用于生产异戊二烯的组合物和方法

专利名称：用于生产异戊二烯的组合物和方法
技术领域：
本发明大体涉及从培养细的胞生产异戊二烯的方法以及包括这些培养细胞的组 合物。
背景技术：
异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是多种合成聚合物，最典型为合成橡胶的关 键起始材料。异戊二烯是由多种微生物、植物、和动物种类所天然生产的。特别地，已 经鉴定出异戊二烯的两种生物合成途径甲羟戊酸(MVA)途径和非甲羟戊酸(DXP)途 径(

图19A和19B)。然而，来自天然发生的生物的异戊二烯产量在商业上并不具吸引 力。每年从异戊二烯的聚合生产约800,000吨的顺式聚异戊二烯；该聚异戊二烯中大多 数被用于轮胎和橡胶工业。异戊二烯也被共聚合以在其他产品如鞋类、机械产品、医药 产品、运动商品和胶乳中用作合成高弹体。目前，轮胎和橡胶工业是基于天然和合成橡胶的使用。天然橡胶获自橡胶树或 在非洲雨林中发现的植物的乳汁。合成橡胶主要是基于丁二烯聚合物。对于这些聚合 物，丁二烯作为乙烯和丙烯生产的副产物而获得。虽然异戊二烯可以通过石油分馏而获得，但是这一物质的纯化是昂贵且耗时 的。对C5烃类流的石油裂化只产生约15%的异戊二烯。因此，需要生产异戊二烯的更 加经济的方法。特别地，期望在速度、滴定度和纯度方面有足以满足稳健的商业化工艺 要求的生产异戊二烯的方法。也期望从廉价的起始材料生产异戊二烯的系统。发明简要说明一方面，本发明表征了生产异戊二烯的培养细胞。在一些实施方式中，本发明 提供培养细胞，该培养细胞产生基于异戊二烯的细胞湿重/小时(纳摩尔/gw。m/hr)计， 大于约400纳摩尔的异戊二烯/克细胞。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊 二烯合酶多肽和Gi)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包 括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如木糖或葡萄糖)、乙酸盐 /酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷 脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、 多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或 更多种的任一组合。在一些实施方式中，本发明提供具有异戊二烯的平均体积生产力大于约O.lmg/ L±if#a/hr的培养细胞。在一些实施方式中，本发明提供具有异戊二烯的峰值体积生产力 大于约0.5mg/L±if#a/hr的培养细胞。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二 烯合酶多肽和Gi)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐 /酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷 脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、 多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或 更多种的任一组合。在一些实施方式中，本发明提供将细胞培养基中大于约0.002%的碳转化成异戊 二烯的培养细胞。在一些实施方式中，该细胞具有ω编码异戊二烯合酶多肽和(ω有 效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培 养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三醇、甘 油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油 单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物 或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。在一些实施方式中，本发明提供包括编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的培养 细胞。在一些实施方式中，该细胞具有ω编码异戊二烯合酶多肽和Gi)有效地连接到 启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例 如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙 酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油 二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白 或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。在一方面，本发明表征了生产异戊二烯的方法，例如使用在此所述的任何细胞 生产异戊二烯的方法。在一些实施方式中，该方法包括在足以生产大于约400纳摩尔/ gw。m/hr的异戊二烯的条件下，培养细胞。在一些实施方式中，该方法也包括回收由该细 胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括纯化由该细胞生产的异戊二烯。在 一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码 异戊二烯合酶多肽和Gi)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞 在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、 乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂 类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量 碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前 述两种或更多种的任一组合。在一方面，本发明表征了生产异戊二烯的方法，例如使用在此所述的任何细胞 生产异戊二烯的方法。在一些实施方式中，该方法包括在使得异戊二烯的平均体积生产 力大于约0.1mg/L±if#a/hr的条件下，培养细胞。在一些实施方式中，该方法包括在使得 异戊二烯的峰值体积生产力大于约0.5mg/L±if#a/hr的条件下，培养细胞。在一些实施 方式中，该方法也包括回收由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括 纯化由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一 些实施方式中，该细胞具有G)编码异戊二烯合酶多肽和Gi)有效地连接到启动子的异源 核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如木糖或葡萄糖)，乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、 动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、 可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取 物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。在一些实施方式中，该方法包括在足以将细胞培养基中大于约0.002%的碳转化 成异戊二烯的条件下，培养细胞。在一些实施方式中，该方法也包括回收由该细胞生产 的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括纯化由该细胞生产的异戊二烯。