涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法

专利名称：涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法
涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法优先权文件的引用根据35U.S.C. § 119(e)，本申请要求2007年12月11日递交的美国临时专利申请 系列号61/007，440的优先权。前述申请的申请日在此作为本申请的优先权日，上述临时专 利申请公开的内容在此通过引证全部并入本文。
背景技术：
在真核生物中，翻译过程开始于40S核糖体亚基招募之后，可以通过m7G封端结构 发生，或者通过封端独立机制发生，其中所述m7G封端结构是一种在mRNA的5’末端发现的 修饰的核苷酸。通过封端独立机制发生的翻译过程被定义为翻译过程的内部启动，可以通 过多种不同的机制来调节。通过其它机制完成招募之后，40S核糖体亚基移动到一种启动密 码子处，在这里，加入60S核糖体亚基，开始肽合成。包含位于mRNA5’和3’末端非编码片 段的序列因子能够影响翻译启动的作用。能够增强封端依赖性mRNA翻译作用效果的序列 因子被命名为翻译增强因子(TEE)。一些翻译增强因子(TEE)通过特定的机制增强翻译启动作用，所述机制包括与 RNA的组成部分，包括40S核糖体亚基、18S核糖体RNA (rRNA)的碱基配对。一些翻译增强 因子(TEE)还可以起到和核糖体招募为点的作用，能够促进翻译的内启动；但是，绝大多数 内部核糖体进入位点(IRESe)不能起到翻译增强因子(TEE)的作用。

发明内容
在本领域内存在对更多的翻译增强因子(TEE)的需要，在生物技术和基因疗法 中，翻译增强因子(TEE)能够用于调节蛋白质表达。这里公开的内容满足了这一需要和其 它需要。在一个方面，这里提供了分离的或合成的聚核苷酸序列，这种聚核苷酸序列可以 作用翻译增强因子(TEE)并且包括至少一个mRNA翻译增强因子(TEE)。所述聚核苷酸序列 中存在的翻译增强因子(TEE)由 RNSGAGMGRMR (SEQ ID NO 1)或者 MSCSGCNGM WA (SEQ ID NO 2)、或者其基本上相同的序列组成。同样，在这些聚核苷酸序列中可以包括每种翻译增 强因子(TEE)的一个以上拷贝(例如2个、5个、10个、25个、50个或者更多的拷贝)。在一个实施方案中，翻译增强因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO 3) 或者R具S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO :4)、或者其基本上相同的序列组成。在这些序列中，R1 是缺失，如果存在的话，是A或者G 是缺失，如果存在的话，是A、C或者G，优选是A、C、 或者G ^是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是C或者G讽是A或者C ;R2是缺失，如 果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺 失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C ；R3是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选 是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失；并且，R5是缺失，如果存在的话，是A， 优选是缺失;M3是缺失，如果存在的话，是C或者A，优选是C或者A ;S2是缺失，如果存在的 话，是C或者G，优选是C或者G ;S3是G或者C ;N2是G、C或者T ;M4是A或者C ；W是缺失，
4如果存在的话是A或者T ；R6是缺失，如果存在的话是A。在另一个实施方案中，翻译增强因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4组成。在这个 序列中，礼、R3和R4是缺失A1是A、C或者6成是(或者6讽是六或者(；&是六或者G 并且，M2是A或者C。在另一个实施方案中，翻译增强因子(TEE)由R具S2CS3GCN2GM4WR6组 成。在这个序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的话是A或者C ;S2是C或者G ；S3 是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ；W是缺 失，如果存在的话是A。在一些实施方案中，聚核苷酸序列包括一种翻译增强因子(TEE)，这种翻译增强因 子(TEE)具有的序列与SEQ ID NO :5-35所示序列有至少90%的一致性。在一些实施方 案中，聚核苷酸序列包括一种翻译增强因子(TEE)，这种翻译增强因子(TEE)具有的序列与 SEQ ID NO :5-35所示序列中的一种一致。在一些聚核苷酸序列中，至少存在两个拷贝的翻译增强因子(TEE)。在一些聚核苷 酸序列中，存在超过2个拷贝的翻译增强因子。在一些或者其它实施方案中，所述聚核苷酸 序列包括至少5个拷贝的翻译增强因子(TEE)、至少10个拷贝的翻译增强因子(TEE)、至少 25个拷贝的翻译增强因子(TEE)。在一个相关方面，这里提供了用于在真核细胞中重组表达多肽的克隆或者表达载 体。这种载体包括一种真核启动子，这种真核启动子与一种聚核苷酸序列可操作的相连，所 述聚核苷酸序列包括至少一个这里公开的mRNA翻译增强因子(TEE)。载体中存在的翻译增 强因子(TEE)由 RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO 1)或者 MSCSGCNGM WA(SEQ ID NO :2)、或者其基 本上相同的序列组成。在一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE)由 R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO 3)或者 R5M3S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO :4)、或者其基本 上相同的序列组成。在这些序列中，R1是缺失，如果存在的话，是A或者G ^是缺失，如果 存在的话，是A、C或者G，优选是A、C、或者G 是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是 C或者G讽是A或者C ;R2是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，R1和 R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C ;R3是 缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失； 并且，R5是缺失，如果存在的话，是A，优选是缺失;M3是缺失，如果存在的话，是C或者A，优 选是C或者A ;S2是缺失，如果存在的话，是C或者G，优选是C或者G ;S3是G或者C ;N2是 G、C或者T ;M4是A或者C ;W是缺失，如果存在的话是A或者T ；R6是缺失，如果存在的话是 A0在另一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 组成。在这个序列中，R1A3和R4是缺失A1是A、C或者G ^是C或者G 是A或者C ;R2 是A或者G并且，M2是A或者C。在另一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE) 由R具S2CS3GCN2GM4WR6组成。在这个序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的话是A 或者C而是C或者G而是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者 T ;M2是A或者C ；W是缺失，如果存在的话是A。在一些载体中，这种翻译增强因子(TEE)具有的序列与SEQID NO :5_35所示序列 基本一致。在一些载体中，这种翻译增强因子(TEE)具有的序列与SEQ ID N0:5-35所示序列中的一种一致。在一些载体中，所述mRNA翻译增强因子位于启动子的3’端并且能够与编码所关 心的多肽的第二聚核苷酸序列直接连接。这些载体中的一些进一步包括一种第二聚核苷酸 序列，这种第二聚核苷酸序列能够编码所关心的多肽，这种所关心的多肽与mRNA翻译增强 因子可操作的相连。在一些载体中，mRNA翻译增强因子位于第二聚核苷酸序列的5’前导 序列中。这里进一步提供了 DNA疫苗，这种DNA疫苗包括一种载体，能够表达这里描述的所 关心的抗原。这里进一步提供了一种宿主细胞(即，真核宿主细胞，例如CHO细胞)，这种宿 主细胞被载体转染。在进一步的方面，这里提供了重组制备所关心的多肽的方法。这些方法包括，构建 一种表达载体，这种表达载体包括一种真核启动子和至少一个拷贝(例如，1、2、3、4、5、10、 25、50或更多拷贝)的mRNA翻译增强因子，每个都与编码所关心多肽的聚核苷酸可操作的 相连。随后，将所得表达载体转染进入真核宿主细胞(例如，CHO细胞中)，并且培养用表 达载体转染的宿主细胞。在一个实施方案中，在载体中存在的mRNA翻译增强因子(TEE)由 RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO 1)或者 MSCSGCNGM WA(SEQ ID NO :2)、或者其基本上相同的序列 组成。