动子。更优选为包含选自以下(a) (C)的碱基序列的启动子,
(a)包含下述序列号1 3任一项所示的碱基序列的启动子;(b)包含与含有下述序列号1 3任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列 在严格条件下杂交的碱基序列的启动子;(c)包含在下述序列号1 3任一项所示的碱基序列中缺失、替代和/或添加了 1 个或多个碱基的碱基序列的启动子。
0097]序列号1 : (SED1基因酿酒酵母来源)0098]aggattttaatctgttggagttaaggtgaatacgtttttccatattggggtatgcagctc0099]gaacctaaagtggtatgtacacatcccctcaagcacacccattacccttataggattaat0100]gtaagcaacagcttacacggaattggaaatactattcaacgatccatgcatctgccagat0101]tcggacatgcatattccccaattggatatagaaaattaacgtaaggcagtatcttttcac0102]aatgtacttgcaacgcggcgacttaaagttgaagtacaacctgcagcagcggctttttgt0103]acggtacgccaaactgtcaatggataatattgcgtagaccgaaaaaggtaatcctcaaca0104]ctacccgtggtggatgacctaaagcagtaatattggttggaattatctcccagacggcac0105]cgtctccccgagaaagcttagccccgaggtctaccttccatacaccactgattgctccac0106]gtcatgcggccttctttcgaggacaaaaaggcatatatcgctaaaattagccatcagaac0107]cgttattgttattatattttcattacgaaagaggagagggcccagcgcgccagagcacac0108]acggtcattgattactttatttggctaaagatccatcccttctcgatgtcatctctttcc0109]attcttgtgtatttttgattgaaaatgattttttgtccactaatttctaaaaataagaca0110]aaaagcctttaagcagtttttcatccattttactacggtaaaatgaattagtacggtatg0111]gctcccagtcgcattatttttagattggccgtaggggctggggtagaactagagtaagga0112]acattgctctgccctcttttgaactgtcatataaatacctgacctattttattctccatt0113]atcgtattatctcacctctctttttctattctcttgtaattattgatttatagtcgtaac0114]tacaaagacaagcaaaataaaatacgttcgctctattaag0115]序列号2 (CWP2基因酿酒酵母来源)0116]ctaatagacaaggtgctatgagtgaattgctagcctcccctttttattttgtgcggtcac0117]cgcaagggacaaagcttttcttagaaaaccgtctgagaagcataacgtacgccatcccct0118]agacatattaataatgctacagatactatgctgctcgtctttttttgacgacccttttat0119]tgcaatgtgcaactaatggc3.3.3. C 3.3. C C 3. Catagtatcacagtattacattgcctccacc0120]gatgcggatgttagggcgccaagtctgtcatgaagcatgttcctgtcataatcttgtatg0121]caaaataccgcgttctgcgccactgatatgctaggcagcagcaacctatgcagaagattg0122]cttttcccacgcctgttttacgtctccagggcacttgaaacaatgcagcgatcgccgcca0123]caacacgccaaagagaagcgaaagtgggcctgggcggcctcagtttcggcagaggtaaac0124]aacacgaactgaactgccttagctccgaagggcaattccacaggcactccgcggggcccg0125