在一些实 施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，该细胞具有ω编码异戊二 烯合酶多肽和(ω有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括 碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐 /酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷 脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、 多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或 更多种的任一组合。在本发明任何方面的一些实施方式中，培养细胞以大于或约400、500、 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000、10,000、12,500、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、125,000、 150,000、188,000，或更多纳摩尔/gwem/hr的异戊二烯来生产异戊二烯。在一些实施方式 中，培养细胞具有异戊二烯的平均体积生产力为大于或约0.1、1.0、10、25、50、100、 150、 200、 250、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1,000、 1100、 1200、 1300、 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500，或更 多mg的异戊二烯/L#_/hr(mg/L#_/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养 基的体积)。在一些实施方式中，培养细胞具有异戊二烯的峰值体积生产力高于或约 0.5、 1.0、 10、 25、 50、 100、 150、 200、 250、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, 3,750, 4,000, 4,250, 4,500, 4,750, 5,000, 5,250, 5,500, 5,750, 6,000, 6,250, 6,500, 6,750, 7,000, 7,250, 7,500, 7,750, 8,000, 8,250, 8,500、8,750、9,000、9,250、9,500、9,750、10,000、12,500、15,000，或更多 mg 的异戊 二烯/L的培养液/hr(mg/L_a/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。 在本发明任何方面的一些实施方式中，培养细胞将在细胞培养基中以大于或约0.002、 0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、 0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.2、2.4、2.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、 10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、 23.2、23.4、23.6、23.8、24.0、25.0、30.0、31.0、32.0、33.0、35.0、37.5、40.0、45.0、 47.5、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0、85.0、90.0 摩尔％，或更多的碳转化成 异戊二烯。在本发明任何方面的一些实施方式中，培养细胞以基于细胞湿重/hr(ng/gw。m/ h)计，大于或约 1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、 100,000，或更多ng的异戊二烯/克细胞来生产异戊二烯。在本发明任何方面的一些 实施方式中，培养细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、 500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、 5,000、10,000、50,000、100,000，或更多mg的异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液 的体积包括细胞和细胞培养基的体积)来生产累积滴定度(总量)的异戊二烯。在此公 开了其他示例性的异戊二烯生产速率和异戊二烯生产总量。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码IDI多肽的异源核酸。在 本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码IDI多肽的内源核酸拷贝的插入。在 本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码DXS多肽的异源核酸。在本发明任 何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码DXS多肽的内源核酸拷贝的插入。在本发明 任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种核酸。 在本发明任何方面的一些实施方式中，一种核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS 多肽。在本发明任何方面的一些实施方式中，一种载体编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽 和DXS多肽。在本发明一些实施方式中，载体包括选择标记，如抗生素抗性核酸。在本发明任何方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接T7启 动子，例如在中或高拷贝质粒中含有的T7启动子。在本发明任何方面的一些实施方式 中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接Trc启动子，例如在中或高拷贝质粒中含有的Trc启 动子。在本发明任何方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接Lac启动 子，例如在低拷贝质粒中含有的Lac启动子。在本发明任何方面的一些实施方式中，异 源异戊二烯合酶核酸有效连接内源启动子，例如内源性碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一 些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸整合到不带选择性标记的细胞的染色体中。在本发明任何方面的一些实施方式中，至少一部分细胞在连续培养(如未稀释 的连续培养)中维持异源异戊二烯合酶核酸至少或约5、10、20、40、50、60、65或更多 的细胞分裂。在本发明任何方面的一些实施方式中，包括异戊二烯合酶、IDI或DXS核 酸的核酸也包括选择性标记，例如抗生素抗性核酸。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码MVA途径多肽(例如来 自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisi)、马氏甲烧八叠球菌(Methanosarcina mazei)、或粪肠 球菌(Enterococcus faecalis)的MVA途径多肽)的异源核酸。在本发明任何方面的一些