在一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE)由 R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO 3)或者 R5M3S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO :4)、或者其基本 上相同的序列组成。在这些序列中，R1是缺失，如果存在的话，是A或者G ^是缺失，如果 存在的话，是A、C或者G，优选是A、C、或者G 是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是 C或者G讽是A或者C ;R2是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，R1和 R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C ;R3是 缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失； 并且，R5是缺失，如果存在的话，是A，优选是缺失;M3是缺失，如果存在的话，是C或者A，优 选是C或者A ;S2是缺失，如果存在的话，是C或者G，优选是C或者G ;S3是G或者C ;N2是 G、C或者T ;M4是A或者C ;W是缺失，如果存在的话是A或者T ；R6是缺失，如果存在的话是 A0在另一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 组成。在这个序列中，R1A3和R4是缺失A1是A、C或者G ^是C或者G 是A或者C ;R2 是A或者G并且，M2是A或者C。在另一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE) 由R具S2CS3GCN2GM4WR6组成。在这个序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的话是A 或者C而是C或者G而是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者 T ;M2是A或者C ；W是缺失，如果存在的话是A。这种翻译增强因子(TEE)具有的序列与SEQ ID NO :5_35所示序列基本一致。在 一些载体中，这种翻译增强因子(TEE)具有的序列与SEQ ID N0:5-35所示序列中的一种一 致。这些方法中的一些还可以进一步包括从宿主细胞或者从被培养宿主细胞周围的培养基 中纯化表达的重组多肽。使用这里描述的方法可以生产多种所关心的多肽。例如，这里所 描述的方法适用于许多在临床上十分重要的治疗剂蛋白质。通过参考本发明说明书的其它部分和权利要求书，可以实现对本发明特点和优势
的进一步理解。


图1是一种示意图，代表了翻译增强正反馈载体以及不同的启动子(PI)和转录增 强子(P2)、转录因子(TF)基因和所关心的蛋白。图2是一种示意图，代表了图1所示的翻译增强正反馈载体与一种第三蛋白阻碍 宿主蛋白质合成。图3显示了与大小吻合的参照构建物活性相比，5到25拷贝的各种翻译增强因子 在CHO细胞中翻译增强作用的翻译增强活性。图4显示了从不同的翻译增强因子(TEE)中衍生的一致性模体。图5显示了相对于大小吻合的参照构建物活性，根据模体序列1 (SEQ ID NO :1)或 者模体序列2 (SEQ ID NO 2)的合成序列的翻译增强活性。
具体实施例方式1.概述在这里公开的是一种新型的mRNA翻译增强因子(TEE)。具体的说，如随后实施例 中详细描述的，这里识别的是一些短核苷酸序列，这种短核苷酸序列能够增强哺乳动物宿 主细胞(例如，CHO和BHK细胞系)中的翻译作用。这里公开的是来自这种短核苷酸序列 的一致性模体或者翻译增强因子。在一个实施方案中，模体1是RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO: 1)，模体2是MSCSGCNGMWA(SEQ ID NO :2)。据显示，在这些序列中，R代表A或者G ;M代表 A或者C ;S代表G或者C ;W代表A或者U(T)；并且N代表A、G、C或者U(T)。在其他的实施方案中，模体1是R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO :3)。在这一序 列中，R1是缺失，如果存在的话，是A或者G 是缺失，如果存在的话，是A、C或者G，优选 是A、C、或者G 是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是C或者G ^是A或者C ;R2是缺 失，如果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2 是缺失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C ；R3是缺失，如果存在的话，是A或者G， 优选是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失。在另一个实施方案中，模体1是 R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO :3)，其中礼、R3> R4 是缺失，N1 是 A、C 或者 G J1 是 C 或者 G讽是A或者C ;R2是A或者G并且M2是A或者C。在另一个实施方案中，模体2是R具S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO 4)。在此序列中， R5是缺失，如果存在的话，是A，优选是缺失；M3是缺失，如果存在的话，是C或者A，优选是C 或者A ;S2是缺失，如果存在的话，是C或者G，优选是C或者G ;S3是G或者C ;N2是G、C或 者T ;M4是A或者C ;W是缺失，如果存在的话是A或者T ；R6是缺失，如果存在的话是A。在 另一个实施方案中，模体2是R具S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQID NO :4)。在此序列中，R5和R6是缺 失；M3是缺失，如果存在的话是A或者C ;S2是C或者G ；S3是C或者G并且S2和S3可以是 相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ；W是缺失，如果存在的话是A。此外，这里公开了根据一致性模体合成的其他一些具体序列(例如，SEQ ID NOs 5-35)。这些合成的序列不表示在用于识别模体序列的序列中。这些合成的序列显示增强 的翻译活性。包含一个或者多个这些序列拷贝的聚核苷酸序列能够提高翻译作用25倍。这里公开了翻译增强子，这种翻译增强子是分离的或者基本上纯的多聚核苷酸
7(例如，DNA)，包括至少一个这里公开的mRNA翻译增强因子(TEE)的一种或者一种以上拷 贝。当与一种编码所关心多肽的多聚核苷酸可操作的相连时，这种多聚核苷酸可以起到翻 译增强子的作用。示例性的翻译增强因子(TEE)显示在SEQ ID N0S:l-35中。请注意，尽 管这里描述的翻译增强因子(TEE)处于脱氧核糖核苷酸序列中，本领域技术人员应当容易 理解，翻译增强因子(TEE)或者包括所述翻译增强因子(TEE)的多聚核苷酸还可以包括相 应的核糖核苷酸序列。这里还提供了克隆载体或者表达载体，所述载体包括这里公开的翻 译增强因子(TEE)或者翻译增强子多聚核苷酸，以及怀有这些载体的宿主细胞。这里进一 步提供了使用这种翻译增强因子(TEE)、所述翻译增强子多聚核苷酸和所述表达载体来增 强翻译作用并产生所需多肽(例如，一种治疗剂蛋白)的方法。除非另有陈述，这里公开的方法使用传统的分子生物学方法(包括重组技术)、微 生物学方法、细胞生物学方法、生物化学方法和免疫学方法，这些方法包括在本领域技术人 员已知的范围内。这些技术在现有技术文献中有很好的阐述，例如，下列参考文献描述了示 illW^fe Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual (
验室手册)，Cold Spring Harbor Press (3rd ed.，2001) ；Brent et ah,Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学现有方案)，John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed.， 2003)；禾口 Freshney，Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique (动物细 胞培养基础技术手册)，Wiley-Liss，Inc. (4th ed. ,2000).2.定义本说明书并不局限于这里描述的具体的工艺、方案和试剂，可以存在变化。本领域 技术人员应该理解，这里使用的术语只起到描述具体的实施方案的目的，并不打算作为对 本发明范围的限制，本发明的范围有所附权利要求书来描述。如这里使用的，除非上下文另有明确定义，否则单数形式“一种(a)” “一个(an)” 和“所述(the)”包括复数意义。因此，例如，“一种细胞”包括这种细胞的复数形式，提到 “一种蛋白”包括一种或一种以上的蛋白质以及本领域技术人员已知的等同物，以此类推。除非另有定义，否则所有这里使用的科学技术术语具有本领域普通技术人员通 常所理解的意义。下列参考文献向本领域普通技术人员提供了许多这里所公开术语的 通用定义Academic Press Dictionary of Science and Technology (学术出片反社的 科学技术词典)，Morris(EcL)，Academic Press (学术出版社)(1st ed.，1992) ； Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(生物化学和分子生物学牛津词 典)，Smith et al. (Eds.), OxfordUniversity Press (牛津大学出版社)(revised ed.， 2000) ；Encyclopaedic Dictionary of Chemistry (化学百禾斗全书词典)，Kumar (Ed.)， Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002) ；Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(微生物学和分子生物学词典)，Singleton et al. (Eds.)，John Wiley & Sons (3rd ed. ,2002) ；Dictionary of Chemistry (化学词典)，Hunt (Ed. )，Routledge (1st ed. , 1999) ；Dictionary of Pharmaceutical Medicine (药物医学辞典)，Nahler (Ed.)， Springer-Verlag Telos (1994) ；Dictionary of Organic Chemistry (有机化学词典)， Kumar and Anandand(Eds. )，Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002) ；and A Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference)，Martin and Hine (Eds·)，Oxford University Press (4th ed. , 2000).这里提供了专用于本发明公开内容的术语的进一步的介绍。
这里使用的术语“试剂”包括任何物质、分子、因子、化合物、单位或者他们的结合。 他包括但不局限于，例如，蛋白质、多肽、小有机分子、多聚糖、多聚核苷酸等等。他可以是一 种天然产物、一种合成的化合物、或者一种化学化合物，或者两种或更多种物质的结合。除 非另有规定，术语“试剂”、“物质”和“化合物”可以互换使用。这里使用的术语“作用子”是指一种DNA单元，能够编码单一多肽或者蛋白质。术 语“翻译单元”是指一种DNA片段，在此片段中，能够发生RNA的合成。术语“DNA疫苗”是指一种DNA，这种DNA可以被引入到一种宿主细胞或者组织中， 并且在其中通过细胞进行表达，从而产生一种信使核糖核酸(mRNA)分子，信使核糖核酸 (mRNA)分子随后被翻译，从而产生一种DNA编码的疫苗抗原。术语“所关心的基因”包括一种作用子、一种开放阅读框(ORF)或者一种密码蛋 白质产物(所关心的蛋白质)的多聚核苷酸序列，所述蛋白质产物(所关心的蛋白质)的 生产可以通过翻译增强因子(TEE)调节。所关心的基因的实施例包括编码治疗剂蛋白质 的基因、编码营养蛋白质的基因和编码工业有效蛋白质的基因。所关心的基因还可以包括 报道基因或者可选择的标记物基因，例如，增强绿色荧光的蛋白质(EGFP)、荧光素酶基因 (Renilla 或者 Photinus)。表达作用是一种过程，通过这种过程由DNA产生蛋白质。该过程包括基因转录变 成mRNA和随后的mRNA翻译变成一种多肽。这里使用的术语“内源性”是指一种通常发现在野生型宿主体内的基因，而这里使 用的术语“外源性”是指通常不能在野生型宿主体内发现的基因。这里使用的“宿主细胞”涉及一种活细胞，在这种活细胞中，异源多聚核苷酸序列 能够被引入或者已经被引入。所述活细胞包括经过培养的细胞和活组织内部的细胞。向 细胞中引入异源多聚核苷酸序列的方法是本领域内已知的，例如，转染方法、电穿孔方法、 磷酸钙沉淀、微量注射法、转化方法、病毒传染法、和/或其他方法。通常，所述被引入细胞 中的异源多聚核苷酸序列是一种可复制的表达载体或者克隆载体。在一些实施方案中，宿 主细胞可以被设计并在其染色体或者基因组上合成一种需要的基因。本领域普通技术人 员已知的许多宿主细胞都可以被使用(例如，CHO细胞)作为宿主。例如，参见Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验室操作指南)，Cold Spring Harbor Press (冷泉港出版社)(3r ed.，2001)；禾口Brent et al,Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学现有方案)，John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003).。在一些实施方案中，所述宿主细胞是一种真核细胞。这里使用的术语“同系物”是指一种序列，这种序列与参照序列(例如，这里公开 的特异性mRNA翻译增强因子)具有基本上一致的结构(例如，核苷酸序列)。通常，所述同 系物能够维持增强所关心的基因编码的mRNA翻译作用的能力。通过在如上所述的参照序 列上制造突变，在表达载体上适当的位置插入突变序列并进行活性筛选同系物，所述表达 载体包括一种启动子，所述启动子可操作的与一种报道基因或者所关心的基因相连接。然 后，可以将表达载体引入宿主细胞，从而检测基因编码的蛋白质的翻译作用。如果报道基因 的翻译与在参照增强子序列控制的情况下报道基因的翻译作业相同的话，突变序列就是一 种功能性的同系物。术语"诱导剂"是用来指那些从一种可诱导翻译的调节因子来影响翻译的一种
9化学的、生物学的或物理的试剂。作为对诱导剂的响应，从该元件的翻译通常从头开始或提 高表达的基本的或组成水平。诱导剂可以是，例如，细胞遭受一种应激状态，例如，一种热或 冷冲击，一种毒剂例如一种重金属离子，或一种营养，激素，生长因子，等等的缺乏；或者可 以是一种化合物，这种化合物是那些影响细胞的生长或者分化状态的物质，例如一种激素 或者一种生长因子。惯用语"分离的或者纯化的多聚核苷酸"意思是包含一个多聚核苷酸序列(例 如，DNA)，这个多聚核苷酸序列是从自然存在的有机体的基因组中立即连接的序列的两头 分离到的。纯化的多聚核苷酸可以是一种双链或者单链的寡聚核苷酸；结合进载体的一种 多聚核苷酸片段；一种被插入到真核的或者原核生物的基因组中的片段；或者是用作探针 的一种片段，惯用语"基本上纯的，“当指一种多聚核苷酸时，意思是该分子已经与其他的 伴随的生物组分分离开的，所以，一般地，在一个样品中它至少有百分之85或者更大的百 分比。术语“核苷酸序列”，“核酸序列”，“核酸”，或者“多聚核苷酸序列”，指的是一种脱 氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸聚合物，它是单链的或者是双链的形式，并且除非另外限定， 包含那些以类似于自然地存在核苷酸的方式杂交到核酸中的已知的自然的核苷酸的类似 物。核苷酸序列可以是，例如，原核生物的序列，真核生物的信使核糖核酸序列，来自真核生 物的信使核糖核酸的互补DNA序列，来自真核生物的脱氧核糖核酸的基因组脱氧核糖核酸 序列(例如，哺乳动物脱氧核糖核酸)，和合成的脱氧核糖核酸或者核糖核酸序列，但并不 限于这些。术语“启动子”意思是一种能够指导转录并且是在转录的起始的核苷酸序列。各 种各样的启动子序列在本领域中是已知的。这些因子可以包含，但不局限于，TATA-盒子， CCAAT-盒子，噬菌体核糖核酸聚合酶特异的启动子(例如，T7，SP6，和T3启动子)，一种SPl 位点，和一种环AMP响应因子。如果该启动子是可诱导的类型，则它的活性随诱导剂而增 加。五个主要的引物或者未翻译的区域(5'引物，5'引物序列或者5' UTR)是一种 特殊的的信使核糖核酸(mRNA)和编码它的脱氧核糖核酸的片段。它起始于+1位点(转录 开始的位置)并且刚好在编码区域的起始密码子(通常是AUG)前结束。在细菌中，它可能 包含通常所说的Shine-Delgarno序列的一种核糖体结合部位(RBS)。5'引物可能是一百 或更长的核苷酸，并且3 ‘ UTR可能更长(直至几千个K碱基长)。术语“可操作地连接”或者“可操作地联系”指的是遗传因子之间功能的连接，它 们以一种那些能使它们进行它们正常的功能的方式来连接。例如，当一个基因的转录在启 动子的控制之下它可操作地连接到该启动子上并且产生的转录产物是正确地被转换为由 该基因正常地编码的蛋白质。同样地，如果它允许上调由该基因转录的信使核糖核酸的翻 译，翻译增强因子可操作地与所关心的基因相联系。适合于定向连接反应的核苷酸序列，例如，多酶连接子，是那些提供了位点或者将 一个多聚核苷酸序列定向连接成载体的一种表达载体的一个区域。一般地，一种定向多酶 连接子是一种核苷酸序列，它定义为两个或更多限制性核酸内切酶识别序列，或者限制位 点。当限制分裂时，这两个位点产生粘性末端这样多聚核苷酸序列可以连接到表达载体上。 在一种实施方案中，当限制分裂时，这两个限制酶切位点提供了粘性末端也就是说非互补的并且因此允许定向插入一种多聚核苷酸序列到盒子中。例如，适合于定向连接的核苷酸 序列可以包含一种核苷酸序列，它定义为多次定向克隆方法。适合于定向连接的核苷酸序 列的位置定义为多限制酶切位点，它称为一个多克隆位点。对治疗来说的术语“患者”指的是分类为哺乳动物的任何动物，例如，人和非人的 哺乳动物。非人类的动物的实例包含狗，猫，牛，马，绵羊，猪，山羊，兔，等等。除了注解的时 候外，术语“病人”或者“患者”在这里可互换使用。在一种实施方案中，患者是人。转录因子指的是那些要求开始或者调节转录的任何多肽。例如，这些因子包含，但 不局限于，c-Myc，c-Fos，c-Jun, CREB，cEts, GATA，GAL4, GAL4/Vpl6, c_Myb，MyoD，NF_ κ β，细 菌噬菌体-特异核糖核酸聚合酶，Hif-1，和TRE。编码这些因子的序列的实例包含，但不局 限于，基因银行登记号 K02276 (c-Myc)，K00650 (c-fos)，BC002981 (c-Jun)，M27691 (CREB)， X 14798(cEts)，M77810(GATA)，KO1486 (GAL4)，AY136632 (GAL4/Vpl6)，M95584 (c-Myb)， M84918 (MyoD)，2006293A (NF- κ B)，NP 853568 (SP6RNA 聚合酶)，AAB28I 1 1 (T7RNA 聚合 酶)，NP 523301 (T3RNA 聚合酶)，AF3M6CM (HIF-I)，andX63547 (TRE)。