无蛋白质配子和胚胎处理及培养基产品的制作方法

文档序号:532146阅读:463来源:国知局
专利名称:无蛋白质配子和胚胎处理及培养基产品的制作方法
技术领域
本发明涉及专门用于人类生殖和生育程序,并且针对该程序经过优化的无蛋白质 培养基(PFM)。本文中描述的基本上无蛋白质的培养基产品可用于防止结合于蛋白的病原 体(特别是朊病毒等)传播给正在接受不孕症治疗的患者、通过辅助生殖技术(ART)怀育 的新生儿、和这些领域的从业人士,特别涉及在人ART中的应用。
背景技术
用于人类ART程序(procedures)的传统市售胚胎培养基含有从人血液和组织来 源获得的人血清白蛋白(HAS)。在一些实验室中,也使用类似地从牛血液和组织来源获得 的牛血清白蛋白(BSA)作为人类胚胎培养程序中蛋白质的来源(Loutradis et al. , 1992 ; Quinn, 1994) 含有HSA和BSA的培养基的效力据报道是相似的(Staessen et al.,1998)。 在培养基中使用从供体(人类或牛)获得的蛋白质有将疾病传播给接受辅助怀孕治疗的患 者的潜在可能。近年来尚未有人描述过在化学限定的(没有添加的蛋白质或白蛋白、或动物 或人来源的蛋白提取物)培养系统中,从收集卵母细胞开始,随后进行精子冲洗(sperm washing)、授精、受孕到卵裂胚阶段,最后进行胚胎移植,产生活的人类胚胎的过程。尽管 近年来报道了用于小鼠、家兔和灵长类动物的化学限制培养基(Spindle,1995 ;Li et al., 1996 ;Schramm and Bavister,1996),。先前声称的用于人类的化学限定无蛋白质培养基 (PFM)实际上不是真的没有蛋白质,因为用于受精的精子仍然是在含有血清蛋白的培养 基中制备的(Mohr & Trounson,1986 ;Serta and Kiessling 1997 (Abst) ;Parinaud et al. 1999)。因此,迄今为止尚未描述过用于ART程序的完全无蛋白质的培养基。本领域中需要有用于产生活的早期分裂阶段的人类胚胎的化学限定培养基,以避 免使用潜在有危险的供体蛋白,保证正在进行辅助生殖治疗的患者的安全。人们对可能传 播病原性疾病(pathogenic disease),特别是病毒性疾病,例如人类获得性免疫缺陷综合 征(AIDS)和肝炎,或者由血源产物中的朊病毒等传播的Creutzfeldt-Jakob病(CJD)等的 担忧,已经促使全世界ART领域内的许多医疗服务供应商开始搜寻供体蛋白的替代物来用 于胚胎培养和处理程序。致死性病毒疾病(AIDS)通过血源产品对血友病患者的传播已经有大量的文献记 录(见例如 Craven et al. , 1997,Med. Sci. Law 37 215-227 ;Keshavjeeet al.,2001,Soc. Sci. Med. 53 1081-1094 ;Weinberg et al. ,2002, Ann.Intern. Med. 136312-319 ;Evatt, 2006,Semin. Hematol.型S4-9)。从垂体提取的人类生长激素已被发现能够向人体传播 CJD (Esmonde et al.,1994),并且人促性腺激素注射也能够在人与人之间传播CJD (CDC, 1985)。CJD可以通过血液传播(尽管CJD朊病毒的滴度在血液中较低;Heye et al.,1994)。 过去曾在大约200名IVF患者在接受了在含有被乙型病毒污染的混合血清(pooled sera) 的培养基中培养的胚胎后发生了乙型肝炎流行(van Os et al.,1991)。最近,科学界面临 着这样的难题,即必须通知他们的患者,用于胚胎培养和处理的市售培养基制剂可能被由 后来死于CJD的人捐献的白蛋白所污染(Kemmarm,1998)。
有大量报道在无蛋白质培养基中从受精卵和卵裂阶段育成了小鼠胚泡。最早的 报道包括Brinster (1965)和Cholewa and Whitten (1970),后者使用高分子量胶体聚乙烯 吡咯烷酮(PVP)作为润滑剂和用于增加培养基的粘度。该项工作之后,许多其它的工作者 在无蛋白质培养基中成功培养了小鼠以及其它哺乳动物胚胎(Dandekar and Glass, 1990 ; Spindle, 1995 ;Li et al. , 1996 ;Schramm and Bavister,1996)。近些年,除了 PVP 之外, 聚乙烯醇(PVA) (Bavister,1995)也被用于替代培养基中的血清蛋白质。例如,Biggers等 (1997)研究了用聚乙烯醇(PVA)和/或氨基酸代替牛血清白蛋白(BSA)对小鼠受精卵发育 的影响。他们评论到(observed),PVA不能完全代替小鼠胚胎培养基中的BSA。PVA对胚泡 发育速度的影响仅比BSA略低,但是部分孵化(partial hatching)的速度却显著降低。用 PVA代替BSA会降低整体响应,但不会导致大的干扰。