实施方式中，细胞还包括编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母、马氏甲烷八叠球菌、 或粪肠球菌的MVA途径多肽)的内源核酸拷贝的插入。在本发明任何方面的一些实施方 式中，细胞包括异戊二烯合酶、DXS和MVA途径核酸。在本发明任何方面的一些实施 方式中，细胞包括异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和MVA途径核酸(除了 IDI 核酸以外)。在本发明任何方面的一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是天然发生的多肽， 其来自植物如葛属(Pueraria)(例如，葛麻姆(Pueraria montana))、或杨(Populus)(如 Populus tremuloides,银白杨(Ralba)，黑杨(Populus nigra), Populus trichocarpa,或银白
杨欧洲山杨的杂交品种)。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞是细菌细胞，如革兰氏阳性细菌细胞(例如芽孢杆菌细胞如枯草杆菌(Bacillus subtilis)细胞或链霉菌(Streptomyces)细胞 如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、天 蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor) > 白色链霉菌(Streptomyces albus)、或灰色链霉菌 (Streptomyces griseus)细胞)。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞是革兰氏阴 性细菌细胞(例如埃希氏菌(Escherichia)细胞如大肠杆菌细胞或泛菌(Pantoea)细胞如 柠檬泛菌(Pantoea citrea)细胞)。在一些实施方式中，大肠杆菌细胞是大肠杆菌FadR atoC突变细胞。在一些实施方式中，大肠杆菌细胞表达(例如组成型表达)ybhE(也称 作pgl)。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞是真菌细胞如丝状真菌细胞(例如 木霉属(Trichoderma)细胞如里氏木霉(Trichodermareesei)细胞或曲霉(Aspergillus)细 胞如米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillusniger)或酵母细胞(如耶氏酵母属 (Yarrowia)细胞如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞)。在本发明任何方面的一些实施方式中，微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的 一或多种多肽。在本发明任何方面的一些实施方式中，植物多肽碳源包括来自大豆、玉 米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄 榄、红花、芝麻、或亚麻籽的一或多种多肽。在一方面，本发明提供包含聚异戊二烯的轮胎。在一些实施方式中，该聚异戊 二烯是由ω聚合来自在此所述的任一组合物或方法的异戊二烯或(ω聚合由在此所述 的任一组合物或方法回收的异戊二烯所生产的。在一些实施方式中，聚异戊二烯包含顺 式-1，4-聚异戊二烯。在一方面，本发明表征了由任何的本发明组合物或方法所生产的产物(例如轮 胎)。应理解的是，可组合在此所述的多种实施方式的一个、多个或全部特性以形成 本发明的其它实施方式。本发明的这些以及其他方面对于本领域技术人员是显而易见 的。附图简要说明图1是用于在大肠杆菌中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的核苷酸 序列(SEQ ID NO: 1)。atg起始密码子为斜体，终止密码子为粗体而添加的PstI位点有 下划线。图2 是 pTrcKudzu 的图谱。图3是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)。RBS有下划线，野葛异戊
二烯合酶起始密码子为粗体大写字母而终止密码子为粗体、大写、斜体字母。载体骨架 是 pTrcHis2B。图 4 是 pETNHisKudzu 的图谱。图5 是 pETNHisKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)。图6 是 pCL-lac-Kudzu 的图谱。图7 是 pCL-lac-Kudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 7)。图8A是示出在没有载体的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯生产的图。图8B是示出在具有pCL-lac-Kudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯生产的图。
图8C是示出在具有pTrcKudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯生产的图。图8D是示出在具有pETN-HisKudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯生产的图。图9A是示出在14升补料分批发酵中大肠杆菌BL21/pTrcKudZu随发酵进程的
OD的图。图9B是示出在14升补料分批发酵中大肠杆菌BL21/pTrcKudZu随发酵进程的异
戊二烯生产的图。图IOA是示出在柠檬泛菌中的异戊二烯生产的图。对照细胞没有重组野葛异戊 二烯合酶。灰色菱形表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD_。图IOB是示出在表达pCL-lac Kudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的生产的图。灰色
菱形表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD_。图IOC是示出在表达pTrcKudzu的柠檬泛菌中的异戊二烯生产的图。灰色菱形
表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD_。图11是示出在表达重组异戊二烯合酶的枯草杆菌中的异戊二烯生产的图。 BG3594comK是没有质粒的枯草杆菌菌株(天然异戊二烯生产)。CF443-BG3594comK 是具有pBSKudzu的枯草杆菌菌株(重组异戊二烯生产)。y_轴上的IS表示异戊二烯。图12 是 pBS Kudzu#2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 57)。图13是用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合酶的核苷酸序列 (SEQ ID NO 8)。图14是包含用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的 pTrex3g 图谱。图15 是载体 pSPZl (MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQ IDNO 11)。图16是用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的合成的野葛(葛麻姆)异戊二烯 基因的核苷酸序列(SEQ ID NO: 12)。图17是合成的杂交杨(银白杨χ欧洲山杨)异戊二烯合酶基因的核苷酸序列 (SEQ ID NO 13)。ATG起始密码子为粗体而终止密码子有下划线。图18A示出描绘载体pYLAl、ρYLl和pYL2的构建的示意图。图18B示出描绘载体pYLA(POPl)的构建的示意图。图18C示出描绘载体pYLA(KZl)的构建的示意图。图18D示出描绘载体pYLl (KZl)的构建的示意图。图18E示出描绘载体pYLI(MAP29)的构建的示意图。图18F示出描绘载体pYLA(MAP29)的构建的示意图。图19A示出异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(根据F.Bouvier等人，Progress in Lipid Res.44 357-429，2005)。