一种“基本上相同的”核苷酸或者氨基酸序列指的是一种核苷酸或者氨基酸序 列，它包含一种序列，其至少90%的序列与通过在这里所描述的众所周知的程序(例如， BLAST)使用标准参数来测定的对照序列相同。这些序列同一性可以是至少95%，至少 98%，和至少99%。在一些实施方案中，患者序列具有同对照序列相比大致一样的长度，那 就是说，那就是说，由大致一样数量的连续的氨基酸残基(对于多肽序列)或者核苷酸残基 (对于多聚核苷酸序列)组成。序列同一性可以很容易地用本领域技术人员所已知的各种各样的方法来确 定。例如，BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用缺省字长(W) 11，期望值(E) 10，M = 5， N = -4，来对两条链作比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用缺省字长(W) 3，期望值 (E) 10，和 BL0SUM62 评分矩阵(参见 Henikoff&HenikofT，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915(1989))。序列同一性的百分比通过在一个比较窗口上比较两个最佳地-定位序列来 确定，为了这两个序列最佳的定位在这里比较窗口中多聚核苷酸序列部分与对照序列(它 不包含增加的部分或者删除部分)相比可能包含增加的部分或者删除部分(也就是，缺 口)。百分比的计算由位点的数目来确定，在这些位点处存在于这两个序列中的相同的核酸 碱基或者氨基酸残基来得到匹配位点的数目，将匹配位点的数目除以比较窗口中总的位点 数目并且将结果乘以100来得到序列同一性的百分比。术语“翻译增强因子(TEE) ”指的是那些增加由信使核糖核酸产生的多肽或者蛋 白质的数量，高于由于单独的帽子结构的翻译水平的顺式活性序列。本领域技术人员已知 的TEE的实例包含Gtx同源结构域蛋白质的5'引物中的序列(Chappell等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 =9590-9594,2004) 另外，在这里所公开的新的 TEE，例如，SEQ ID NO: 1-35。除非另作说明，TEE指的既是信使核糖核酸序列中的翻译增强因子也是脱氧核糖核 酸序列中相应的编码序列因子。“翻译增强子多聚核苷酸”或者“翻译增强子多聚核苷酸序列，，是包含一种或多种 这里所示例的特异的TEE(也就是，SEQ ID N0 1-35)或者它们的变体，同源物或者功能衍 生物的多聚核苷酸。一种特异的TEE的一个或者多拷贝可以存在于该多聚核苷酸中。翻译 增强子多聚核苷酸中的TEE可以组成一个或者多个序列片段。一个序列片段可以怀有一种或多种这里所示例的特异的TEE，每隔TEE均已一个或者多个拷贝的形式存在。当多重序列 片段存在于一种翻译增强子多聚核苷酸中时，他们可以是同源的或者异源的。因此一种翻 译增强子多聚核苷酸中的多重序列片段可以怀有相同的或者不同的类型的在这里所示例 的特异的TEE，每一个特异的TEE的拷贝份数是相同的或者不同的，并且/或者每个序列片 段内的TEE是相同的或者不同的组成。术语“治疗”或者“减轻”包含化合物或者药剂的给药患者来防止或者延缓一种疾 病(例如，一种心脏机能障碍)的症状，并发症，或者生化的征候，减轻这些症状或者阻止或 者抑制该疾病，状态或者病症的进一步的发展。需要治疗的患者包含已经遭受该疾病或者 病症以及那些有该病症倾向的或者那些将预防该病症的病人。治疗可以在该疾病后显现预防(预防或者延缓该疾病的发病，或者预防它的临床 的或者临床症状不显的症状的显现)或者治疗的抑制或者减轻症状。在心脏重塑和/或心 力衰竭的治疗中，一种治疗剂可以直接减少该疾病的病状，或者致使该疾病对其他的治疗 剂的治疗更敏感。术语“载体”或者“构造”指的是多聚核苷酸序列因子以一种固定的组织类型排列 以致与这些因子可操作地连接的基因/基因产物的表达可以预见地控制。一般地，他们是 可传染的多聚核苷酸序列(例如，质粒或者病毒)，一种外来的脱氧核糖核酸片段可以接合 到这些多聚核苷酸序列中以便将外来的脱氧核糖核酸引入到宿主细胞来加速它的复制和/ 或转录。克隆载体是是一种脱氧核糖核酸序列(一般为一种质粒或者噬菌体)，它能够在 宿主细胞中自主复制，并且它具有一个或者少量的限制性核酸内切酶识别位点。一种外来 的脱氧核糖核酸片段可以在这些位点接合进该载体以便该片段的复制和克隆。该载体可以 包含一种或多种标记来用于识别转化的细胞。例如，标记可以提供了四环素或者氨苄青霉 素抗性。表达载体类似于克隆载体但是它在转化进入宿主后能够诱导那些已经克隆到该 载体中的脱氧核糖核酸的表达。被克隆的脱氧核糖核酸通常受某些调节的序列例如启动子 或者增强子的控制(也就是，可操作的联系到)。启动子序列可以是结构的，可诱导的或者 可抑制的。表达载体类似于克隆载体但是它在转化进入宿主后能够诱导那些已经克隆到该 载体中的脱氧核糖核酸的表达。被克隆的脱氧核糖核酸通常受某些调节的序列例如启动子 或者增强子的控制(也就是，可操作地连接到)。启动子序列可以是结构的，可诱导的或者 可抑制的。III.翻译增强子多聚核苷酸和重组载体在这里提供了分离或者基本上纯化的作为翻译增强子功能的多聚核苷酸。这些 翻译增强子多聚核苷酸包含治这里所公开的特异的信使核糖核酸翻译增强子因子(TEE) 或者它们的变体，同源物或者功能性的衍生物。翻译增强子多聚核苷酸可以包含一种或多 种序列片段，这些序列片段包含一致的Motif KSEQ ID NO 1), Motif 2 (SEQ ID NO 2), Motif la (SEQ ID NO :3)，或者Motif 2a (SEQ ID NO :4)。一些翻译增强子多聚核苷酸可以 包含一种或多种序列片段，这些序列片段包含如SEQ ID N0:5-35所示的特异的信使核糖核 酸TEE的一个。如下面的实例所证明的，那些怀有这些信使核糖核酸TEE中的一个的载体
12中所关心的多肽的表达导致蛋白质产量显著的增加。除了如SEQ ID N0:135所示的信使核 糖核酸TEE之外，信使核糖核酸TEE也可以包含序列，这些序列基本上和这些例证序列的一 个一致并且可以保持在宿主细胞中所关心的一种可操作地连接的基因的表达增强的基本 的功能特性。翻译增强子多聚核苷酸中的序列片段可以包含如SEQ ID NO :1_35所示的仅仅一 个特异的信使核糖核酸TEE或者几个信使核糖核酸TEE。存在于一种序列片段中的每一个 特异的信使核糖核酸TEE，该序列片段中只能仅有该信使核糖核酸TEE的一个拷贝。替代 地，每一个信使核糖核酸TEE的多拷贝可以存在于各自的序列片段中。一般地，翻译增强子 多聚核苷酸中不同的信使核糖核酸TEE因子可以是操作上连接的彼此靠近或者被那些长 度1到大约100核苷酸不等的间隔核苷酸序列分开。一些翻译增强子多聚核苷酸包含仅仅 一个序列片段。其它的翻译增强子多聚核苷酸包含大量的序列片段。在后面的实施方案中， 该序列片段可以是同源的或者异源的。因此，一些实施方案涉及一种翻译增强子多聚核苷酸序列片段，它包含一种信使 核糖核酸TEE序列，这些信使核糖核酸TEE序列与如SEQ ID NO 1-35所示的序列的一个一 样或者基本上一致。其它的实施方案涉及一种翻译增强子多肽序列片段，它包含如SEQ ID NO :1_35所示的一种特异的信使核糖核酸TEE的2，3，4，5，10，25，50或更多拷贝。在一些 实施方案中，该翻译增强子多聚核苷酸涉及一种序列片段，它包含超过一个(例如，2，3,4, 5，或更多)如SEQ ID NO :1-35所示的不同的信使核糖核酸TEE或者它们的变体或者同源 物。在这些实施方案中，每一个特异的信使核糖核酸TEE可以以一种或多种拷贝(例如，2， 3，4，5，10，25或更多拷贝)的形式存在。在其它的实施方案中，该翻译增强子多聚核苷酸 包含超过一个上面注解的序列片段。不同的序列片段可以按照特异的信使核糖核酸的类型 和每个特异的信使核糖核酸TEE所怀有的拷贝数目来一致。替代地，多重序列片段可以在 特异的信使核糖核酸TEE的类型和/或每个特异的信使核糖核酸TEE的拷贝数目上有所不 同。在任何实施方案中，除了如SEQ ID NO :1-35所示的信使核糖核酸TEE外，这些特异的 TEE的变体或者带有基本上一致的序列的同源物也是能使用的。在此公开的特异的信使核糖核酸TEE或者翻译增强子多聚核苷酸可用于构造重 组克隆载体或者表达载体。这些载体对于表达所关心的多肽或者蛋白质是非常有用的，例 如，一种治疗的蛋白质。他们还可以用于治疗的应用例如脱氧核糖核酸疫苗或者基因治疗。 重组载体可以由一种质粒，病毒或者其他的本领域技术人员已知的载体通过插入或者结合 这里所描述的特异的信使核糖核酸TEE或者翻译增强子多聚核苷酸的一个或者多个来构 建。这些载体的实例在下面的实施例中会讨论到。一般地，该载体包含一种适合于表达一 种宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中所关心的多肽的启动子。在该载体中，一种包含 TEE的序列是可操作地连接到该启动子，例如，在3'到该启动子。序列片段包含如上所述 的一种TEE或者一种翻译增强子多聚核苷酸。该载体另外可以怀有一种适合于编码所关心 的多肽的多聚核苷酸序列的定向连接的核苷酸的序列。例如，一种多酶连接子可以用于克 隆该多聚核苷酸序列以便该克隆序列可操作地连接到该启动子和包含TEE的序列并且置 于该启动子和包含TEE的序列的控制之下。多酶连接子是那些可以有一系列的三或更多间 距小的限制性核酸内切酶识别序列的多聚核苷酸序列(参见，例如，Sambrook等，supra)。 在一些实施方案中，如实施例中所阐述的，该载体允许多聚核苷酸序列克隆进该载体某一