]gccaaggcccaaaaggcgtggaatatgcgcgttttggggccataacacccagtaccacgg0126]ccggaacgggccatataataagtttttcactctcaagaatggtaaacgtaaataggaaca0127]tcccactaccctagaaattgcggaaatttcgcgcttatcattagaaaatctggaaccgtc0128]ctttttcctctttcttgcatttccctttccgtattattgccattctttaactgcatttgg0129]ggaaccgtagaccaaaagccaaacagagaaatgtaacgttC 3.3.3.3.3.3.3.3.aacaacgaaa0130]aaattgaaaaataagatacaataatcgtatataaatcaggcttcttgttcatcattttca0131]attctcttcttgccatcccttttcctatctttgttcttttcttctcataatcaagaataa0132]ataacttcatcacattcgct3. C 3. C 3. C 3.3. C0133]序列号3 (EN01基因酿酒酵母来源)0134]tagaaagcatactatactattcgacacttcctttcaatcctggaattaacagtcactttt0135]aaaaaagacatctaccgtgaaggtgccgtagagtatcgcgttaccatatcgccaaaaact0136]gatatacgccgcggaaaccaggcaaacaattgaaaagaaaaattttgaggaactctctgc0137]atcgaagccgtctagagttaccactagtcagatgccgcgggcacttgagcacctcatgca0138]cagcaataac3. C 3.3. C 3. C 3.3. ggttagtagcaacctgaattcggtcattgatgcatgcatg0139]tgccgtgaagcgggacaaccagaaaagtcgtctataaatgccggcacgtgcgatcatcgt0140]ggcggggttttaagagtgcatatcacaaattgtcgcattaccgcggaaccgccagatatt0141]cattacttgacgcaaaagcgtttgaaataatgacgaaaaagaaggaagaa0142]aaataccgcttctaggcgggttatctactgatccgagcttccactaggatagcacccaaa0143]cacctgcatatttggacgacctttacttac3. C C 3. C C 3.3.3.3.accactttcgcctctcccgc0144]ccctgataacgtccactaattgagcgattacctgagcggtcctcttttgtttgcagcatg0145]agacttgcatactgcaaatcgtaagtagcaacgtctcaaggtcaaaactgtatggaaacc0146]ttgtcacctcacttaattctagctagcctaccctgcaagtcaagaggtctccgtgattcc0147]tagccacctcaaggtatgcctctccccggaaactgtggccttttctggcacacatgatct0148]ccacgatttc3.3. C 3. 3. 3.3.3.tagcttttgataatggcaatattaatcaaatttattttac0149]ttctttcttgtaacatctctcttgtaatcccttattccttctagctatttttcataaaaa0150]accaagcaactgcttatcaaC 3. C 3. C 3.3.3. C 3.C 3.3.3. C 3.3.3.0151]而且,本说明书中,所谓“严格条件”,是指与其它序列相比较而言探针以更大的程