下面的描述包括对于途径中每种多肽的替代名称以及公 开有用于测量所示多肽活性的检测法的参考(这些参考各在此通过整体引用作为参考， 特别是对于在MVA和DXP途径中的多肽的多肽活性检测法)。甲羟戊酸途径AACT ； 乙酰基-CoA 乙酰基转移酶，MvaE，EC 2.3.1.9.Assay J.Bacteriol.，184 2116-2122, 2002 ； HMGS ；羟甲基戊二酰基-CoA 合成酶，MvaS，EC 2.3.3.lO.Assay I Bacteriol., 184 4065-4070, 2002 ； HMGR ； 3-羟基-3-甲基戊 二酰基-CoA 还原酶，MvaE,EC 1.1.1.34.Assay I Bacteriol.，184 2116-2122，2002 ； MVK ；甲羟戊酸激酶，ERG 12，EC 2.7.1.36.Assay Curr Genet 19 9-14, 1991.PMK ；磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8， EC 2.7.4.2，Assay Mol Cell Biol.，11 620-631, 1991 ； DPMDC ； 二磷酸甲羟戊酸 脱羧酶，MVD1，BC4.1.1.33.Assay Biochemistry, 33: 13355-13362，1994 ； IDI ； 异戊烯二磷酸 δ 异构酶，IDI1, EC 5.3.3.2.Assay I Biol.Chem.264 19169-19175， 1989。DXP 途径DXS ； 1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，BC 2.2.1.7.Assay PNAS, 94: 12857-62，1997 ； DXR ； 1_ 脱氧 _D_ 木酮糖 _5_ 磷酸还原异构酶，dxr，BC 2.2.1.7.Assay Eur.I Biochem.269 4446-4457，2002 ； MCT ； 4- 二磷酸胞苷-2-C-甲 基-D 赤藓糖醇合酶，IspD, EC 2.7.7.60.Assay PNAS, 97: 6451-6456，2000 ； CMK ； 4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D 赤藓糖醇激酶，IspE, BC 2.7.1.148.Assay PNAS, 97 1062-1067，2000 ； MCS ； 2C-甲基 _D_ 赤藓糖醇 2，4-环 二磷酸合酶，IspF，BC 4.6.1.12.Assay PNAS, 96: 11758-11763，1999 ； HDS ； 1_ 羟基 _2_ 甲基-2-(E) - 丁 烯基-4-二磷酸合酶，ispG，EC1.17.4.3.Assay I Org.Chem.，70 9168-9174, 2005 ； HDR ； 1-羟基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基-4- 二磷酸还原酶，IspH, BC 1.17丄2.Assay JACS, 126 12847-12855，2004。图19B说明了经典的和改良的MVA途径。1，乙酰-CoA乙酰基转移酶 (AACT) ； 2，HMG-CoA 合酶(HMGS) ； 3，HMG-CoA 还原酶(HMGR) ； 4，甲羟戊 酸激酶(MVK) ； 5，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK) ； 6，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或 DPMDC) ； 7，异戊烯基二磷酸异构酶(IDI) ； 8，磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC) ； 9，异 戊烯基磷酸激酶(IPK)。经典MVA途径从反应1开始，通过反应5和6至反应7来进 行，而改良MVA途径经反应8和9至反应7。结构式中的P和PP分别是磷酸和焦磷酸。 这一图取自 Koga 和 Morii，Microbiology and Mol.Biology Reviews, 71 97-120, 2007， 其在此通过整体引用作为参考，特别是对于改良MVA途径的核酸和多肽。改良MVA途 径例如存在于诸如马氏甲烷八叠球菌的一些古生物中。图20示出表示由没有(左)或具有(右)野葛异戊二烯合酶基因的重组解脂耶 氏酵母菌株生产的异戊二烯的GC-MS分析结果的图。箭头表示真正的异戊二烯标准的 洗脱时间。图 21 是 pTrcKudzu yIDI DXS Kan 的图谱。 图 22 是 pTrcKudzu yIDI DXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 20)。图23A是示出在BL21/pTrcKudzukan中从葡萄糖生产异戊二烯的图。时间0是 以IPTG (400 μ mol)诱导的时间。χ轴是诱导后的时间；y轴是OD6tltl并且y2轴是异戊二 烯的总生产力(yg/L顶空或比生产力(yg/L顶空/OD)。菱形表示OD_，圆圈表示总 异戊二烯生产力(yg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(yg/L/OD)。图23B是示出在BL21/pTrcKudzuyIDIkan中从葡萄糖生产的异戊二烯的图。时 间0是以IPTG (400 μ mol)诱导的时间。χ轴是诱导后的时间；y轴是OD6tltl并且y2轴是 异戊二烯的总生产力(μ g/L顶空或比生产力(μ g/L顶空/OD)。菱形表示OD_，圆圈 表示总异戊二烯生产力(yg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(yg/L/OD)。图23C是示出在BL21/pTrcKudzuDXSkan中从葡萄糖生产的异戊二烯的图。时 间O是以IPTG (400 μ mol)诱导的时间。χ轴是诱导后的时间；y轴是OD6tltl并且y2轴是异戊二烯的总生产力(yg/L顶空或比生产力(yg/L顶空/0D)。菱形表示OD_，圆圈 表示总异戊二烯生产力(yg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(yg/L/OD)。图23D是 示出在BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中从葡萄糖生产的异戊二烯的 图。时间0是以IPTG (400 μ mol)诱导的时间。χ轴是诱导后的时间；y轴是OD_并且y2 轴是异戊二烯的总生产力(yg/L顶空或比生产力(yg/L顶空/OD)。菱形表示OD6。。， 圆圈表示总异戊二烯生产力(yg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(yg/L/OD)。图23E是示出在BL21/pCL PTrcKudzu中从葡萄糖生产异戊二烯的图。时间0 是以IPTG(400ymOl)诱导的时间。χ轴是诱导后的时间；y轴是OD6tltl并且y2轴是异戊 二烯的总生产力(yg/L顶空或比生产力(yg/L顶空/OD)。菱形表示OD_，圆圈表示 总异戊二烯生产力(yg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(yg/L/OD)。图23F是示出在BL21/pCL PTrcKudzuyIDI中从葡萄糖生产异戊二烯的图。时 间0是以IPTG (400 μ mol)诱导的时间。χ轴是诱导后的时间；y轴是OD6tltl并且y2轴是 异戊二烯的总生产力(μ g/L顶空或比生产力(μ g/L顶空/OD)。菱形表示OD_，圆圈 表示总异戊二烯生产力(yg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(yg/L/OD)。图23G是示出在BL21/pCL PTrcKudzu DXS中从葡萄糖生产异戊二烯的图。时 间O是以IPTG (400 μ mol)诱导的时间。