13位置以便TEE存在于编码所关心的多肽的转录信使核糖核酸的5'引物端。除了启动子和包含TEE的序列之外，在这里所描述的一些重组载体进一步地包含 所关心的一种基因或者编码所关心的一种蛋白质或者一种多肽的多聚核苷酸。所关心的基 因或者多聚核苷酸序列是可操作的连接到一种启动子序列和TEE，这种启动子序列和TEE 促进了宿主细胞中插入的多聚核苷酸序列的转录效率。真核生物的信使核糖核酸的翻译在 AUG密码子处开始，AUG编码信使核糖核酸的甲硫氨酸。因此，启动子和所关心的基因之间 的连接将不会包含任何用于甲硫氨酸的插入密码子。这些密码子的存在可能引起融合蛋白 质的形成(如果AUG密码子在作为所关心的基因的相同阅读框位置)或者缩氨酸的形成， 这样或者终止上游的可信的起始密码子或者重叠该基因，但在不同的阅读框中。在一些实 施方案中，编码一种蛋白质的所关心的基因包含5'引物和3'未翻译的(UTR)序列。在其 它的实施方案中，输出转录产物中的该5'引物和/或3'未翻译的区域已经先于所关心的 的基因的克隆存在于该载体中。在这些实施方案中，至少一个TEE位于该5'引物和/或该 3'未翻译的区域。一般地，该翻译增强子位于转录启动子和AUG密码子之间。相对于该启动子和所 关心的的基因的帽子位点TEE的精确位置不是关键性的；然而，该精确位置可能影响效率。 例如，一些TEE当位于编码信使核糖核酸的5'引物中，或者3'未翻译的区域中可以增强 翻译。在一些实施方案中，TEE位于所关心的的基因或者顺反子的5'前导序列中。在这些 实施方案中，增强子因子位于翻译起始位点内大约1-500个核苷酸，特别地是位于翻译起 始位点内大约1-100或者大约1-50个核苷酸。通过并入上面描述的的翻译增强子多聚核苷酸，重组载体可以有如SEQ ID NO 1-35所示的一种或多种该特异的翻译增强子因子。对于任何这些特异的增强子因子，该载 体可以怀有仅仅一个该增强子因子的拷贝或者相同增强子因子的多个拷贝。例如，为了增 加由一种联合顺反子的多肽表达，如SEQ ID NO 1-35所示的特异的TEE的2，5，10，20，35， 50或者75个拷贝的串联体可以存在于一些重组表达载体中。其它的载体有多重序列片段， 这些多重序列片段可以独立地包含一种或多种在这里所示例的特异的TEE序列。另外，重组或者表达载体可以包含辅助的序列因子。例如，载体可以包含一种复制 的起点，和特异的标记，这些标记允许转染的或者转化的宿主细胞的表型选择。存在于载体 实施方案其他因子的变化取决于宿主细胞类型，但通常包含涉及转录和翻译的开始和转录 的终止序列信号。翻译增强子序列也可能存在。载体还可以编码序列，该多腺苷酸化作用 包含带有相同转录单位，控制因子例如核糖体结合部位，和多腺苷酸化作用位点，被那些允 许在宿主细胞中克隆，表达，和转化的相同的或者不同的启动子，序列辅助的转录单位所控 制的辅助的转录单位。在一些实施方案中，该载体还可以包含编码一种分子标记的多聚核 苷酸，该标记可以便于从那些不表达所报道的基因的宿主细胞中分离那些表达该报道基因 的宿主细胞。在一些实施方案中，重组载体打算用于在真核生物的宿主细胞中表达所关心的蛋 白质。如下面所详细描述的，这些包含各种各样的哺乳动物细胞以及昆虫细胞或者植物 细胞。在一些实施方案中，提供了脱氧核糖核酸疫苗，它表达来自这里所公开的表达载体 的一种靶子抗原。适合用于真核生物中的大量载体是本领域技术人员所已经知道的。实 例包含用于哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee和Nathans，J. Biol. Chem. 263 3521，1988)；用于昆虫细胞中表达的baculo病毒衍生的载体；及其他如Botstein等， Miami Winter Symp. 19 265,1982 ；Broach Cell28 203,1982 ；Bollon ^,J. Cin. Hematol. Oncol. 10 :39，1980 ；和细胞生物学一种综论，Goldstein和Prescott (eds.)，学术出版社 公司，美国(1980)描述的用于真核生物的表达的载体。在一些实施方案中，该翻译增强子 因子或者多聚核苷酸结合进脱氧核糖核酸构造设计用于同源重组。这些构造的描述，例如， Capecchi，TIG 5 :70，1989 ；Mansour et α/·，自然 336 :348，1988 ；Thomas et al，细胞51 503,1987 ；and Doetschman et al,自然 330 :576，1987。为了所关心的蛋白质的载体表达，信使核糖核酸TEE或者翻译增强子多聚核苷酸 一般存在于可操作地连接到调节因子例如如上所述的一种启动子的载体中。取决于所关 心的特殊蛋白质和使用的载体/宿主系统，许多不同的启动子可以用于重组载体中。能被 使用的启动子的实例包含老鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等，J. MoI. Appl. Gen. 1 273，1982)；疱疹病毒的快速的早期和TK启动子(Yao等，J. Virol. 69 =6249-6258,1995)； SV 40早期启动子(Benoist等自然290 :304-310，1981)；和人CMV启动子(Boshart等细 胞41 =521-530,1985) ；CaMV的35S核糖核酸和19S核糖酸启动子(Brisson等，自然，310 511，1984 ;0dell等，自然，313 :810，1985)；来自玄参花叶病毒(FMV)的全长转录产物启动 子(Gowda等，J.Cell Biochem. , 13D =301,1989)和来自烟草花叶病毒的外壳蛋白启动子 (Takamatsu等，EMBO J. 6 :307，1987)。可用于构造重组表达载体的辅助的启动子包含来自 核酮糖双磷酸盐羧化酶(ssRUBISCO)的小亚基的松的-可诱导的启动子(Coruzzi等，EMBO J.，3 =1671,1984 ；和Broglie等，科学，224 =838,1984)；甘露碱合成酶基因启动子(Velten 等，EMBO J.，3 2723,1984)；胭脂碱合成酶(NOS)启动子(Shaw 等，Nucl. Acids Res.，12 7831-46,1984)；章鱼碱合成酶(OCS)启动子 Koncz 等，EMBO J. 2 1597-603，1983)；和热休 克启动子，例如，大豆 hspl7. 5-E 或者 hspl7. 3B(Gurley 等，MoI. Cell. Biol.，6 :559，1986 ； Severin 等，Plant MoI. Biol.，15 :827，1990)。启动子可以既包含结构的也可以包含可诱导的自然的启动子以及设计的启动子。 CaMV启动子是结构的启动子的实例。为使其最有用，可诱导的启动子将1)在诱导物不存在 时提供低的表达；2)在诱导物存在时提供了高的表达；3)使用那些不干扰植物的正常的生 理学的诱导程序；和4)对其他的基因的表达无效。在一些实施方案中，该重组载体可以选择性地包含一种可选择的标记。该标记一 般地编码一种性状或者一种允许选定区域的表现型，或者用于包含该标记的宿主细胞筛 选。在一种实施方案中，该标记基因是一种抗生素抗性基因由此合适的抗生素可用于从那 些没有转化的细胞之中筛选转化的植物细胞。合适的可选择的标记的实例包含腺苷脱氨 酶，二氢叶酸还原酶，潮霉素-B-磷酸转移酶，胸苷激酶，黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和 氨基苷3'-氧-磷酸转移酶II (卡那霉素，新霉素和G418抗性)。其他的合适的标记将 是本领域技术人员所已知的，例如，荧光标记例如GUS报道基因(UidA)，荧光素酶或者GFP 基因。IV.用于提高所关心的多肽的产量的宿主细胞翻译增强子多聚核苷酸和有关的载体在各种各样的工业和医疗的应用中是有用 的。在一些实施方案中，提供了使用这些表达载体/宿主细胞体系用于表达治疗的蛋白 质或者工业的公用事业在增加的水平上的蛋白质的用法。例如，可以用载体表达的治疗
15的蛋白质可以包含治疗的抗体例如赫赛汀，来自各种各样的病原体的多肽抗原例如细菌 或者病毒(例如，大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，疟疾，艾滋病病毒，狂犬病 病毒，HBV，和巨细胞病毒)引起的疾病，及其他蛋白质例如乳铁传递蛋白，硫氧还蛋白和 β-caseinvaccine。其他的合适的蛋白质或者多肽适当包含，例如，营养地重要的蛋白质； 发育增进因素；用于植物早开花的蛋白质；在某些环境条件下给植物提供保护的蛋白质， 例如，对于金属或者其他的有毒物质有抗性的蛋白质，例如除草剂或者杀虫剂；给予温度极 限耐受性应激相关蛋白质；给予真菌，细菌，病毒，昆虫和线虫抗性的蛋白质；特效的商业 价值的蛋白质，例如，涉及代谢途径的酶，例如EPSP合成酶。在这里所描述的怀有所关心的基因的重组载体和信使核糖核酸TEE或者增强子 多聚核苷酸可以通过使用本领域技术人员已知的任何方法引入到合适的宿主细胞中。例 如，载体可以通过磷酸钙共同沉淀，通过传统的机械的程序例如微量注射或者电转化，通过 脂质体包裹的质粒插入，和通过病毒载体的方法转染到宿主细胞中。这些方法全都是众所 周知的并且本领域技术人员熟练操作，，例如，Brent等，分子生物学通用操作规程，John ffiley& Sons，公司(ringbou 等，2003)；和 Weissbach & Weissbach，植物分子生物学方法， 学术出版社，纽约，VIII节，421-463页，1988。怀有该转染的重组载体的宿主细胞可以使用 载体上的选定区域标记来确定和分离。大量受体细胞可以在选择含有包含载体的细胞的培 养基中生长。这些细胞可以直接使用或者该表达重组蛋白质可以按照传统方法例如抽提， 沉淀，色谱法，亲合方法，电泳等等来纯化。使用的正确的程序取决于产生的特殊蛋白质和 利用的的特殊的载体/宿主表达体系。在一种实施方案中，用于表达该重组载体的宿主细胞是真核生物的细胞。真核生 物的载体宿主系统，和哺乳动物表达体系，允许适当的表达哺乳动物蛋白质的翻译后修饰 存在，例如，适当的进行主要的转录产物，糖基化作用，磷酸化作用和有益地表达产物的分 泌。所以，真核细胞例如哺乳动物细胞可以是用于所关心的的一种多肽的蛋白质的宿主细 胞。这些宿主细胞系的实例包含 CHO，BHK, HEK293, VERO, HeLa, COS, MDCK, NSO 和 W138。