除了其许多生物学作用之外,血清蛋白可带来许多有用的物理性质,例如培养基 的润滑和粘度。为了容易处理和操作胚胎并防止其附着于培养盘和胚胎移植导管(embryo transfer catheter)的壁上,需要增加培养基的润滑和粘度。PVP和PVA的加入仅仅是提 供与血清蛋白一样的物理属性。然而,PVP和PVA不是固定化氮的来源,并且它们也不执 行蛋白质的各种生物学作用。此外,PVP和PVA的致畸性质(teratological properties) 尚没有得到完全检查,使其在人类治疗性辅助生殖中的使用存在疑问(Gardner and Lane, 1998a)。一些研究人员已经尝试在无蛋白质培养系统中产生活的人类胚胎,最近的是 Serta等(1997)和Parinaud等(1998a)。然而,Serta与其合作者(1997)用于授精的精 子是通过沿BSA柱下游(swim-down)制备的(尽管随后的培养在无蛋白质培养基中进行)。 这些工作者实现了 31% (η = 45)的怀孕率,其中一些怀孕足月产下了正常后代。Parinaud 等(1998a)用在无蛋白质培养基中制备的精子进行受精,授精在相同的培养基中进行。然 而,得到的受精卵是在BMl培养基中培养的,尽管该参考文献没有详述其BMl培养基是否 含有蛋白质,但是该研究组的先前出版物提示,BMl培养基含有HSA(Parinaud et al., 1998b)。一些工作者已经显示,在小鼠和人类中,用单一的抗氧化剂和螯合剂例如EDTA代 替血清蛋白(Mehta and Kiessling, 1990 ;Serta et al.,1997)不会破坏受精和活胚胎 的分裂(cleavage)。然而,Serta等(1997)建议用无蛋白质培养基充分漂洗胚胎移植导 管,这暗示胚胎易于粘附到胚胎移植导管内壁。血清蛋白质还具有保持培养基PH的作用 (Moessner et al.,1993)。除了其作为生物系统中营养物的作用之外,蛋白质还具有许多 其它的作用,例如链断裂性抗氧化剂(chain-breaking antioxidant)和金属离子螯合剂 (Barber, 1961 ;Vidlakova et al.,1972 ;Wayner et al.,1987)。白蛋白和血浆蛋白的一般生理学功能已经有大量文献证明。白蛋白在防止膜过氧 化中的作用表明其在膜稳定性中具有直接的作用。它参与毛细管膜渗透性和渗透压调节。 白蛋白提供了血浆中总胶体渗透压的80%。白蛋白参与二氧化碳的运输并发挥pH缓冲剂 的作用;白蛋白占据血浆中非碳酸氢盐缓冲剂值的最大部分(95%)。蛋白质还作为能量的 来源。脱氨基的丙氨酸是丙酮酸盐,其可以被转化成乙酰-CoA或葡萄糖和糖原。白蛋白可 以辅助溶解脂质和运输激素、维生素和金属。它充当这些组分释放和使用的蓄池。因此,替换培养基中血清白蛋白的任何尝试都应当考虑到这些有用于在体外进行胚胎处理和操作的体内作用和物理性质。单一的组分不可能满足血清蛋白质的所有功能。尽管先前已经描述了支持大量动物物种发育的无蛋白质培养基,但是这些无蛋白 质培养基均没有成功地用于人类,也无法假定这些培养基可以支持或者人类胚胎发育或者 对于人类胚胎发育而言是最优的。因此,仍然非常需要有特别适用于人类ART和IVF的限 定的无蛋白质培养基。相关
背景技术
先前已知有用于处理和培养哺乳动物细胞,特别是来自啮齿类动物(小鼠、大鼠、 豚鼠等)的细胞的推定“无蛋白质”培养基,也可用于人类体外受精中的受精、胚胎发育和 妊娠。Caro等已经描述过一种这样的用于人类的“无蛋白质”培养基,然而它们不能克服 精子制备培养基对蛋白质的需要,因为蛋白质是诱导精子获能所需要的,没有它们,精子不 能获得穿透和/或使卵子受精的能力。因此,Caro与其合作者的培养基系统不是完全没有 蛋白质的。类似地,Serta等(1997 ;摘要)和Parinaud等(1998a,摘要;1999)也描述了 用于人类ART的“无蛋白质”培养基,但是他们与之前的Caro等(1986) —样,在其培养系 统的至少一个阶段内使用了蛋白质。如这些参考文献中描述的,用含有外加蛋白的培养基冲洗先前制备的精子不能完 全确信可除去污染的感染原,特别是病毒和朊病毒。此外,这也是不利的,因为它使精子经 历不必要的压力(stressful)清洗过程,并需要消耗多余的人力和资源。在例如下列文献中公开了与IVF无关的用于培养哺乳动物特别是人细胞 的“无蛋白质”培养基Κον Γ et al. , 1987, Biotechnology Letters, vol. 9no. 4, p. 259-264 “Iron Compounds at high Concentrations Enable Hybridoma Growth in a Protein-free Medium" ;Keen,1995, Cytotechnology, vol. 17 :193-202 “The culture of rat myeloma and rat hybridoma cells in a protein-free medium" ;Stoll et al., 1996, J. Biotechnology, vol. 45,p.111-123 "Systematic improvement of a chemically defined protein-free medium for hybridoma growthand monoclonal antibody production. ”。