χ轴是诱导后的时间；y轴是OD6tltl并且y2轴是 异戊二烯的总生产力(μ g/L顶空或比生产力(μ g/L顶空/OD)。菱形表示OD_，圆圈 表示总异戊二烯生产力(yg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(yg/L/OD)。图23H是示出在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中从葡萄糖生产的异戊二烯的图。 时间O是以IPTG (400 μ mol)诱导的时间。χ轴是诱导后的时间；y轴是OD6tltl并且y2轴 是异戊二烯的总生产力(μ g/L顶空或比生产力(μ g/L顶空/OD)。黑色菱形表示OD600, 黑色三角表示总异戊二烯生产力(μ g/L)而白色方块表示异戊二烯的比生产力(μ g/L/ OD)。图24 是 pTrcKKDylkIS kan 的图谱。图 25 是 pTrcKKDylkIS kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 33)。图 26 是 pCL PtrcUpperPathway 的图谱。图 27 是 pCL PtrcUpperPathway 的核苷酸序列(SEQ ID NO 46)。图28示出含有下游MVA途径和用于整合到枯草杆菌染色体nprE座位的酵母idi 的表达盒的图谱。nprE上游/下游表示来自nprE位点用于整合的各Ikb序列。aprE启 动子(碱性丝氨酸蛋白酶启动子)表示aprE基因的启动子(-35，-10，+1转录起始位 点，RBS)。MVKl表示酵母甲羟戊酸激酶基因。RBS-PMK表示具有起始位点的芽孢 杆菌RBS上游的酵母磷酸甲羟戊酸激酶基因。RBS-MPD表示具有起始位点上游的芽孢 杆菌PBS的酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因。RBS-IDI表示具有起始位点上游的芽孢杆 菌RBS的酵母idi基因。终止子表示来自解淀粉芽孢杆菌(B.amyliquefaciens)的终止子 碱性丝氨酸蛋白酶转录终止子。SpecR表示壮观霉素抗性标记。“用于扩增的nprE上游 重复”表示用于扩增的上游区域的直接重复。图29是含有下游MVA途径和用于整合到枯草杆菌染色体nprE座位的酵母idi的 表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO 47)。图3O 是 p9796_poplar 的图谱。
图31 是 p9796-poplar 的核苷酸序列(SEQ ID NO 48)。图32 是 pTrcPoplar 的图谱。图33 是 pTrcPoplar 的核苷酸序列(SEQ ID NO 49)。图 34 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的图谱。 图 35 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 50)。图36 是 pTrcKudzuDXS Kan 的图谱。图37 是 pTrcKudzuDXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 51)。图38 是 pCL PTrcKudzu 的图谱。图39 是 pCL PTrcKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 52)。图40 是 pCL PTrcKudzu A3 的图谱。图41 是 pCL PTrcKudzu A3 的核苷酸序列(SEQ ID NO 53)。图42 是 pCL PTrcKudzu yIDI 的图谱。图 43 是 pCL PTrcKudzu yIDI 的核苷酸序列(SEQ ID NO 54)。图44 是 pCL PTrcKudzu DXS 的图谱。图 45 是 pCL PTrcKudzu DXS 的核苷酸序列(SEQ ID NO 55)。图46示出表示从生物质原料生产异戊二烯的图。小图A示出来自玉米秸秆的异 戊二烯生产，小图B示出来自甘蔗渣的异戊二烯生产，小图C示出来自软木材木浆的异 戊二烯生产，小图D示出来自葡萄糖的异戊二烯生产，和小图E示出来自没有添加原料 的细胞的异戊二烯生产。灰色方块表示在接种后的指定时间处，对培养物的OD6tltl测量 而黑色三角表示在接种后的指定时间的异戊二烯生产。图47示出表示在没有添加葡萄糖的培养物中由BL21 ( λ DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)生产的异戊二烯的图。方块表示OD6tltl,而三角表示所生产的异戊二烯(μ g/ ml)。图47B 示出表示由 BL21 ( λ DE3)pTrcKudzu yIDI DXS (kan)从 1 %葡萄糖原料转
化糖生产的异戊二烯的图。方块表示OD_，而三角表示所生产的异戊二烯(μ g/ml)。图47C 示出表示由 BL21 ( λ DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)从 1 % 转化糖原料生 产的异戊二烯的图。方块表示OD_，而三角表示所生产的异戊二烯(μ g/ml)。图 47D 示出表示由 BL21 ( λ DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)从 1 % AFEX 玉米秸
秆原料生产的异戊二烯的图。方块表示OD·，而三角表示所生产的异戊二烯(μ g/ml)。图48示出表明酵母提取物对异戊二烯生产的影响的图。小图A示出在供给不同 量的酵母提取物的发酵罐中光密度的时间进程。小图B示出在供给不同量的酵母提取物 的发酵罐中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯 的量。小图C示出酵母提取物对在生长于补料分批培养物中的大肠杆菌中异戊二烯生产 的影响。图49示出表明在500L生物反应器中含有pTrcKudzu和yIDI和DXS质粒的大
肠杆菌细胞生产异戊二烯的图。小 图A示出在供应葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反 应器中的光密度的时间进程。小图B示出在小图葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反应 器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。 小图C示出从供应葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。图 50 是 pJMupperpathway2 的图谱。图 51 是 pJMupperpathway2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 56)。图52 是 pBS Kudzu#2 的图谱。图53A是示出在14升补料 分批发酵中表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌发 酵时间期间的生长。黑色菱形表示没有重组异戊二烯合酶(天然异戊二烯生产)的对照 菌株(BG3594comK)而灰色三角表示具有pBSKudzu(重组异戊二烯生产)的芽孢杆菌。图53B是示出在14升补料分批发酵中表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌发 酵时间期间的异戊二烯生产。黑色菱形表示没有重组异戊二烯合酶(天然异戊二烯生产) 的对照菌株(BG3594comK)而灰色三角表示具有pBSKudzu(重组异戊二烯生产)的芽孢 杆菌。图54 是质粒 pET24P.alba HGS 的图谱。图55A 和 55B 是质粒 pET24P.alba HGS 的核苷酸序列(SEQ IDNO 87)。图56是示出用于内切核酸酶消化以构建质粒EWL230的限制性位点以及在 BspHI和NcoI位点之间的相容性粘性末端的示意图。图57是质粒EWL230的图谱。图58A和58B是质粒EWL230的核苷酸序列(SEQ ID NO 88)。图59是示出用于内切核酸酶消化以构建质粒EWL244的限制性位点以及在NsiI 和PstI位点之间的相容性粘性末端的示意图。