度(例如比背景大至少2倍)与其目标序列杂交的条件。严格条件为序列依存性,根据进 行杂交的环境而不同。这里,作为严格条件,是在50%甲酰胺存在下,杂交温度为37°C,更 严格的条件为约42°C。进一步严格条件为在甲酰胺存在下,杂交温度为约65°C。本发明为含有上述任一启动子的乳酸脱氢酶表达盒。此外,本发明为含有以下的选自(a)组的启动子和选自(b)组的编码乳酸脱氢酶 的基因的乳酸脱氢酶表达盒,(a)(1)包含上述序列号1 3任一项所示的碱基序列的启动子,(2)包含与上述含有序列号1 3任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列 在严格条件下杂交的碱基序列的启动子,(3)包含在上述序列号1 3任一项所示的碱基序列中缺失、替代和/或添加了 1 个或多个碱基的碱基序列的启动子,(b)(1)包含下述序列号4 6任一项所示碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因,(2)包含与含有下述序列号4 6任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列 在严格条件下杂交的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因,(3)包含在下述序列号4 6任一项所示的碱基序列中缺失、替代和/或添加了 1 个或多个碱基的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因。0162]序列号4 非洲爪蟾(Xenopus laevis)来源0163]atggcaactgtgaaggataaactcatccacaatgtggtcaaggaggagtcgctcccccag0164]aacaaggtcaccattgtgggtgtgggggccgtgggcatggcctgtgccatcagtgtcctg0165]cagaaggatttggcagatgagcttgcacttgttgatgtgatagaagacaaactgaagggg0166]gaaatgatggatctccagcatggcagtctgttccttcgtacccccaagattgtctcaggg0167]aaagattacagcgtcactgcaaactccaagctggtagttgtgacggccggggcccgtcag0168]caggagggagagagtcgcctgaatctggttcagcgcaatgtcaacatcttcaaattcatc0169]attcccaacattgtcaagtacagccccaactgcaccctgctcatcgtctccaacccagtg0170]gacattctgacatatgtggcctggaagatcagtggattccccaaaaaccgtgtcattggc0171]agcggctgcaatttggactctgcccgtttccgttacctcatggggcagaagtttgggatc0172]cacacccagagctgccacggttgggtcattggggaacacggagactcgagtgtgccagtg0173]tggagtggggtgaatgtggctggcgtgtccctgaaaaccctgcaccccgatattgggagt0174]gacgcagacaaggagaactggaaggaggtgcacaagcaggttgtggacagcgcctatgaa0175]gtgatcaagctgaagggctacacctcctgggctattggcctgtccgtagctgacctgtct0176]gagagtatcctgaagaacctccgccgagtccatcccatttccacaatggtcaagggcatg0177]tacggcgtgaataatgatgttttcctcagtgtcccctgtgtgttgggcaacttgggcatc0178]acagacgtggttaacatgacgctgaaggcagatgaagaggatcgcttacgcaagagcgca0179]gacaccctgtgggccatccagaaggagctgcagttctag0180]序列号5 人(Homo sapiens)来源0181]atggcaactctaaaggatcagctgatttataatcttctaaaggaagaacagaccccccag0182]aataagattacagttgttggggttggtgctgttggcatggcctgtgccatcagtatctta0183]atgaaggacttggcagatgaacttgctcttgttgatgtcatcgaagacaaattgaaggga0184]gagatgatggatctccaacatggcagccttttccttagaacaccaaagattgtctctggc0185]aaagactataatgtaactgcaaactccaagctggtcattatcacggctggggcacgtcag0186]caagagggagaaagccgtcttaatttggtccagcgtaacgtgaacatatttaaattcatc0187]attcctaatgttgtaaaatacagcccgaactgcaagttgcttattgtttcaaatccagtg0188]gatatcttgacctacgtggcttggaagataagtggttttcccaaaaaccgtgttattgga0189]agtggttgcaatctggattcagcccgattccgttacctgatgggggaaaggctgggagtt0190]cacccattaagctgtcatgggtgggtccttggggaacatggagattccagtgtgcctgta0191]tggagtggaatgaatgttgctggtgtctctctgaagactctgcacccagatttagggact0192]gataaagataaggaacagtggaaagaggttcacaagcaggtggttgagagtgcttatgag0193]gtgatcaaactcaaaggctacacatcctgggctattggactctctgtagcagatttggca0194]gagagtataatgaagaatcttaggcgggtgcacccagtttccaccatgattaagggtctt0195]tacggaataaaggatgatgtcttccttagtgttccttgcattttgggacagaatggaatc0196]tcagaccttgtgaaggtgactctgacttctgaggaagaggcccgtttgaagaagagtgca0197]gatacactttgggggatccaaaaggagctgcaattttaa0198]序列号6:肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)来源0199]atgaagatttttgcttacggcattcgtgatgatgaaaagccatcacttgaagaatggaaa0200]gcggctaacccagagattgaagtggactacacacaagaattattgacacctgaaacagct
aagttggctg agggatcaga ttcagctgtt gtttatcaac aattggacta tacacgtgaaacattgacag ctttagctaa cgttggtgtt actaacttgt cattgcgtaa cgttggtacagataacattg attttgatgc agcacgtgaa tttaacttta acatttcaaa tgttcctgtttattcaccaa atgctattgc agaacactca atgcttcaat tatctcgttt gctacgtcgcacgaaagcat tggatgccaa aattgctaag cgagacttgc gttgggcacc aacaactggacgtgaaatgc gtatgcaaac agttggtgtt attggtacag gtcatattgg ccgtgttgctattaacattt tgaaaggctt tggggccaag gttattgctt atgacaagta cccaaatgctgaattacaag cagaaggttt gtacgttgac acattagacg aattatatgc acaagctgatgcaatttcat tgtatgttcc tggtgtacct gaaaaccatc atctaatcaa tgcagatgctattgctaaga tgaaggatgg tgtggttatc atgaacgctg cgcgtggtaa tttgatggacattgacgcta ttattgatgg tttgaattct ggtaagattt cagacttcgg tatggacgtttatgaaaatg aagttgcttg ttcaatgaag attggtctgg taaagaattc cccagatgctaagattgctg acttgattgc acgcgaaaat gttatgatca ccccacacac ggctttctatacaactaaag ctgttctaga aatggttcac caatcatttg atgcagcagt tgctttcgccaagggtgaga agccagctat tgctgttgaa tattaa[转化酵母]本发明为在染色体中含有至少一个上述乳酸脱氢酶表达盒的转化酵母。