在一些实施方案中，使用设计的哺乳动物细胞系统，这些哺乳动物细胞系统利用 重组病毒或者病毒因子来指导所关心的的蛋白质的表达。例如，当使用腺病毒表达载体时， 与TEE或者翻译增强子多聚核苷酸一起的所关心的蛋白质的编码序列可以连接到腺病毒 转录/翻译控制复合物，例如，延迟的启动子和分成三部分的前导序列。然后这些嵌合的基 因可以通过体外或者体内重组被插入到腺病毒基因组中。病毒的基因组的非必要的区域中 插入将产生一种重组病毒，它有活力并且能够在受感染宿主中表达所关心的多肽(例如， see Logan & Shenk，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659,1984)。替代地，牛痘病毒 7. 5K启动子可以被使用，(例如，参见，Mackett等，Proc. Natl. Natl. Acad. Sci.美国，79: 7415-7419，1982 ；Mackett 等，J. Virol. 49 :857_864，1984 ；Panicali 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 :4927-4931，1982)。特别有兴趣的是基于牛乳头状瘤病毒的载体，它能够复制 作为超染色体因子(Sarver等，MoI. Cell. Biol. 1 :486，1981)。通过在质粒中包含一种可选 择的标记这些载体能被用于稳定的表达，例如新的基因。替代地，逆转录病毒基因组可以修 改用作一种能够引入并且指导所关心的基因在宿主细胞中表达的载体(Cone Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 =6349-6353,1984)。高水平表达也可以使用可诱导的启动子， 包括但不限于，金属硫蛋白HA启动子和热休克启动子来完成。
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用于重组载体表达的宿主细胞还可以是酵母。可以使用包含结构的或者可诱导的 启动子的大量载体。参见，例如，Brent等，分子生物学通用操作规程，John Wiley & Sons， 公司(ringbou等，2003)；和酵母的分子生物学，Strathem等(eds.)，冷泉港出版(1982)。 可以使用一种结构的酵母启动子例如ADH或者LEU2或者一种可诱导的启动子例如GAL。替 代地，可以使用载体促进外来脱氧核糖核酸序列整合进入到酵母染色体中。如果使用植物表达载体，所关心的的基因的表达可以由大量启动子的任何一个 来推动。例如，可以使用病毒启动子例如CaMV的35S核糖核酸和19S核糖核酸启动子 (Brisson等，自然310-511-514，1984)或者烟草花叶病毒的外壳蛋白启动子(Takamatsu 等，EMBO J. ,6 307 311,1987) 0替代地，可以使用植物启动子例如RUBISC0的小亚基 (Coruzzi 等，EMBO J. 3 1671 1680，1984 ；和 Broglie 等，科学 224 :838_843，1984)或者热 休克启动子(Gurley 等，MoI. Cell. Biol.，6 -.559-565,1986)。可用于带有重组载体的所关心的蛋白质的表达的一种替代的表达体系是昆虫体 系。在这样的一种体系中，苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)被用作一种表达外来基因 的载体。该病毒生长在草地贪夜蛾细胞中。绑定多肽编码序列的核苷酸_锌指可以克隆 进该病毒的不重要的区域并且置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子))的控制之 下。绑定多肽编码序列的核苷酸_锌指的成功插入将引起多角体蛋白基因的失活和非封闭 的重组病毒(也就是，通过多角体蛋白基因用于编码缺乏蛋白质外衣的病毒)的产生。然 后这些重组病毒用于感染细胞，在这些细胞中，插入基因得到表达。参见，例如，Smith等 J. Biol. 46 :584，1983 ；和 Smith，美国专利号 4，215，051)。一旦重组载体被引入合适的宿主细胞，表达的重组蛋白质可以按照常用方法例如 抽提，沉淀，色谱法，亲和层析，电泳等等来纯化。使用正确的方法既取决于产生的特殊蛋白 质又取决于利用的特殊的表达体系。对于长期的，高产率的重组蛋白质，稳定的表达是优选 的。胜于使用包含复制起点的载体，宿主细胞可以转化带有允许稳定的整合载体进入宿主 染色体的载体。带有稳定地整合的编码所关心的蛋白质的多聚核苷酸的宿主细胞可以逐渐 形成中心，该中心可以依次克隆并且扩大为细胞系。例如，随着外来脱氧核糖核酸的进入设 计的细胞可以允许在一种增菌培养基中生长1-2日，然后转到一种选择培养基中。V.治疗的应用进一步地提供了载体体系，这些载体体系可以用于各种各样的治疗的应用。例如， 用于蛋白质的治疗的表达的一种载体可以由上面描述的带有一种信使核糖核酸TEE或者 翻译增强子多聚核苷酸和编码治疗的蛋白质的一种多聚核苷酸构成。其他的实例包含用于 疫苗中的载体以便可以实现增加抗原产量。疫苗通常可以由一种表达载体组成，在这里疫苗抗原的表达是由于一个或多个翻 译增强子因子(例如，SEQ ID NOs 1-35)的存在而增强的。在一些实施方案中，脱氧核 糖核酸疫苗可以传递和表达多于一个抗原。除了编码该疫苗抗原和该翻译增强子因子的 序列之外，脱氧核糖核酸疫苗载体一般地也包含一种用于在真核生物的细胞中有活性的 转录开始的启动子。这些脱氧核糖核酸疫苗载体可以根据本领域技术人员众所周知的方 法来生成。例如，用于给定抗原的脱氧核糖核酸疫苗的制造和使用方法的描述见，例如， Gurunathan 等，Ann. Rev. Immunol. , 18 927, 2000 ；Krieg, Biochim. Biophys. Acta. , 1489 107，1999 ；Cichutek, Dev. Biol. Stand.，100 :119，1999 ；Davis, Microbes Infect.，1 -J,1999 ；和 Leitner,疫苗，18 :765，1999。上面描述的任何载体可以用于表达脱氧核糖核酸疫苗中的一种疫苗抗原。可用于 结构的脱氧核糖核酸疫苗的辅助载体可以包含病毒载体例如ALVAC (—种金丝雀痘病毒)， MVA ( —种牛痘变体)，和ADV5 (腺病毒5)载体，以及质粒载体例如pUC19 (ATCC#_37254)， pcDNA3. 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA),pNGVL(国家的基因载体实验室，密西根州大学，MI)， p414cyc(ATCC#_87380)，pBSL130(ATCC#_87145)，和 pECV25 (ATCC#_77187)。可以用于疫苗 载体的启动子的实例包含，例如，SV40早期启动子，巨细胞病毒快速的早期启动子/增强 子，和各种各样的在这里所描述的真核生物的启动子。疫苗抗原的不同的系列可以由脱氧核糖核酸疫苗来表达。这些包含，例如，艾滋病 病毒-I抗原，肝炎C病毒抗原，乙型肝炎病毒抗原，单纯性疱疹病毒抗原，痘病毒抗原，流感 病毒抗原，麻疹病毒抗原，登革热病毒抗原，痢疾内变形虫抗原，塞姆利基森林病毒抗原，乳 头状瘤病毒抗原，间日疟原虫和恶性疟原虫抗原。可以在脱氧核糖核酸疫苗中表达的抗原 的补充信息可以从网址DNAvaccine. com处获得。脱氧核糖核酸疫苗可用于使任何患者免疫以防止或者保护阻止病原体的传染 (例如，艾滋病病毒传染)。这些患者包含人和非人的动物例如啮齿动物(例如老鼠，家属 和豚鼠)，猪，小鸡，雪貂，非人的灵长类。本技术领域技术了脱氧核糖核酸疫苗给药到合适 的患者的方法。参见，例如，Webster 等，Vacc，12 =14951498,1994 ；Bernstein 等，疫苗，17 1964，1999 ；Huang 等，Viral Immunol.，12 :1，1999 ；Tsukamoto 等，病毒学 257 :352，1999 ； Sakaguchi 等，疫苗，14 :747，1996 ；Kodihalli 等，J. Virol. ,71 :3391，1997 ；Donnelly 等， 疫苗，15 =865,1997 ；Fuller 等，疫苗，15 =924,1997 ；Fuller 等，免疫细胞生物学，75 :389， 1997 ；Le 等，疫苗，18 1893, 2000 ；Boyer 等，J. Infect. Dis.，181 :476，2000。除了增强通过使用在这里所描述的特殊的TEE或者信使核糖核酸翻译增强子多 聚核苷酸的疫苗抗原的表达之外，脱氧核糖核酸疫苗还可以用带有一种辅助的合适的辅料 配制，可以使用的辅料包含，例如，磷酸铝或者铝羟基磷酸物，单磷酰基_脂质体A，QS-21皂 角苷，地塞米松，CpG脱氧核糖核酸序列，霍乱毒素，细胞因子或者趋化因子。这些辅料增强 脱氧核糖核酸疫苗的免疫原性。制备这些改进的脱氧核糖核酸疫苗的方法是本领域技术人 员已知的。参见，例如，Ulmer e/α/·，疫苗 18 18,2000 ；Schneerson 等，J. Immunol. 147 2136-2140,1991 ；Sasaki 等，Immunol. 65 :3520_3528，1997 ;Lodmell 等，疫苗，18 10591066，2000 ；Sasali 等，J. Virol. 72 :4931，1998 ；Malone 等，J. Biol. Chem. 269 :29903， 1994 ；Davis 等，J. Immunol. 15 :870，1998 ；Xin 等，临床免疫，92 :90，1999 ；Agren 等，免疫细 胞生物学 76 :280，1998 ；和 Hayashi 等，疫苗，18 :3097_3105，2000。在一些实施方案中，提供了用于增强治疗各种各样的疾病的治疗的蛋白质的表达 的方法。在这些方法中，怀有翻译增强子因子或者多聚核苷酸并且表达治疗的蛋白质的表 达载体通过载体和靶细胞的相互作用，体外或者体内转染进入靶细胞。组合物以一足够量 给药患者使得患者体内引起治疗性的响应。