图60是EWL244的图谱。图61A和61B是质粒EWL244的核苷酸序列(SEQ ID NO 89)。图62是质粒MCM484-487的图谱。图63A-63C 是质粒 MCM484 的核苷酸序列(SEQ ID NO 90)。图64A-64C 是质粒 MCM485 的核苷酸序列(SEQ ID NO 91)。图65A-65C 是质粒 MCM486 的核苷酸序列(SEQ ID NO 92)。图66A-66C 是质粒 MCM487 的核苷酸序列(SEQ ID NO 93)。图67A-67D是表达MVA途径的基因并且在以15_L规模的没有酵母提取物供料 的补料分批培养中生长的大肠杆菌菌株(EWL256)的异戊二烯生产图。图67A示出在供 料葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。图67B示出在供料葡萄糖的15-L生 物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯 的量。图67C示出从供料葡萄糖的15-L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。图 67D示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中的总二氧化碳进化率(TCER)、或代谢活性
■i並 曰O图68A-68E是表达MVA途径的基因并且在以15_L规模的具有酵母提取物供料 的补料分批培养中生长的大肠杆菌菌株(EWL256)的异戊二烯生产图。图68A示出在供 料葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。图68B示出在供料葡萄糖的15-L生 物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯 的量。图68C示出从供料葡萄糖的15-L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。图 68D示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中的体积生产力。在40小时期间(23-63小时)维持平均值为l.lg/L/hr的酵母提取物加料。图68E示出在供料葡萄糖的15-L生物 反应器中的二氧化碳进化率(TCER)、或代谢活性谱。 图69A-69D示出从不同碳源通过MVA(途径)的异戊二烯生产。图69A示出 含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌EWL256在葡萄糖、生物量水解物、丙三醇或 乙酸盐/酯作为唯一碳源上的生长。在培养基中添加不同碳源至浓度为1%。包括没有 添加碳源的阴性对照。以600nM处的光密度测量生长。图69B示出含有MVA途径和异 戊二烯合酶的大肠杆菌EWL256在葡萄糖、生物量水解物、丙三醇或乙酸盐/酯作为唯一 碳源上生长时的异戊二烯比生产力。在培养基中添加不同碳源至浓度为1%。包括没有 添加碳源的阴性对照。接种后190分钟、255分钟和317分钟取样并使用GC-MS测量细 菌生产的异戊二烯。图69C示出大肠杆菌EWL256在葡萄糖或木糖作为唯一碳源上的生 长。在培养基中添加不同碳源至浓度为1%。包括没有添加碳源的阴性对照。生长测量 为600nM下的光密度。图69D示出大肠杆菌EWL256在葡萄糖或木糖作为唯一碳源上 生长的比生产力。在培养基中添加碳源至浓度为1%。包括没有添加碳源的阴性对照。 接种后260分钟、322分钟和383分钟取样并使用GC_MS测量细菌生产的异戊二烯。图70A和70B示出由大肠杆菌菌株分别从葡萄糖和脂肪酸的异戊二烯生产。对 于图70A，挑取11个来自用具有下游甲羟戊酸途径的质粒pMCMl 18转化WW4的菌落来 验证下游途径的存在。在含有0.1 %酵母提取物和2 %葡萄糖的TM3培养基中培养来自这 些菌落的细胞。在诱导4小时后检测等份诱导培养物的异戊二烯生产。所有菌落都示出 了异戊二烯生产。诱导物IPTG具有强的生长抑制作用，这可见于由50至900uM浓度的 诱导物得到3至4.6倍降低的细胞密度(数据未示出)。该图示出较高诱导，导致较高的 异戊二烯比滴定度。对于图70B，生产培养物是由以1至10倍稀释的冲洗后的过夜培养 物接种。培养物生长若干小时并用50UMIPTG诱导。左栏示出诱导4小时后紧接着1小 时异戊二烯累积检测的异戊二烯检测结果。中栏示出对于相同培养物用相同诱导时间， 但分析12小时异戊二烯积累检测的1小时归一化数值。右栏示出诱导1小时的培养物的 1小时异戊二烯累积检测的数值。图71是用于从野葛克隆异戊二烯合酶的大肠杆菌_链霉菌(Streptomyces)穿梭 载体pUWL201PW(6400bp)的图谱。Tsr，硫链丝菌肽抗性基因。图片取自Doumith等 人，Mol.Gen.Genet.264 477-485，2000。图72示出由白色链霉菌(Streptomyces albus)野生型菌株(“wt” )和带有质粒 PUWL201PW (阴性对照)或pUWL201_iso(编码来自野葛的异戊二烯合酶)的菌株的异 戊二烯形成。图73A是马氏甲烷八叠球菌古细菌的Lower Pathway操纵子的图谱。图73B和73C是马氏甲烷八叠球菌古细菌的Lower Pathway操纵子的核苷酸序列 (SEQ ID NO 113)。图74A是来自马氏甲烷八叠球菌古细菌的Lowerin pET200D的MCM376-MVK图谱。图74B和74C是来自马氏甲烷八叠球菌古细菌的Lowerin pET200D的 MCM376-MVK 的核苷酸序列(SEQ ID NO 114)。图75A-75D示出相比于RM11608-2，EWL256的异戊二烯生产的生长和比生产力。白色菱形表示生长(OD550)；实心条表示异戊二烯的比生产力。χ-轴是以200(图 75A和75B)或400(图75C和75D)uMIPTG诱导后的时间(小时)。Y_1轴是异戊二烯 的生产力(ug/L/OD/hr)而Y-2是波长为550处的光密度的任意单位。对于OD55tl的这 些数值必须乘以6.66以获得培养物的实际OD。图76 是质粒 pBBRCMPGI1.5_pgl 的图谱。图77A 和 77B 是质粒 pBBRCMPGI1.5_pgl 的核苷酸序列(SEQ ID NO 122)。图78A-78F是由表达甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶和 PgKRHMl 11608-2)并且在15L规模的补料分批培养中生长的大肠杆菌菌株的异戊二烯 生产的图。图78A示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。图78B 示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升 发酵培养液生产的异戊二烯的量。计算异戊二烯的方法59hr中的累积异戊二烯生产， 在59hr时的g/发酵罐体积，L[ = ]g/L培养液。图78C也示出在供料葡萄糖的15-L生 物反应器中的异戊 二烯滴定度的时间进程。计算异戊二烯的方法/ (瞬时异戊二烯 生产速率，g/L/hr)dt，t = O至59小时[=]g/L培养液。图78D示出由供料葡萄糖的 15-L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。图78E示出在供料葡萄糖的15-L生物 反应器内的体积生产力。图78F示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器内的二氧化碳进化 率(CER)，或代谢活性谱。图79A是质粒pJ201 19813的图谱。图79B 和 79C 是 pJ201 19813 的核苷酸序列(SEQ ID NO 123)。发明详细说明本发明表征了生产增加量的异戊二烯的组合物和方法。特别地，这些组合物和 方法增加异戊二烯生产力并且增加生产的异戊二烯的总量。例如，制造了产生4.8xl04 纳摩尔/gwan/hr的异戊二烯的细胞培养体系(表1)。这些体系的效率被细胞从细胞培养 基所消耗的 23.6摩尔％产率(10.7重量％产率)的碳转化成异戊二烯(％碳产率)所阐 明。