本发明中 的转化酵母可以在能够由乳酸脱氢酶表达盒表达LDH的染色体中的任意位置上导入该乳 酸脱氢酶表达盒。优选为选自SEDl基因、CWP2基因或ENOl基因中的至少一个基因被上述 乳酸脱氢酶表达盒替代的酵母。本发明中使用的酵母如果是能够导入乳酸脱氢酶表达盒的酵母,就可以 合适地使用。作为其中一例,可以列举属于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母 属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)或假丝酵母属(Candida)的酵母。优选属于酵母属的酵母。更优选为酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。[乳酸的制造方法]本发明为包括培养上述转化酵母的乳酸的制造方法。培养时可以采用分批培养、 流加培养(补料分批培养)、恒化器培养或连续培养中的任一种方式。优选连续培养。更 优选的是,用分离膜过滤培养液,从滤液中回收乳酸,再将未滤过液保持在或返流到培养液 中,且在培养液中追加培养基的连续培养。作为本发明中使用的酵母的发酵原料,可以是促进发酵培养的酵母的生长,能够 使作为目的发酵生产物的乳酸良好生产的原料。作为发酵原料,可以优选使用例如合适地 含有碳源、氮源、无机盐类以及根据需要添加的氨基酸和维生素等有机微量营养素的液体
培养基。作为上述碳源,可使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖类、含有这些糖 类的淀粉糖化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜(High Test Molasses)、甘蔗汁、以及醋 酸、延胡索酸等有机酸、乙醇等醇类和甘油等。这里所谓糖类是指多元醇的最初氧化生成 物,具有一个醛基或酮基,且具有醛基的糖被分类为醛糖、具有酮基的糖被分类为酮糖的碳 水化合物。
此外,作为上述氮源,可以使用例如氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其它辅助 使用的有机氮源例如油粕类、大豆加水分解液、酪蛋白分解物、其它氨基酸、维生素类、玉米 浆、酵母或酵母提取物、肉膏、蛋白胨等的肽类、各种发酵菌体及其加水分解物等。此外,作为上述无机盐类,可以适当添加例如磷酸盐,镁盐、钙盐、铁盐、和锰盐等。在为了本发明使用的酵母的生长而需要特定营养素的情形时,可以添加作为制品 的营养物,或者含有该营养物的天然物。而且,根据需要还可以添加使用消泡剂。本发明中,所谓发酵培养液是指在发酵原料中能够获得酵母增殖的结果的液体。 追加的发酵原料的组成还可以根据培养开始时发酵原料组成适当改变。在发酵原料组成变 化成追加的发酵原料的组成时,优选目的乳酸的生产性变高的变化。例如,通过使氮源、无 机盐类、氨基酸和维生素等有机微量营养素相对于上述碳源的重量比率降低,就有可能可 以实现乳酸的生产成本降低、即广义的乳酸的生产性提高。另一方面,通过使氮源、无机盐 类、氨基酸和维生素等有机微量营养素相对于上述碳源的重量比率增加,就有可能使乳酸 的生产性提高。本发明中,发酵培养液中糖类等发酵原料的浓度优选保持在5g/L以下。更优选在 3g/L以下,更为优选在lg/L以下。其理由是,使发酵培养液的抽取导致的发酵原料的流失 降到最小限。因此,理想的是发酵培养液中发酵原料的浓度尽可能小。酵母的发酵培养通常多在pH为3-8,温度为20-40°C的范围进行。由于生产物质 乳酸为酸性物质,因此用碱性物质、以及尿素、碳酸钙和氨气等将发酵培养液的PH调节到 上述范围内的预先确定的值。在酵母的发酵培养中,如果需要提高氧的供给速度,可以采用在空气中添加氧,将 氧浓度保持在21 %以上,加压发酵培养液,提高搅拌速度或者提高通气量等手段,提高氧的 供给速度。相反,在需要降低氧的供给速度时,也可以在空气中混合二氧化碳气体、氮和氩 等不含氧的气体再进行供给。本发明中,可以在培养初期进行分批培养或补料分批培养,在酵母浓度提高后开 始连续培养(抽取),也可以接种高浓度的酵母菌体,在培养开始的同时进行连续培养。从 适当时期开始,可以进行发酵原料液的供给和培养物的抽取。发酵原料液供给和培养物的 抽取开始时间不一定需要相同。此外,发酵原料液的供给和培养物的抽取可以是连续的,也 可以是间歇的。可以在发酵原料液中添加如上所示的对菌体增殖所必需的营养素,使得菌 体增殖得以连续进行。为了获得有效的生产性,发酵培养液中酵母的浓度优选在发酵培养液的环境变得 不适于酵母增殖且死亡率不升高的范围下,以高浓度状态维持。