该工作具体地涉及单克隆抗体产生,而没有公开将这种培养基用于IVF 或ART用途。其它出版物公开了无蛋白质生长介质,但不适宜或适合于人类IVF程序,这 些出版物包括:Zang et al.,1995,Biotechnology, vol. 13,p. 389-392, "Production of Recombinant Proteins in Chinese Hamster Ovary Cells Using A Protein-Free Cell Culture Medium” ;和国际专利申请公开 no. WO 2005/120576A2。本发明概要本发明涉及新型无蛋白质培养基配方,其用于人类卵子获取(retrieval) (i. “冲 洗培养基”),精子操作和保存(ii. “配子处理培养基”),人类卵子受精(iii. “胚胎培养 培养基”),配子和胚胎处理(iv. “配子和胚胎操作培养基”),以及受精卵在培养条件下经 过1-2个分裂周期的发育(v.胚胎培养基),在使用ART程序治疗和减轻生育力低下和不 孕的人体应用中使用。本发明包括配制单一培养基溶液,该溶液能够代替(Mplace)上述 的所有新培养基溶液,和/或可以用作上述所有新培养基溶液的替换品(!^placement)/ 介质(medium)。本发明的基本上没有蛋白质的培养基与先前由相同发明人报道的无蛋白 质培养基(彼处称作ART-7和ART-7b系列)(Ali,1997 ;Ali et al.,2000)截然不同。在先前报道中,发明人描述了他们所进行的系统性研究,该研究导致他们配制出了三种前驱 (precursor)培养基,称作ART-1、ART-2和ART-3。在同一报道中,这些发明人描述了基本 上无蛋白质的培养基系列ART-7和ART-7b是如何从ART-I培养基演变而来的。通过在基 本上无蛋白质的ART-7和ART-7b培养基系列中进行胞质内精子注射(ICSI)产生的胚胎被 成功地用于治疗11/21名(52.4% )39岁以下的妇女,实现了临床妊娠。ART_1、ART_7和 ART-7b培养基系列的配方尚没有公开。本发明提供了基本上无蛋白质的培养基,其从前驱 ART-3培养基配制而来,但又与之不同。本发明人已经描述了前驱ART-3培养基的开发,但 没有描述其组成(Ali, 1997 ;Ali et al.,2000)。在本发明的举例实施方案中,具体公开了一系列基本上无蛋白质的培养基,这里 称作PFM-Il系列。这些培养基具有明确的优点,即成分均勻,没有潜在有危险的不均一的 (non-uniform)生物成分,这些不均勻生物成分可能危害配子和胚胎,并可能向正在进行 ART治疗的患者、通过这种治疗受孕的婴儿和参与ART治疗程序的卫生工作者传播目前已 知或者迄今未知的致死性疾病,该培养基符合管理体外受精技术和方法的严格的新标准和 规章。本发明基本上无蛋白质的培养基配方的完全被限定的性质,也使得它可以 用来帮助进行对胚胎植入前的胚胎代谢的研究。目前可用的胚胎培养基配方没有限 定,而且成分不均勻,阻碍了这方面的研究。使用连续超小液滴(cUMD) (continuous ultramicrodroplet)培养技术在这些基本上无蛋白质的培养基(PFM)中产生的第2天人 类胚胎的质量与在含有血清蛋白质的对照商业培养基配方中发育的胚胎相当或者更好。所 述PFM培养基对人类精子无毒。通过传统IVF和胞质内精子注射(ICSI)进行受精和随后 人类胚胎的发育与对照相当。本发明基本上无蛋白质的培养基还适用于基本上无蛋白质的人类胚胎培养 和操作培养基,并可保证不会向患者和新生儿传播蛋白质结合的疾病(protein-bound diseases)。本发明的基本上无蛋白质的培养基可以在-20°C冷冻保存长达2年,而不会损 失效力。本发明成功地克服了在培养系统中添加供体蛋白质的需要,并提供了用于人类 ART应用的基本上无蛋白质的培养基系统,所述人类ART应用使用基本上无蛋白质的培养 基产品,从卵子获取开始,经过精子制备、授精(insemination)、受精(fertilization)、所 得胚胎培养和胚胎移植。这个特征有利地将本发明的培养基与先前描述的“无蛋白质”培 养系统区分开,先前系统在程序的某些点上使用含有蛋白质的培养基产品,因此不是完全 无蛋白质的。结果,这些先前的培养基可能被感染原(infectious agent)污染,并可能面 临法规限制。