在大量的文献中这些基因治疗方法已经用于矫 正获得和继承遗传缺陷，癌，和病毒感染。参见，例如，Anderson，科学256 =808-813,1992 ； Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211_217，1993 ；Mitani & Caskey，TIBTECH 11 :162_166， 1993 ；Mulligan，科学 926-932，1993 ；Dillon, TIBTECH 11 :167_175，1993 ；Miller,自然 357 :455-460，1992 ；Van Brunt,生物技术 6 :1149_1154，1998 ；Vigne 等，RestorativeNeurol,禾口 Neurosci. 8 :35_36，1995 ；Kremer &Perricaudet, Br. Med. Bull. 51 :31_44， 1995 ；Haddada等，微生物学和免疫学中现行主题(DoerfIer & Bohm eds.，1995)；和Yu等， 基因治疗 1 :13-26，1994。在这里所描述的治疗的方法适合于治疗各种各样的疾病和病症。这些包含各种各 样的器官系统的恶性肿瘤，例如，肺，胸部，淋巴的，胃肠的，和生殖-泌尿道。也适合于治 疗腺癌，包含恶性肿瘤例如大多数结肠癌，肾细胞癌，前列腺癌，肺的非小细胞癌，小肠的癌 瘤，和食道癌。包含在这里所公开的一种信使核糖核酸TEE或者翻译增强子多聚核苷酸的 重组表达载体对治疗非恶性的细胞_增生疾病例如牛皮癣，寻常天疱疮，白塞氏综合征，和 类脂组织细胞增多病也是有用的。实质上，任何用治疗的蛋白质可以治疗或者改善的任何 病症被认为是对用表达载体治疗敏感的，该表达载体由于载体中翻译增强子因子的存在而 在增多的水平上表达该治疗的蛋白质。大量传送方法可用于在这里所描述的实践治疗的方法。这些方法对本领域技术人 员是众所周知的。非病毒载体传送系统包含脱氧核糖核酸质粒，裸露的核苷酸，和带有一种 运载工具例如脂质体的核苷酸复合物。病毒载体传送系统包含脱氧核糖核酸和核糖核酸病 毒，它在传送给细胞后有游离基因或者整合基因组。核苷酸的非病毒传递方法包含脂质体 转染，微量注射，基因枪方法，病毒颗粒，脂质体，免疫脂质体，聚阳离子或者脂酸共轭物， 裸露的脱氧核糖核酸，人工的病毒粒子，和DNA的增强吸收药剂。脂质体转染的描述见，例 如，美国专利号5，049，386，美国专利号4，946，787 ；和美国专利号4，897，355并且脂质体转 染试剂是商业上销售的(例如，Transfectam和Lipofectin)。适合于多聚核苷酸的有效的 受体识别脂转染的阳离子的和中性类脂包含那些，例如，WO 91/17424和WO 91/16024中所 描述的。可以传送到细胞(体外给药)或者靶组织(体内给药)。在许多基因治疗应用中，需要基因治疗载体高度专一的传送到一种特定的组织类 型。一般地病毒载体通过病毒外表面上的病毒外壳蛋白表达配位体成为融合蛋白质的方式 改进以对给定的细胞有专一性。选择的配位体对所关心的细胞上存在的已知的受体是有亲 和力的。例如,Han 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 :9747_9751，1995)报道说莫洛尼鼠科 的白血病毒可以改进来表达人heregulin融合到gp70，并且该重组病毒感染某些表达人表 皮生长因子受体的人乳癌细胞。这个原则可以延至其他的表达一种配位体融合蛋白质的病 毒对和表达一种受体的靶细胞。例如，丝状的噬菌体可以设计来显示抗体片段(例如，FAB 或者Fv)，这些抗体片段对于任何选择的细胞的受体实际上有特殊的绑定亲合力。尽管上面 描述的申请首要对于病毒载体，相同原则可以被用于非病毒载体。这些载体可以被设计包 含那些认为有利于特定的靶细胞吸收的特殊的吸收序列。表达载体通过给个体患者给药传送到体内，一般地通过系统的给药(例如，静脉 内的，腹膜内的，肌肉的，皮下的，或者颅内的输注)或者局部施用，如下所述。替代地，载体 可以体外传送给细胞，例如自个体患者的细胞外植体(例如，淋巴细胞，骨髓抽出物，组织 切片)或者万能供血者造血干细胞，然后通常在选择并入载体的细胞后将该细胞植入到患 者体内。对于诊断，研究，或者对于基因治疗(例如，通过转染的细胞再输注进入宿主生物 体)的体外细胞转染对本领域那些熟练的技术人员是众所周知的。在一种实施方案中，细 胞可以从患者体内分离，用核苷酸(基因或者互补DNA)转染，并且再注回到患者体内(例 如患者)。适合于体外转染的各种各样的细胞类型是本领域技术人员所熟知的(参见，例如，Freshney等，动物细胞培养，一种基本技术指南(第三版，1994)和为了评述怎样分离和 培养来自患者的细胞在这里列举的对照)。实施例提供下列实施例作为进一步阐述，但并不限制其范围。其他的变形对于本发明所 属领域普通技术人员来讲是显而易见的并且包括在本发明所附的权利要求保护的范围内。实施例1识别翻译增强子的IH反馈载体体系TEE的识别包括一种双重的单作用子正反馈载体的使用一种是编码Gal4VP16转 录因子的顺反子，另一种是编码Renilla荧光素酶的顺反子。两种顺反子包含带有4拷贝的 上游活化序列(UAS)的一种最小的启动子，这种启动子当绑定到Gal4VP16上增强了转录。 当被引入细胞时，该最小的启动子驱使信使核糖核酸和编码蛋白质极低的水平。那些可以 增强翻译进入Gal4VP16顺反子的5'引物的序列驱使Gal4VP16信使核糖核酸的翻译。然 后Gal4VP16蛋白质可以绑定这两种启动子增强转录，驱使它自己的转录和在两个基因的 启动子中通过特异的结合部位的另一个顺反子的转录从而开始正反馈环路。TEE从随机的 核苷酸序列库中被识别。在一种实施方案中，仅仅使用编码增强的GFP(EGFP)的顺反子并 且改善信噪比允许每个转染的细胞的单个库质粒的分离。确认包括在正反馈体系和非放大 载体体系两者中的试验。图表1阐述了一种示意图，代表了翻译增强正反馈载体以及不同的启动子(PI)和 转录增强子(P2)、转录因子(TF)基因和所关心的蛋白。转录因子基因和所关心的基因可以 在相同的或者不同的质粒上。对于选定区域的应用，一种随机的核苷酸序列(N)，η个核苷 酸长度，存在于转录因子信使核糖核酸的5'引物中。起翻译增强子因子(TEE)作用的序列 将便于这个信使核糖核酸的翻译。然后编码的转录因子将绑定到两个基因的启动子中的位 点并且增强它们的转录。在一种具体实施方案中，该构造表达两个信使核糖核酸一个编码 所关心的蛋白质，它可以是一种报道的蛋白质；另一个编码一种转录因子。两个信使核糖核 酸的转录都是通过最小的启动子驱动的但可以通过经由位于两个基因的启动子中的转录 因子的结合部位的转录因子的表达来增强。少量转录因子信使核糖核酸由最小的启动子表 达但是这个信使核糖核酸的翻译被编码转录因子的信使核糖核酸的5'引物中的障碍所阻 断。这个障碍可以是一种稳定的茎-圈结构和/或上游AUG起始密码子。这些转录因子的 合成取决于编码这个因子的信使核糖核酸中翻译增强子的存在。图2阐述了翻译增强子驱使的正反馈载体与一种第三蛋白阻碍宿主蛋白质合成。 开头两个基因(转录因子基因和所关心的基因)除了所有三种信使核糖核酸包含在它们的 5'引物中包含一种球座之外与图1中的是相同的。通过阻断宿主信使核糖核酸翻译并且 减少与它们的竞争第三蛋白质(例如，轮状病毒NSP3蛋白质)将增强开头两个编码的信使 核糖核酸的翻译。第三基因在启动子P3的转录控制之下，启动子P3是一种结构的启动子 或者一种可诱导的启动子。P3也可以包含启动子因子Pl和P2。对于选定区域的应用，对 于所关心的基因的信使核糖核酸和第三蛋白质将包含一种已知的TEE，同时该转录因子基 因将包含一种随机的核苷酸序列。在这个方案中，TEE抵抗第三蛋白质的活性。对于一种 蛋白质生产应用，所有三个基因可以包含一种已知的抵抗第三蛋白质活性的TEE。该三个基 因可以在一个，两个，或者三个不同的质粒上。使用正反馈体系来识别TEE的更详细的步骤在前面已经描述过，例如，PCT出版物W02007/025008。实施例2 —致的翻译增强子樽体的识别使用如上所述的一种双重的单作用子正反馈载体系统，那些在中国仓鼠卵巢 (CHO)及其他细胞系，包含BHK(小型的仓鼠肾)细胞中起翻译增强子作用许多短的核苷酸 序列被识别。这些翻译增强子因子(TEE)长度范围在七个到十二个不等。如图3所示，这些 TEE的多拷贝在CHO细胞中增强了蛋白质产量直到25倍。在每一个实施例中，在荧光虫荧 光素酶顺反子的5'引物中至少有5个相同的TEE连接的拷贝。第一个结构是不包含TEE 的大小对比对照。结构被短暂地转染的进CHO细胞并且在2日后试验。翻译效率涉及大小 对比对照结构的活性。在图3中，顶端13条信号号分别低于相应的对照条信号的由13个 不同的TEE的5个拷贝得到的结果。其次的两个条信号显示了 5个或者15个拷贝的另一 个TEE的翻译增强活性。底下的条信号阐明了当使用5-25个拷贝时又一个TEE序列的翻 译增强活性。这些TEE的几个显示了序列相似性，并且被公认的一致的模体由这些TEE来识 别(参见图4)。TEE模体的两个实施方案的序列如下RNSGAGMGRMR(SEQ ID N0:1)，和 MSCSGCNGMWA (SEQ ID NO :2)。注意到在这些序列中，R表示A或者G，M表示A或者C，S表 示G或者C，W表示A或者U，以及N表示A，G，C或者U。在另一个实施方案中，模体Ia序列是模体1是RmiSlGAGMlGR2M2R2R3R4(SEQ ID NO :3)。在这一序列中，Rl是缺失，如果存在的话，是A或者G ；Nl是缺失，如果存在的话，是 A、C或者G，优选是A、C、或者G ;S1是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是C或者G ；Ml 是A或者C ；R2是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，Rl和R2可以是 相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C ；R3是缺失，如 果存在的话，是A或者G，优选是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失。