如实施例和表2所示，产生了每升培养液约60.5g异戊二烯。以1.88xl05nmol/OD/ hr(1.88xl05纳摩尔/gwem/hr)的峰值比速率生产异戊二烯。如果需要，可以使用其他条 件，如在此所述的那些，获得更大量的异戊二烯。在一些实施方式中，将可再生的碳源 用于异戊二烯的生产。本发明的组合物和方法是想要的，因为它们允许每细胞的高异戊 二烯产率，允许高碳产率、高异戊二烯纯度、高生产力、低能量利用、低生产成本和投 资、以及最小的副反应。这一用于异戊二烯生产的有效、大规模、生物合成工艺为合成 异戊二烯类橡胶提供了异戊二烯来源，并且为使用天然橡胶提供了期望的低成本替代。如下面进一步讨论，可以通过向细胞导入编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异 戊二烯合酶多肽)的异源核酸来显著增加由该细胞生产的异戊二烯量。异戊二烯合酶多 肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。如在实施例中所示，在诸如大肠 杆菌、柠檬泛菌、枯草杆菌、解脂耶氏酵母菌和里氏木霉的多种宿主细胞中表达异源葛 麻姆(Pueraria Montana)(野葛)或银白杨(杨)异戊二烯合酶多肽。如也在实施例中所 示，在诸如大肠杆菌的宿主细胞中表达异源马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)来增 加异戊二烯生产。所有这些细胞比没有异源异戊二烯合酶多肽的相应细胞生产出更多的 异戊二烯。如表1和2所示，使用在此所述的方法生产了大量的异戊二烯。例如，具有异源异戊二烯合酶核酸的枯草杆菌细胞在14升发酵罐中比没有异源核酸的相应对照枯草 杆菌细胞生产出高约10倍的异戊二烯(表2)。在发酵罐中由大肠杆菌生产出每升培养 液(mg/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)60.5g异戊二烯而由 枯草杆菌生产的是30mg/L，这表明可以产生相当量的异戊二烯(表2)。如果需要，可 以在更大规模生产异戊二烯或者可以使用在此所述的其他条件来进一步增加异戊二烯的 量。在下面以及在实施例部分中进一步详述表1和2所列出的载体以及实验条件。表1:使用本发明的细胞培养物和方法，从摇瓶生产异戊二烯的示例性产率。 用于测量异戊二烯生产的检测法描述于实施例I，第II部分。对于这一检测法，在一或多 个时间点从摇瓶取出样品并培养30分钟。然后测量这一样品中生产的异戊二烯量。表 1中列出了异戊二烯生产的顶空浓度和比速率，并且在此进一步描述。
权利要求
1.培养的细胞，其产生大于约400纳摩尔/gw。m/hr的异戊二烯。
2.培养的细胞，其具有大于约0.1mg/L±if#a/hr的异戊二烯平均体积生产力。
3.培养的细胞，其将细胞从细胞培养基中消耗的碳中大于约0.002摩尔百分数的碳转 化成异戊二烯。
4.培养的细胞，包括编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述细胞ω产生大于 约400纳摩尔/gw。m/hr的异戊二烯，(ii)将细胞从细胞培养基中消耗的碳中大于约0.002 摩尔百分数的碳转化成异戊二烯或Gii)具有大于约0.1mg/L#_/hr的异戊二烯平均体积 生产力。
5.培养的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中该异源核酸有效连 接启动子，并且其中所述细胞生产的异戊二烯大于约400纳摩尔/gw。m/hr。
6.培养的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中该异源核酸有效连 接启动子，并且其中所述细胞具有大于约0.1mg/L±if#a/hr的异戊二烯平均体积生产力。
7.培养的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中该异源核酸有效连 接启动子，并且其中所述细胞从细胞培养基中消耗的碳中大于约0.002摩尔百分数的碳被 转化成异戊二烯。
8.权利要求1、4和5任一项的细胞，其中所述细胞产生大于约4.0X IO3纳摩尔/gw。m/ hr的异戊二烯。
9.权利要求8的细胞，其中所述细胞产生大于约4.0X IO4纳摩尔/gw。m/hr的异戊二火布。
10.权利要求9的细胞，其中所述细胞产生大于约1.5X IO5纳摩尔/gw。m/hr的异戊二火布。
11.权利要求1、4和5任一项的细胞，其中所述细胞生产约400纳摩尔/gw。m/hr至约 2.0 X IO5纳摩尔/gw。m/hr的异戊二烯。
12.权利要求2、4和6任一项的细胞，其中所述细胞具有大于约100mg/L±iffW/hr的 异戊二烯平均体积生产力。
13.权利要求12的细胞，其中所述细胞具有大于约l,000mg/L±iffW/hr的异戊二烯平 均体积生产力。
14.权利要求13的细胞，其中所述细胞具有大于约l,500mg/L±iffW/hr的异戊二烯平 均体积生产力。
15.权利要求2、4和6任一项的细胞，其中所述细胞具有约0.1至约l,500mg/L±if#a /hr的异戊二烯平均体积生产力。
16.权利要求3、4和7任一项的细胞，其中所述细胞将大于约0.05摩尔百分数的碳转 化成异戊二烯。
17.权利要求16的细胞，其中所述细胞将大于约1摩尔百分数的碳转化成异戊二烯。
18.权利要求17的细胞，其中所述细胞将大于约10摩尔百分数的碳转化成异戊二火布。
19.权利要求18的细胞，其中所述细胞将大于约20摩尔百分数的碳转化成异戊二火布。
20.权利要求3、4和7任一项的细胞，其中所述细胞将约0.002至约25摩尔百分数的碳转化成异戊二烯。
21.权利要求4-7中任一项的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。
22.权利要求1-21中任一项的细胞，还包含编码IDI多肽的异源核酸。
23.权利要求1-22中任一项的细胞，还包含编码IDI多肽的内源核酸拷贝的插入。
24.权利要求1-23中任一项的细胞，还包含编码DXS多肽的异源核酸。
25.权利要求1-24中任一项的细胞，还包含编码DXS多肽的内源核酸拷贝的插入。
26.权利要求1-25中任一项的细胞，还包含编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种 核酸。
27.权利要求26的细胞，其中一种核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
28.权利要求27的细胞，其中一种质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
29.权利要求1-28中任一项的细胞，还包含编码MVA途径多肽的异源核酸。
30.权利要求29的细胞，其中所述MVA途径多肽是甲羟戊酸激酶(MVK)。
31.权利要求30的细胞，其中所述MVK是来自甲烷八叠球菌属的多肽。
32.权利要求31的细胞，其中所述MVK是来自马氏甲烷八叠球菌的多肽。
33.权利要求4-32中任一项的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是来自葛属的天然发 生的多肽。
34.权利要求33的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是来自葛麻姆的天然发生的多肽。
35.权利要求4-32中任一项的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是来自杨属的天然发 生的多肽。
36.权利要求35的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是来自银白杨的天然发生的多肽。
37.权利要求35和36中任一项的细胞，还包含编码MVA途径多肽的异源核酸。
38.权利要求37的细胞，其中所述MVK是来自甲烷八叠球菌属的多肽。
39.权利要求38的细胞，其中所述MVK是来自马氏甲烷八叠球菌的多肽。
40.权利要求1-39中任一项的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
41.权利要求40的细胞，其中所述细胞是革兰氏阳性细菌细胞。