在本文中提出了本发明的组成、范围、优选范围和各种成分的具体规格。本发明是通过研究能够在体内和体外部分代替蛋白质的各种作用的单个成 分(例如氨基酸、抗氧化剂和螯合剂、渗透物、维生素、营养物和替代能量源)的效果 (effect)、耐受性(tolerance);并确定它们的最佳水平而获得的;其例示了蛋白质在本发 明的没有供体血清蛋白质的各种无蛋白质操作培养基(例如精子和卵子操作培养基,和 ICSI培养基)和胚胎培养基中的作用。利用上述成分的最佳浓度配制多种胚胎培养基。随 后,鉴定了这些培养基中显示最佳胚胎发育和显著更高胚泡孵化率的培养基,并进一步优 化,以在不添加血清蛋白质的条件下支持人类胚胎发育。本发明基本上无蛋白质的培养基能够支持用在相同培养基中制备的精子对人类卵子授精。所得的配子随后在基本上无蛋白 质的培养基中发育形成活的早期卵裂阶段的人类胚胎。移植这些胚胎,可实现正常的妊娠 和活产。因此,本发明成功地提供了可用于整个IVF/ART程序(卵子获取、精子制备、播种、 授精、所得胚胎的培养和胚胎移植)的培养基,其克服了在培养系统中添加蛋白质的需要。本发明某些实施方案的详细说明本发明提供了一系列营养溶液,一般地称作胚胎操作培养基和培养培养基,其没 有任何蛋白质和类蛋白质成分。这些培养基可用于人类卵子的受精和随后受精卵在体外发 育达2-6天。这些营养溶液称作“胚胎培养培养基”。除了 IVF和ART之外,可有利地使用基 本上无蛋白质的营养生长培养基的其它方法和技术包括干细胞技术和治疗、细胞/组织再 生和移植治疗程序。技术人员可意识到如何将本文中所述培养基加以改造用于这些用途。如将在下面进一步详细公开的,通过将本发明的基本上无蛋白质的培养基用于人 类配子和胚胎,增加了 IVF和ART的效力。例如,使用基本上无蛋白质的培养基(PFM-Il) 进行常规IVF获得的临床怀孕率在所有年龄组中均增加到了 50% (14/28),而且在年龄低 于40岁的妇女中高达53. 8% (14/26);相比之下,目前可得的含蛋白质胚胎培养基对于组 合的所有年龄组仅有33%的怀孕率(如Ali,2004中所引述)。使用本发明基本上无蛋白 质培养基的ICSI临床怀孕率在所有年龄组中同样增加到46. 2% (12/26),在年龄低于40 的妇女中高达54. 5% (12/22)。该差异是统计学上显著的,其优势在本发明的基本上无蛋 白质的培养基一方,表明本发明的基本上无蛋白质的培养基至少等同于(并可能优于)目 前市场上可得的商业含蛋白质培养基。从通过常规IVF在PFM-Il培养基中产生的胚胎出 生的婴儿数量为12,而通过ICSI出生的婴儿数量为12。从在本发明PFM-Il中产生的胚胎 出生的婴儿外观正常、聪明、健谈并且活泼(根据父母报告)。这些统计数据从一个包含至 少24个这样出生的孩子的样本中产生。如这里所使用的,术语“无蛋白质”、“实质上无蛋白质”和“基本上无蛋白质”意图 表示所述培养基是用不含蛋白质的组分(如本文将更详细描述的)制备的,并且没有向培 养基中添加蛋白质或含蛋白质的组分。本发明的举例实施方案包括一系列基本上无蛋白质的培养基,称作PFM-Il系列。 这些培养基系列具有众多专门的培养基产品,即1.基本上无蛋白质的冲洗培养基2.基本上无蛋白质的配子(精子)操作培养基3.基本上无蛋白质的配子(卵母细胞/胚胎)操作培养基4.基本上无蛋白质的胚胎培养基这些培养基根据下文提出的方法加以使用,这些方法意图举例说明这些培养基的 用途,但并不限制这些培养基的任何其它用途,例如在本领域技术人员已知的IVF或ART方 法中的其它用途。在如这里提出的实验中开发本发明培养基时,每一个程序用常规的含蛋 白质培养基和本发明的举例PFM平行地进行。人类精子制备男性患者通过自慰产生人类精液。通过标准上游技术(swim-up technique)制备 精子,偶尔使用密度梯度离心。在密度梯度程序中,将回收的离心沉淀(pellet)清洗两次,并重新悬浮在培养基中。精子制备物用试验或对照培养基(视情况适宜)加以制备。具体 地说,在基本上无蛋白质的培养基(PFM-Il)中制备用于ICSI或IVF的精子,用于考察蛋白 缺乏对胚胎发育的影响的实验。收集的精子在5% CO2气氛下37°C温育,直到使用。卵巢刺激和卵母细胞获得通过皮下注射促性腺激素释放激素激动剂(Buserelin ;Suprefact ;Hoescht, Frankfurt,Germany)诱导卵巢刺激,从黄体中期开始,直到月经或者实现下调。当子宫内膜 厚度为4mm或更少,并且当血液雌二醇、黄体酮和LH水平达到基线值时,认为实现了下调。 注射促卵泡(follicle)激素(FSH ;Metrodin ;Serono, Rome, Italy)三天,以引发卵泡募集 (recruitment of follicles)。之后,根据患者的响应施用人绝经期促性腺激素(Pergonal 500 ;Serono, Rome, Italy),以刺激卵泡发育。