作为其中一例,通过将酵母 浓度,作为干燥重量维持在5g/L以上,可以获得更好的生产效率。此外,只要不导致连续发 酵装置运作上的不方便或生产效率降低,酵母浓度的上限值就没有特别限定。使具有发酵生产能力的新鲜菌体增殖的同时进行的连续培养操作,在培养管理 上,通常优选在单一的发酵反应槽中进行。然而,如果是菌体增殖的同时生成乳酸的连续培 养法,则发酵反应槽的数目是任意的。由于发酵反应槽的容量小等原因,也可以使用多个发 酵反应槽。这种情况下,即使用配管并列或串联地连接多个发酵反应槽进行连续培养,也可 以获得发酵生产物的高生产性。由本发明的乳酸的制造方法制造的包含于培养液中的乳酸的分离·纯化,还可以
14通过组合已知的离子交换、浓缩、蒸馏和晶析等方法来进行。本发明的乳酸的制造方法中使用的发酵装置的1个例子,其主要由用于制造乳酸 的容纳本发明的转化酵母的发酵反应槽,以及用于过滤分离转化酵母和培养液的含有多孔 性膜的分离膜元件构成。分离膜元件可以设置在发酵反应槽的内部或外部。在通过用分离膜过滤本发明的培养液,从滤液中回收乳酸,再将未滤过液保持在 或返流到培养液中,并在培养液中追加培养基的连续培养所进行的乳酸的制造方法中,优 选使用平均细孔径为0. 01 μ m以上且不到1 μ m的多孔性膜作为分离膜,在作为过滤压力的 膜间差压在0. 1至20kPa的范围内进行过滤处理。因此,尤其是,由于不需要使发酵反应槽 内保持在加压状态,因此不需要使发酵培养液在过滤分离装置和发酵反应槽间循环的动力 手段,也可以通过在发酵反应槽内部设置分离膜元件使发酵培养装置紧凑。下面就本发明中作为分离膜优选使用的多孔性膜的结构进行说明。本发明中的 多孔性膜具有适应被处理水的水质和用途的分离性能和透水性能,从阻止性能和透水性能 和耐污性这些分离性能方面来看,优选含有多孔质树脂层的多孔性膜。这样的多孔性膜在 多孔质基材的表面具有起分离功能层作用的多孔质树脂层。多孔质基材是支持多孔质树脂 层、给予分离膜强度的物质。多孔质基材的材质为有机材料和无机材料等,并没有特殊限定,但理想的是使用 有机纤维。优选的多孔质基材为使用纤维素纤维、三乙酸纤维素纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤 维和聚乙烯纤维等有机纤维构成的织布或无纺布,这其中,优选使用密度控制比较容易、制 造也容易的便宜的无纺布。另外,多孔质树脂层起到上述这种分离功能层的作用,可以优选使用有机高分子 膜。作为有机高分子膜的材质,可以列举,例如聚乙烯类树脂、聚丙烯类树脂、聚氯乙烯类树 脂、聚偏氟乙烯类树脂、聚砜类树脂、聚醚砜类树脂、聚丙烯腈类树脂、纤维素类树脂和三乙 酸纤维素类树脂等。有机高分子膜也可以是以这些树脂作为主要成分的树脂混合物。这其 中,作为主要成分,是指其成分含有50重量%以上、优选60重量%以上。其中,作为构成多 孔质树脂层的材料,优选通过溶液进行的制膜容易、且物理的耐久性和耐药性优异的聚氯 乙烯类树脂、聚偏氟乙烯类树脂、聚砜类树脂、聚醚砜类树脂和聚丙烯腈类树脂,最优选聚 偏氟乙烯类树脂或以其作为主要成分的树脂。这里,作为聚偏氟乙烯类树脂,优选使用偏氟乙烯的均聚物,其它还优选使用与可 以与偏氟乙烯共聚的乙烯类单体的共聚体。作为可以与偏氟乙烯共聚的乙烯类单体,可以 列举四氟乙烯、六氟丙烯和三氯一氟乙烯等。本发明中使用的分离膜可以是平膜,也可以是中空纤维膜。如果是平膜,其平均厚 度根据其用途来选择,但优选在20 μ m以上5000 μ m以下,更优选在50 μ m以上2000 μ m以 下的范围内选择。如上所述,本发明中使用的分离膜,理想的是由多孔质基材和多孔质树脂层形成 的多孔性膜。此时,多孔质树脂层可以浸透在多孔质基材中,多孔质树脂层也可以不浸透在 多孔质基材中,这根据用途进行选择。多孔质基材的平均厚度优选在50 μ m以上3000 μ m 以下的范围内选择。此外,多孔性膜为中空纤维膜时,中空纤维的内径优选在200 μ m以上 5000 μ m以下的范围选择,膜厚优选在20 μ m以上2000 μ m以下的范围内选择。此外,在中 空纤维的内部还可以含有由有机纤维或无机纤维制成筒状的织物或编物。
15