在另一 个实施方案中，模体 1 是 RmiSlGAGMlGR2M2R2R3R4(SEQ ID NO :3)，其中 R1、R3、R4 是缺失， 附是A、C或者G ;S1是C或者G ;M1是A或者C ;R2是A或者G并且M2是A或者C。在另一个实施方案中，模体2a序列R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO :4)。在此 序列中，R5是缺失，如果存在的话，是A，优选是缺失；M3是缺失，如果存在的话，是C或者A， 优选是C或者A ；S2是缺失，如果存在的话，是C或者G，优选是C或者G ;S3是G或者C ;N2 是G、C或者T ;M4是A或者C ；W是缺失，如果存在的话是A或者T ；R6是缺失，如果存在的 话是A。在另一个实施方案中，模体2是R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO :4)。在此序列 中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的话是A或者C ;S2是C或者G ； S3是C或者G并 且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ;W是缺失，如果存在 的话是A。^MM 3合成言核Il翻译t曾强子因子 射舌个牛基于上述注释的一致模体，合成大略相当于模体1和2的各种各样的特异的TEE 序列并且试验翻译增强活性(参见表格1的SEQ ID Ν0:5-35)。包含试验序列的脱氧核糖核 酸片段由两个重叠，互补的寡聚核苷酸彼此合成以及退火后生成。退火的寡聚核苷酸在每 个末端有未配对的核苷酸，它对使用EcoRl以及BamHl.克隆进载体提供了粘末端。该片段 在如实施例1中所述的正反馈表达载体中被克隆进荧光素酶报道基因信使核糖核酸的5' 引物。包含模体序列的Renilla荧光素酶结构然后短暂地转染进CHO细胞。3日后对细胞
21试验这些测试序列增强翻译的能力。一种对比对照(对照)质粒在克隆区域中包含polyA。 报道基因多肽的翻译效率上TEE的效果如图5所示。结果表明一致的模体是可预计相当于这些的模体的一个的一种TEE的翻译增强 活性的。也如同该图中显示的，基于模体1的TEE序列比那些基于模体2的TEE序列往往 引起更高的增强翻译水平。表1相当于一致的模体1 (Ml)和2(M2)在这里所描述的新的翻译增强子可以有各种各样的实际的和工业的应用。例如， 他们可以最小化与工业规模培养有关的成本并且减少药剂成本。较高的蛋白质浓度还可以 便于蛋白质提纯。另外，这些翻译增强子增强子可以实现那些由于弱的蛋白质表达而不可 能的过程，例如从一种脱氧核糖核酸疫苗中表达足够的抗原来产生一种免疫反应。这些可 用于显著地提高哺乳动物细胞中特殊蛋白质的产率。例如，许多治疗的蛋白质在CHO细胞 中被表达以确保正确的翻译后过程，CHO细胞是最常使用的用于大规模生产治疗的蛋白质。 除工业的蛋白质生产之外，翻译增强子在各种各样的载体体系中有潜在的使用。例如，为了 研究目的，蛋白质治疗的表达，和脱氧核糖核酸疫苗，为了增强抗原产量。尽管本发明说明书包含了具体实施方案并参照其优选的实施方案进行了描述，但 这些并不应被认为是本发明要求保护的范围或者任意可以要求保护的范围的限制，这只是 对特定实施方案特点的描述。本发明所属领域普通技术人员可以理解，在不脱离这里描述 的本发明的意思的情况下，在形式和细节上，本发明可以存在多种变化。在本发明说明书中 描述的某些特点以及相互独立的实施方案还可以被结合到一个实施方案中。反之，单一实 施方案所具有的各种特点可以分别被结合在多个实施方案中或者结合在任意合适的子结 合中。此外，尽管上面描述的特点以结合的方式发挥作用或者最初以结合的方式要求保护， 但在某些情况下，可以从这种要求保护的结合中删除一种或一种以上特点，并且要求保护 的结合可以包括一种亚结合或者亚结合的变体。本发明的范围被随后的权利要求书定义。在说明书中引用的所有的出版物、数据库、GenBank序列、专利和专利申请通过引 证在此全部并入本文，如同其中每个都被分别地特定的显示通过引证并入本文。
权利要求
一种分离的多核苷酸序列包含至少一种信使核糖核酸翻译增强因子(TEE)，在这里TEE由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO3)或者R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO4)、或者其基本上相同的序列组成，其中，R1是缺失，如果存在的话，是A或者G；N1是缺失，如果存在的话，是A、C或者G，优选是A、C、或者G；S1是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是C或者G；M1是A或者C；R2是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C；R3是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失；并且，R5是缺失，如果存在的话，是A，优选是缺失；M3是缺失，如果存在的话，是C或者A，优选是C或者A；S2是缺失，如果存在的话，是C或者G，优选是C或者G；S3是G或者C；N2是G、C或者T；M4是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A或者T；R6是缺失，如果存在的话是A。
2.根据权利要求1的分离的多聚核苷酸序列，在这里TEE由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4组 成。在这里R1, R3和R4是缺失的A1是A，C或G ^是C或者G讽是A或者C ;R2是A或者 G并且M2是A或者C。
3.根据权利要求1的分离的多聚核苷酸序列，在这里TEE由R5M3S2CS3GCN2GM4WR6组成， 在这里R5和R6是缺失;M3是缺失，如果存在的话是A或者C ;S2是C或者G ；S3是C或者G 并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ；W是缺失，如果存 在的话是A。
4.根据权利要求1，2或者3中任意一项的分离的多聚核苷酸序列，在这里翻译增强因 子(TEE)具有的序列与SEQ ID NO :5-35组成的序列群中选择的一个序列有至少90%的一 致性。
5.根据权利要求1，2或者3中任意一项的分离的多聚核苷酸序列，在这里翻译增强因 子(TEE)具有的序列与从SEQ ID NO :5-35组成的序列群中选择的一个序列相同。
6.根据权利要求1，2或者3中任意一项的分离的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少 2个拷贝。
7.根据权利要求1，2或者3中任意一项的分离的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少 5个拷贝。
8.根据权利要求1，2或者3中任意一项的分离的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少 10个拷贝。
9.用于在真核细胞中重组表达多肽的载体，这种载体包括一种真核启动子，这种真核 启动子与一种多聚核苷酸序列可操作的相连，所述聚核苷酸序列包括至少一个这里公开的 mRNA翻译增强因子(TEE)，在这里TEE是从权利要求1，2或者3的TEE中选择的。
10.根据权利要求9的载体，在这里信使核糖核酸增强因子组成的序列与从SEQID NO 5-35组成的序列群中选择的一个序列实际上是相同的。
11.根据权利要求9的载体，在这里信使核糖核酸增强因子组成的序列与从SEQID NO 5-35组成的序列群中选择的一个序列是相同的。
12.根据权利要求9的载体，在这里信使核糖核酸增强因子位于3’引物端并且适合定 向连接编码所关心的多肽的第二段多聚核苷酸序列。
13.根据权利要求9的载体，进一步包含编码所关心的多肽的第二段多聚核苷酸序列， 这个多聚核苷酸序列可操作地连接到信使核糖核酸增强因子。
14.根据权利要求9的载体，在这里信使核糖核酸增强因子位于第二段多聚核苷酸序 列的5’引物序列。
15.一种DNA疫苗包含根据权利要求9的载体。
16.一种真核宿主细胞转染根据权利要求9的载体。
17.根据权利要求16的宿主细胞，在这里宿主细胞是CHO细胞。
18.用于重组的生产一种多肽的方法包含(i)构建一种表达载体，这种表达载体包括一种真核启动子和mRNA翻译增强因子，每 个都与编码所关心多肽的聚核苷酸可操作的相连，在这里TEE是从权利要求1，2或者3的 TEE中选择的。( )转染表达载体计入真核宿主细胞；并且(iii)培养转染带有表达载体的宿主细胞；从而生产多肽。
19.根据权利要求18的方法，在这里信使核糖核酸增强因子组成的序列与从SEQID NO 5-35组成的序列群中选择的一个序列实际上是相同的。
20.根据权利要求18的方法，在这里信使核糖核酸增强因子组成的序列与从SEQID NO 5-35组成的序列群中选择的一个序列是相同的。
21.根据权利要求18的方法，进一步包含纯化的重组多肽。
22.根据权利要求18的方法，在这里宿主细胞是CHO细胞。
23.根据权利要求18的方法，在这里多肽是治疗的蛋白质。
全文摘要
这里提供了mRNA翻译增强因子(TEEs)，例如，SEQ ID Nos1-35。还提供了包括一种或者一种以上这里例举的具体TEEs或其变体、类似物或其功能性衍生物的翻译增强聚核苷酸。进一步提供了包括这种TEEs或翻译增强聚核苷酸的表达载体，以及含有这种载体的宿主细胞和表达系统。
文档编号C12N15/10GK101939428SQ200880126367
公开日2011年1月5日 申请日期2008年12月11日 优先权日2007年12月11日
发明者G·M·伊德尔曼, V·P·莫罗, 周伟 申请人:斯克利普斯研究所