在卵泡大小达到16mm或者更大后,通过注射 10,OOOIU人绒毛膜促性腺激素(hCG ;Pregnyl ;Organon,Oss,Holland)诱导排卵。36h后通 过超声引导阴道抽吸(ultrasound guided vaginal aspiration)进行卵母细胞抽取(OR)。授精和培养技术在经过平衡和胚胎测试的(equilibrated and embryo tested)矿物油(M8410, Sigma Chemicals, and USA)下,卵母细胞用在经平衡的培养培养基微液滴中100,000个/ mL的活动精子个别授精。受精的卵母细胞在含5% CO2的空气的气氛下37°C培养。第二天早 上,卵母细胞用剥露移液器(denuding pipettes) (Stripper ,MidAtlantic Diagnostics, USA)剥露。胞质内精子注射(ICSI)在一种可选择的程序中(用于例如克服人类男性因素生育率低下),执行ICSI。 通过暴露于透明质酸酶溶液 30 秒(80IU/mL ;Cat No. 10110010, Medi-Cult A/S, LerS0 Parkalle 42,2100 Copenhagen, Denmark)制备用于ICSI的卵母细胞,然后转移到平衡的 Medi-Cult 或本发明基本上无蛋白质的培养基中。将人类卵母细胞在含5% CO2的空气的 气相中于培养基中37°C温育5-7分钟,然后用剥露移液器(ART No. 1670, International Medical Products BV, Zutphen,Holland)剥露。将剥露的人卵母细胞清洗,并最终在培养 基中进一步温育30-60分钟。使用商业上可得的ICSI移液器进行显微操作(注射针头,Cat No. 130340B ;手持 移液器(holding pipette) ,Cat No. 13030013 ;Laboratoire CCD,60Rue Pierre Charron, 75008Paris, France 或注射针头,Cat. No. 10-MIC ;手持移液器,Cat. No. 10-MPH-120 ; Humagen, Charlottesville, Virginia 22911,USA)。 将 5yL PVP(Cat No. 1089001, Medi-Cult A/S,Denmark)超微液滴在一个培养皿(Cat No. 1006,Falcon Plastics,Becton Dickinson, Rutherford, New Jersey,07070, USA)的中心薄薄展开。将展开的 PVP 用最 多 5个 IOyL HEPES 缓冲的 IVF 培养基(Gamete-1009Scandinavian IVF Sciences AB, Gothenberg, Sweden)微液滴包围。将这些微液滴用经平衡和胚胎测试的矿物油(M8410, Sigma Chemicals,USA)覆盖。将精子制备物(HyL)加入到展开的PVP的中心。以常规 方式进行成熟卵母细胞的ICSI (例如,Palermo等,1992所述)。超微液滴培养在事先充满平衡矿物油的4孔培养皿中制备培养基的超微液滴(UMD ;1. 5-2 μ L 用于3-7个人类胚胎的培养)。将培养皿在含5% CO2的空气中37°C温育。在预备试验中(preliminary experiment),每天用精细拉制的巴斯德吸管(finely drawn out Pasteur pipette)用平衡的培养基更换培养基(UMD技术),但在后来的实验中则培养3天后才更换 (cUMD ;或连续 UMD)。受精的确定在ICSI或IVF后18h_20h确定受精。当可以见到两个迥然不同的原核时,认为卵 母细胞已经受精。将受精的卵母细胞在5% CO2气氛下在37°C平衡培养基的微液滴或超微 液滴中培养。在24h后评估分裂和胚胎质量。受精卵阻滞率(Zygote Arrest rate)这个参数用于确定本发明的培养培养基是否导致发育在一细胞期发生停滞。培养 基的效力可以用该测定方法加以确定。发育停滞于一细胞期的比例高,表明培养基有缺陷 或效力低。确定第二日分裂胚胎质量采用两个参数确定第二日胚胎的胚胎质量,也就是平均卵裂球得分和平均胚胎 等级。它们如下确定
(i) 平均卵裂球得分=卵裂球总数
胚胎总数
(ii) 平均胚胎等级=总胚胎等级