首先,就多孔性膜中的平膜的制作法进行简要说明。在多孔质基材的表面上形成含有前述树脂和溶剂的原液的被膜,同时使该原液浸 渍于多孔质基材中。然后,只使具有被膜的多孔质基材的被膜侧表面与含有非溶剂的凝固 浴接触,使树脂凝固,同时在多孔质基材的表面上形成多孔质树脂层。原液通过使树脂溶解 于溶剂中来制备。原液中还可以含有非溶剂。从制膜性的角度考虑,原液温度通常优选在 15 120°C的范围内选择。这里,还可以在原液中添加开孔剂。开孔剂具有在浸渍于凝固浴时被提取,使树脂 层成为多孔质的作用。通过添加开孔剂,可以控制平均细孔径的大小。开孔剂具有在浸渍 于凝固浴时被提取,使树脂层成为多孔质的作用。开孔剂优选在凝固浴的溶解性高。作为 开孔剂,可以使用例如氯化钙或碳酸钙等无机盐。此外,作为开孔剂,可以使用聚乙二醇和 聚丙二醇等聚氧化烯类、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩丁醛和聚丙烯酸等水溶性高分子化合物和 甘油。此外,溶剂为溶解树脂的溶剂。溶剂作用于树脂和开孔剂,促进它们形成多孔质树 脂层。作为这样的溶剂,可以使用N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N, N- 二甲基乙酰胺(DMAc)、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、N-甲基-2-吡咯烷酮、甲基乙基酮、四氢呋喃、四 甲基脲、磷酸三甲酯、环己酮、异佛尔酮、Y-丁内酯、甲基异戊基酮、邻苯二甲酸二甲酯、丙 二醇甲基醚、碳酸异丙烯酯、双丙酮醇、甘油三乙酸酯、丙酮和甲基乙基酮等。这其中,优选 使用树脂溶解性高的NMP、DMAc, DMF和DMS0。这些溶剂可以单独使用,也可以两种以上混 合使用。原液可以以优选5重量%以上60重量%以下浓度,使前述树脂溶解于上述溶剂中 来制备。此外,还可以在溶剂中添加例如聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和甘油等溶 剂以外的成分。非溶剂为不溶解树脂的液体。非溶剂起到控制树脂凝固的速度,从而控制 细孔大小的作用。作为非溶剂,可以使用水、甲醇和乙醇等醇类。其中,从价格方面考虑,优 选水或甲醇。非溶剂也可以是这些物质的混合物。下面,就多孔性膜中的中空纤维膜的制作方法简要说明。中空纤维膜可以通过从二重管式金属口外侧的管吐出包含树脂和溶剂的原液,并 从二重管式金属口内侧的管吐出中空部形成用流体,然后在冷却浴中冷却固化的方式制 作。原液可以通过使上述平膜的制造方法中所述的树脂以优选20重量%以上60重 量%以下的浓度溶解于上述平膜的制造方法中所述的溶剂中来制备。此外,通常可以使 用气体或液体作为中空部形成用流体。此外,在获得的中空纤维膜的外表面上还可以涂覆 (层叠)新的多孔性树脂层。层叠可以是为了使中空纤维膜的性质例如亲水性 疏水性或 细孔径等变化成所希望的性质而进行的。层叠的新的多孔性树脂层可以通过以下方式制 造,即通过使树脂溶解于溶剂的原液与含有非溶剂的凝固浴接触,使树脂凝固。该树脂的材 质优选使用例如与上述有机高分子膜的材质同样的材质。此外,作为层叠方法,可以将中空 纤维膜浸渍于原液中,也可以在中空纤维膜的表面上涂布原液,层叠后,挤出付着的原液的 一部分,用气刀吹掉,调整叠层量。本发明中使用的分离膜还可以通过与支持体组合,形成分离膜元件。使用支持板 作为支持体,该支持板的至少一面上配备本发明中使用的分离膜的分离膜元件是本发明使用的具有分离膜的分离膜元件的一个优选的实施方式。该实施方式中,膜面积难以变大时, 为了扩大透水量,优选在支持板的两面配置分离膜。作为分离膜的多孔性膜的平均细孔径,如果在如上所述的0. 01 μ m以上不到1 μ m 的范围内,则此膜兼具菌体和污泥等不泄漏的高排除率,以及高透水性,而且还可以不容易 堵塞地长时间保持透水性,而且能够以更高的精度和再现性的实施。在使用细菌类时,多孔 性膜的平均细孔径优选在0. 4μπι以下,平均细孔径如果不到0. 2 μ m,可以更合适的实施。 平均细孔径如果过小,透水量可能降低,因此本发明中,平均细孔径为0. Olym以上,优选 为0. 02 μ m以上,更优选为0. 04 μ m以上。这里,可以通过测定在倍率10,000倍的扫描型电子显微镜观察下,在 9. 2 μ mX 10. 4μ m的范围内可以观察到的所有细孔的直径,进行平均后求得平均细孔径。上述平均细孔径的标准偏差σ优选在0. 1 μ m以下。而且,平均细孔径的标准偏 差小,即细孔径的大小一致,能够获得均勻的透过液。为了使发酵运转管理变得容易,理想 的是平均细孔径的标准偏差越小越好。平均细孔径的标准偏差ο可以通过下述(式1)计算得出,其中以在上述 9. 2 μ mX 10. 4 μ m范围内能够观察到的细孔数作为N,以测定的各个直径作为Xk,以细孔直 径的平均值作为X(ave)。