42.权利要求41的细胞，其中所述细胞是芽孢杆菌属细胞。
43.权利要求42的细胞，其中所述细胞是枯草杆菌细胞。
44.权利要求40的细胞，其中所述细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
45.权利要求44的细胞，其中所述细胞是埃希氏菌属或泛菌属细胞。
46.权利要求45的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌或柠檬泛菌细胞。
47.权利要求1-39中任一项的细胞，其中所述细胞是真菌细胞。
48.权利要求47的细胞，其中所述细胞是木霉属细胞。
49.权利要求48的细胞，其中所述细胞是里氏木霉细胞。
50.权利要求47的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
51.权利要求50的细胞，其中所述细胞是耶氏酵母属细胞。
52.权利要求51的细胞，其中所述细胞是解脂耶氏酵母细胞。
53.一种生产异戊二烯的方法，该方法包括在足以生产大于约400纳摩尔/gw。m/hr的 异戊二烯的条件下培养细胞。
54.一种生产异戊二烯的方法，该方法包括在使得异戊二烯平均体积生产力大于约 0.1mg/L培_/hr的条件下培养细胞。
55.一种生产异戊二烯的方法，该方法包括在足以将细胞从细胞培养基中消耗的碳中 大于约0.002摩尔百分数的碳转化成异戊二烯的条件下培养细胞。
56.一种生产异戊二烯的方法，该方法包括培养细胞，所述细胞包含编码异戊二烯合 酶多肽的异源核酸，其中该异源核酸有效连接启动子，并且其中所述细胞生产的异戊二 烯大于约400纳摩尔/gw。m/hr。
57.—种生产异戊二烯的方法，该方法包括培养细胞，所述细胞包含编码异戊二烯 合酶多肽的异源核酸，其中该异源核酸有效连接启动子，并且其中所述细胞具有大于约 0.1mg/L±if#a/hr的异戊二烯平均体积生产力。
58.一种生产异戊二烯的方法，该方法包括培养细胞，所述细胞包含编码异戊二烯合 酶多肽的异源核酸，其中该异源核酸有效连接启动子，并且其中所述细胞从细胞培养基 中消耗的碳中大于约0.002摩尔百分数的碳被转化成异戊二烯。
59.一种生产异戊二烯的方法，该方法包括(a)在适于生产异戊二烯的培养条件下培养细胞，所述细胞包含编码异戊二烯合酶多 肽的异源核酸，其中所述细胞G)产生大于约400纳摩尔/gw。m/hr的异戊二烯；(ii)将细 胞从细胞培养基中消耗的碳中大于约0.002摩尔百分数的碳转化成异戊二烯，或(iii)具有 大于约0.1mg/L±if#a/hr异戊二烯的平均体积生产力，和(b)生产异戊二烯。
60.权利要求53、56和59中任一项的方法，其中所述细胞产生大于约4.0X IO3纳摩 尔/gw。m/hr的异戊二烯。
61.权利要求60的方法，其中所述细胞产生大于约4.0X IO4纳摩尔/gw。m/hr的异戊二火布。
62.权利要求61的方法，其中所述细胞产生大于约1.5X IO5纳摩尔/gwem/hr的异戊二火布。
63.权利要求53、56和59任一项的方法，其中所述细胞产生约400纳摩尔/gwem/hr 至约2.0 X IO5纳摩尔/gwem/hr的异戊二烯。
64.权利要求54、57和59任一项的方法，其中所述细胞具有大于约100mg/L培#a/hr 的异戊二烯平均体积生产力。
65.权利要求64的方法，其中所述细胞具有大于约l,000mg/L#_/hr的异戊二烯平 均体积生产力。
66.权利要求65的方法，其中所述细胞具有大于约l,500mg/L±iffW/hr的异戊二烯平 均体积生产力。
67.权利要求54、57和59任一项的方法，其中所述细胞具有约0.1至约l,500mg/L培 tw/hr的异戊二烯平均体积生产力。
68.权利要求55、58和59任一项的方法，其中所述细胞将大于约0.05摩尔百分数的 碳转化成异戊二烯。
69.权利要求68的方法，其中所述细胞将大于约1摩尔百分数的碳转化成异戊二烯。
70.权利要求69的方法，其中所述细胞将大于约10摩尔百分数的碳转化成异戊二火布。
71.权利要求70的方法，其中所述细胞将大于约20摩尔百分数的碳转化成异戊二火布。
72.权利要求55、58和59任一项的方法，其中所述细胞将约0.002至约25摩尔百分 数的碳转化成异戊二烯。
73.权利要求53-72中任一项的方法，还包括回收所述细胞产生的异戊二烯。
74.权利要求56-73中任一项的方法，其中所述异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合 酶多肽。
75.权利要求53-74中任一项的方法，其中所述细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。
76.权利要求53-75中任一项的方法，其中所述细胞还包含编码IDI多肽的内源核酸 拷贝的插入。
77.权利要求53-76中任一项的方法，其中所述细胞还包含编码DXS多肽的异源核酸。
78.权利要求53-77中任一项的方法，其中所述细胞还包含编码DXS多肽的内源核酸 拷贝的插入。
79.权利要求53-78中任一项的方法，其中所述细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽 的一种或多种核酸。
80.权利要求79的方法，其中一种核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
81.权利要求80的方法，其中一种质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
82.权利要求53-81中任一项的方法，其中所述细胞还包含编码MVA途径多肽的异源核酸。
83.权利要求82的细胞，其中所述MVA途径多肽是甲羟戊酸激酶(MVK)。
84.权利要求83的细胞，其中所述MVK是来自甲烷八叠球菌属的多肽。
85.权利要求84的细胞，其中所述MVK是来自马氏甲烷八叠球菌的多肽。
86.权利要求56-85中任一项的方法，其中所述异戊二烯合酶多肽是来自葛属的天然 发生的多肽。
87.权利要求86的方法，其中所述异戊二烯合酶多肽是来自葛麻姆的天然发生的多肽。
88.权利要求56-85中任一项的方法，其中所述异戊二烯合酶多肽是来自杨属的天然 发生的多肽。
89.权利要求88的方法，其中所述异戊二烯合酶多肽是来自银白杨的天然发生的多肽。
90.权利要求88和89中任一项的方法，还包括编码MVA途径多肽的异源核酸。
91.权利要求90的细胞，其中所述MVK是来自甲烷八叠球菌属的多肽。
92.权利要求91的细胞，其中所述MVK是来自马氏甲烷八叠球菌的多肽。
93.权利要求53-92中任一项的方法，其中所述细胞是细菌细胞。
94.权利要求93的方法，其中所述细胞是革兰氏阳性细菌细胞。
95.权利要求94的方法，其中所述细胞是芽孢杆菌属细胞。
96.权利要求95的方法，其中所述细胞是枯草杆菌细胞。
97.权利要求93的方法，其中所述细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
98.权利要求97的方法，其中所述细胞是埃希氏菌属或泛菌属细胞。
99.权利要求98的方法，其中所述细胞是大肠杆菌或柠檬泛菌细胞。
100.权利要求53-92中任一项的方法，其中所述细胞是真菌细胞。
101.权利要求100的方法，其中所述细胞是木霉属细胞。
102.权利要求100的方法，其中所述细胞是里氏木霉细胞。
103.权利要求100的方法，其中所述细胞是酵母细胞。
104.权利要求103的方法，其中所述细胞是耶氏酵母属细胞。
105.权利要求104的方法，其中所述细胞是解脂耶氏酵母细胞。
全文摘要
本发明描述了从培养的细胞生产异戊二烯的方法。本发明也提供了包含这些培养的细胞的组合物。
文档编号C12P5/02GK102027124SQ200880126504
公开日2011年4月20日 申请日期2008年12月15日 优先权日2007年12月13日
发明者A·S·普哈拉, A·尼尔森, A·米亚斯尼科夫, C·佩雷斯, F·J·费赫尔, F·瓦耳, G·K·肖塔尼, G·M·怀特德, J·C·麦考利夫, K·J·桑福德, M·塞尔温, M·米勒, R·J·拉杜卡, Z·贝克 申请人:丹尼斯科美国公司, 固特异轮胎和橡胶公司