胚胎总数因为大多数健康的第二日人类胚胎一般会达到四细胞期,平均卵裂球得分为4或 者更高(范围在2-6)被认为是优秀的。胚胎根据1-4的级别进行分级,其中数字1表示质 量差,4表示质量优秀。胚胎根据至少3个(但优选地4个)实验人员的结果综合进行分 级。此外,还包含两个其它的参数用于确定卵裂期胚胎发育速率的差异。它们是在人类研 究中培养第二日(i)处于四细胞期或者更高阶段的胚胎的比例和(ii)等级为3或者更高 的胚胎的比例。培养基配方这里描述的一种作为示例的本发明的基本上无蛋白质的培养基的配方如下。白蛋 白,人们已经知道它是固定氮和营养物的来源,是一种抗氧化剂,还具有许多其它作用,包 括膜稳定化。因此,本发明地基本上无蛋白质的培养基用其它培养基组分代替白蛋白,这些 组分可以在培养中单独地或组合地发挥白蛋白的功能。用于这些目的的单个胚胎培养培养 基组分包括氨基酸(包括但不仅限于丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰 胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、牛磺酸、苏氨酸、色氨 酸、酪氨酸、缬氨酸、丝氨酸)、抗氧化剂和螯合剂(例如EDTA、还原性谷胱甘肽、生育酚)、替 代能量源(例如果糖、谷氨酰胺、丙酮酸钠)、渗透质(包括甘露醇和肌醇)、维生素(抗坏 血酸、氰钴维生素、叶酸、生育酚等)和元素铁。各个组分的支持最高卵泡发育的浓度被认为是最佳的。在本发明的研发过程 中制备了三种培养基(ART-1、ART-2和ART-3)。本发明人先前描述了为了从培养培养基 ART-I (Ali,1997 ;Ali et al. ,2000)配制基本上无蛋白质培养基ART-7和ART_7b系列而进行的各种实验。本发明,PFM-Il无蛋白质的培养基系列,是从培养基ART-3(Ali,1997 ;Ali et al.,2000)配制而得的。PFM-Il系列的各种培养基产品的最终配方在下面的表中列出。HEPES和碳酸氢盐 在这些培养基制备物中的浓度有不同,本文对此进行了说明。本发明的基本上无蛋白质培养基包括矿物盐、氨基酸、抗氧化剂、抗生素、能量组 分和缓冲剂组分(HEPES和碳酸氢盐,用于在补充CO2的条件下温育),它们与市售的含蛋白 质的培养基相似,但细节上不同。本发明的基本上无蛋白质的培养基独特地包含大分子物 质(甲基纤维素和相关聚合物),和任选的非代谢性糖醇(D-甘露醇)。构成本发明基本上无蛋白质的培养基的大分子是具有化学式I的甲基纤维素
权利要求
一种用于人类生殖细胞的基本上无蛋白质的细胞培养基,其适用于供体外受精和其它辅助生殖技术用的人类生殖细胞的体外处理的全过程中,该培养基包含矿物盐、氨基酸、抗氧化剂、维生素、营养物、抗生素、D 甘露醇,和分子量为14,000道尔顿的甲基纤维素。
2.根据权利要求1的基本上无蛋白质的培养基,其中所述甲基纤维素具有这样的特 征,使得2%溶液在25°C具有15厘泊的粘度。
3.其中每一个R独立地为H或CH3,n是数值为大约34-大约43的整数,并且其中甲氧基 取代以重量计为27. 5% -31. 5%。
4.根据权利要求4的基本上无蛋白质的培养基,其中在化学式I的化合物的每个糖模 块上搭接的CH3取代基的平均数目为1.5-1.9。
5.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,其中所述甲基纤维素在溶液 中以0. 01g/L(0. 71微摩尔)-0. 5g/L(0. 036mM)的浓度存在。
6.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,其中所述甲基纤维素在溶液 中的存在浓度为 0. 01g/L(0. 71 微摩尔)-0. 15g/L(0. OOOllmM)。
7.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,其中所述甲基纤维素在溶液 中以大约0. Ig/L(0. 007ImM)的浓度存在。
8.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,其中所述氨基酸是L-精氨 酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、 L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-牛磺酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰 胺或甘氨酸,或其任意组合。
9.根据权利要求8的基本上无蛋白质的培养基,其中氨基酸的存在浓度为L-精氨酸 HC1,大约 0. 018mM-大约 0. 18mM ;L-胱氨酸.2HC1,大约 0. 0025mM-大约 0. 025mM ;L-组氨 酸HC1. H20,大约0. 005mM-大约0. 05mM ;L-异亮氨酸,大约0. OlmM-大约0. ImM ;L-亮氨 酸,大约0. OlmM-大约0. ImM ;L-赖氨酸.HC1,大约0. 0125mM-大约0. 125mM ;L-甲硫氨酸, 大约0. 0025mM-大约0. 025mM ;L-苯丙氨酸,大约0. 005mM-大约0. 05mM ;L-苏氨酸,大约 0. OlmM-大约 0. ImM ;L-色氨酸,大约 0. 00125mM-大约 0. 0125mM ;L-酪氨酸.2Na2H20,大约 0. 005mM-大约0. 05mM ;L-缬氨酸,大约0. OlmM-大约0. ImM ;L-丙氨酸,大约1. OmM-大约 10mM ;L-牛磺酸,大约1. OmM-大约30mM ;谷氨酸,大约0. OlmM-大约1. OmM ;L-谷氨酰胺, 大约1. OmM-大约50mM ;或者L-甘氨酸,大约0. ImM-大约1. OmM。