权利要求
乳酸脱氢酶表达盒,所述乳酸脱氢酶表达盒是在启动子下游连接了编码乳酸脱氢酶的基因的乳酸脱氢酶表达盒,所述启动子是在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中,培养开始后50小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的5倍以上的基因的启动子。
2.权利要求1所述的乳酸脱氢酶表达盒,所述启动子是指数缺陷的抑制1基因(SED1 基因)、细胞壁关联蛋白质2基因(CWP2基因)或烯醇化酶1基因(EN01基因)的启动子。
3.权利要求1所述的乳酸脱氢酶表达盒,所述启动子为包含选自以下(a) (c)的碱 基序列的启动子,(a)包含序列号1 3任一项所示的碱基序列的启动子;(b)包含与含有序列号1 3任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严格条 件下杂交的碱基序列的启动子;(c)包含在序列号1 3任一项所示的碱基序列中缺失、替代和/或添加了1个或多个 碱基的碱基序列的启动子。
4.乳酸脱氢酶表达盒,其包含选自以下(a)组的启动子和选自以下(b)组的编码乳酸 脱氢酶的基因,(a)(1)包含序列号1 3任一项所示的碱基序列的启动子;(2)包含与含有序列号1 3任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严格条 件下杂交的碱基序列的启动子;(3)包含在序列号1 3任一项所示的碱基序列中缺失、替代和/或添加了1个或多个 碱基的碱基序列的启动子;(b)(1)包含序列号4 6任一项所示碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因;(2)包含与含有序列号4 6任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严格条 件下杂交的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因;(3)包含在序列号4 6任一项所示的碱基序列中缺失、替代和/或添加了1个或多个 碱基的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因。
5.转化酵母,在染色体中具有至少一个权利要求1 4任一项中所述的乳酸脱氢酶表 达盒。
6.权利要求5所述的转化酵母,所述转化酵母的选自指数缺陷的抑制1基因(SED1基 因)、细胞壁关联蛋白质2基因(CWP2基因)和烯醇化酶1基因(EN01基因)的至少一个基 因被权利要求1 4任一项中所述的乳酸脱氢酶表达盒替代。
7.权利要求5或6所述的转化酵母,所述转化酵母属于酵母属(Genus Saccharomyces)0
8.权利要求5或6所述的转化酵母,所述转化酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)0
9.乳酸的制造方法,包括培养权利要求5 8任一项中所述的转化酵母的培养步骤。
10.权利要求9所述的乳酸的制造方法,所述培养步骤是用分离膜过滤培养液、从滤液中 回收乳酸、再将未滤过液保持在或返流到培养液中,并且在培养液中追加培养基的连续发酵。
全文摘要
提供了可以同时达到高光学纯度、乳酸收率和乳酸生产速度的、在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中为了防止乳酸收率和乳酸生产速度降低所必需的编码乳酸脱氢酶的基因表达盒、具有该盒的酵母和通过培养该酵母实施的乳酸的制造方法。本发明的乳酸脱氢酶表达盒是在启动子下游连接了编码乳酸脱氢酶的基因的乳酸脱氢酶表达盒,在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中,所述启动子是培养开始后50小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的5倍以上的基因的启动子。
文档编号C12N15/09GK101939426SQ20088012635
公开日2011年1月5日 申请日期2008年12月5日 优先权日2007年12月7日
发明者泽井健司, 泽井秀树 申请人:东丽株式会社
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