10.根据权利要求9的基本上无蛋白质的培养基,其中氨基酸的存在浓度为0.5mM L_精氨酸;0. OlmM L-胱氨酸.2HC1 ;0. 02mM L-组氨酸;0. 04mM L-异亮氨酸;0. 04mM L-亮 氨酸;0. 05mM L-赖氨酸*HC1 ;0. OlmM L-甲硫氨酸;0. 02mM L-苯丙氨酸;0. 04mM L-苏氨酸;0. 005mM L-色氨酸;0. 02mM L-酪氨酸.2Na2H20 ;0. 04mM L-缬氨酸;0. 5mM L-丙氨酸; 20mML-牛磺酸;0. 5mM L-谷氨酸;和20mM L-谷氨酰胺或者0. 25mM L-甘氨酸。
11.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,其中构成该培养基的矿物盐 是氯化钙、硫酸镁、氯化钾、氯化钠和磷酸钠。
12.根据权利要求11的基本上无蛋白质的培养基,其中构成所述培养基的矿物盐 的存在浓度为大约 3. 0mM(0. 23g/L)-3. 6mM(0. 27g/L)氯化钙;大约 0. 7mM(0. 086g/ L) _ 大约 0. 81mM(0. 098g/L)硫酸镁;大约 4. 7mM(0. 35g/L)-大约 5. 4mM(0. 4g/L)氯化 钾;大约 0. 1M(6. 12g/L)_ 大约 0. 12M(6. 95g/L)氯化钠和大约 0. 89mM(0. 107g/L)-大约 1. 0mM(0. 122g/L)磷酸二氢钠。
13.根据权利要求12的基本上无蛋白质的培养基,其中构成所述培养基的矿物盐的 存在浓度为3. lmM(0. 235g/L)氯化钙;0. 72mM(0. 087g/L)硫酸镁;4. 8mM(0. 355g/L)氯化 钾;0. 11M(6. 171g/L)氯化钠;和 0. 88mM(0. 108g/L)磷酸二氢钠。
14.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,其中构成所述培养基的维生 素是氯化胆碱、肌醇、烟酰胺、D-泛酸、吡哆醇HC1、核黄素、硫胺HC1、叶酸、维生素B12、维生 素E,或其任意组合。
15.根据权利要求14的基本上无蛋白质的培养基,其中构成所述培养基的维 生素的存在浓度为大约0. 004mM(0. 0005g/L) -0. 005mM(0. 0007g/L)氯化胆碱;大 约 0. 0024mM(0. 0006g/L)-0. 0028(0. 0007g/L)D-生物素;大约 0. 0067mM(0. 0012g/ L)-0. 0078mM(0. 0014g/L)肌醇;大约 0. 005mM (0. 0006g/L)-0. 0057mM (0. 0007g/ L)烟酰胺;大约 0. 0025mM(0. 0005g/L)-0. 003mM(0. 0007g/L)D-泛酸;大约 0. 003(0. 0006g/L)mM-0. 0034mM(0. 0007g/L)卩比哆醇 HC1 ;大约 0. 00016mM(0. 00006g/ L) -0. 00019mM(0. 00007g/L)核黄素;大约 0. 0018mM(0. 0005g/L)-0. 0021mM(0. 0006g/ L)硫胺 HC1 ;大约 0. 0014mM(0. 006g/L)-0. 0016mM(0. 0007g/L)叶酸;大约 443pM(600ng/ L)-885pM(l. 2mg/L)维生素 B12 ;和 0. 008mM(0. 003g/L)-0. 012mM(0. 005g/L)维生素 E。
16.根据权利要求15的基本上无蛋白质的培养基,其中构成所述培养基的维生 素的存在浓度为0. 004mM(0. 0005g/L)氯化胆碱;0. 0024mM(0. 0006g/L)D_生物素; 0. 0067mM(0. 0012g/L)肌醇;0. 005mM(0. 0006g/L)烟酰胺;0. 0025mM(0. 0005g/L) D-泛酸; 0. 003(0. 0006g/L)吡哆醇 HC1 ;0. 00016mM(0. 00006g/L)核黄素;0. 0018mM(0. 0005g/L)硫 胺 HC1 ;0. 0014mM(0. 006g/L)叶酸;616pM(800ng/L)维生素 B12 ;和 0. 010mM(0. 004g/L)维 生素E。
17.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,其中构成所述培养基的营养 物是D-葡萄糖、丙酮酸盐(或酯)、果糖、乳酸,或其任意组合。
18.根据权利要求17的基本上无蛋白质的培养基,其中构成所述培养基的营养物的存 在浓度为 4. 3mM(0. 78g/L)D-葡萄糖;0. 3mM(0. 02975g/L)丙酮酸钠;5. lmM(0. 92g/L)果糖 和 10mM(l. 13g/L)乳酸钠。
19.根据权利要求18的基本上无蛋白质的培养基,其中D-葡萄糖的存在浓度为 3. 0mM(0. 75g/L)-5. 6mM(l. Og/L)。
20.根据权利要求19的基本上无蛋白质的培养基,其中果糖的存在浓度为lmM(0.18g/ L)-5. 6mM(l. Olg/L)。
21.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,其中溶液中的抗氧化剂是谷 胱甘肽。
22.根据权利要求21的基本上无蛋白质的培养基,其中谷胱甘肽的浓度为大约 0. 25mM(0. 077g/L) -0. 35mM(0. llg/L)。
23.根据权利要求22的基本上无蛋白质的培养基,其中谷胱甘肽的浓度为 0. 3mM(0. 092g/L)。
24.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,进一步包含EDTA。
25.根据权利要求24的基本上无蛋白质的培养基,其中EDTA的浓度为大约 0. lmM(0. 0416g/L)-0. 103mM(0. 043g/L)。
26.根据权利要求25的基本上无蛋白质的培养基,其中EDTA的浓度为 0. lmM(0. 0418g/L)。
27.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,进一步包含HEPES。
28.根据权利要求27的基本上无蛋白质的培养基,其中HEPES的浓度为15mM(3.6g/L) 或 25mM(5. 96g/L),并且 D-葡萄糖的浓度为大约 3. 3mM(0. 59g/L)_ 大约 3. 6mM(0. 65g/L)。
29.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,进一步包括酚红或其它pH 指示剂。
30.根据权利要求29的基本上无蛋白质的培养基,其中酚红的浓度为0.031mM(0. 011g/L)。
31.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,其中溶液中存在浓度为大约1.5mg/L-大约4mg/L的硫酸庆大霉素。
32.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,其中存在浓度为75mg/L的青毒素G。
33.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,其中存在浓度为大约0.056 微摩尔_大约6. 9微摩尔的D-甘露醇。
34.根据权利要求33的基本上无蛋白质的培养基,其中存在浓度为2.8微摩尔的D-甘露醇。
35.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基,进一步包含碳酸氢钠。
36.根据权利要求35的基本上无蛋白质的培养基,其中碳酸氢钠的存在浓度为 26. 2mM(2. 2g/L)。
37.根据权利要求36的基本上无蛋白质的培养基,其中碳酸氢钠的存在浓度为 4. 0mM(0. 336g/L) -26. 2mM(2. 2g/L)。
38.培养基在辅助生殖技术中的应用,包括使用权利要求36的基本上无蛋白质的培养 基处理人生殖细胞的步骤。
39.根据权利要求38的培养基在辅助生殖技术中的应用,其中所述基本上无蛋白质的 培养基是权利要求36的培养基。
40.根据权利要求38的培养基在辅助生殖技术中的应用,其中所述人类生殖细胞是未 受精卵。
41.根据权利要求38的培养基在辅助生殖技术中的应用,其中所述人类生殖细胞是多 个精子。
42.根据权利要求38的培养基在辅助生殖技术中的应用,其中所述人类生殖细胞是受 精卵。
43.根据权利要求38的培养基在辅助生殖技术中的应用,其中该培养基专门用于子宫 内授精。
44.根据权利要求1的用于人类生殖细胞的基本上无蛋白质的细胞培养基,其是从矿 物盐、氨基酸、抗氧化剂、维生素、营养物、抗生素、D-甘露醇和分子量为14,000道尔顿的甲 基纤维素的至少一种或多种储液制备的,其中将所述储液用水稀释以形成基本上无蛋白质 的细胞培养基。
45.一种用于人类生殖细胞的基本上无蛋白质的细胞培养基,其适用于供体外受精 和其它辅助生殖技术用的人类生殖细胞的体外处理的全过程中,所述培养基包含0. 5mM L_ 精氨酸;0. OlmM L-胱氨酸.2HC1 ;0. 02mM L-组氨酸,0. 04mM L-异亮氨酸;0. 04mM L_亮氨酸;0. 05mM L-赖氨酸.HC1 ;0. OlmM L-甲硫氨酸;0. 02mM L_苯丙氨酸;0. 04mM L_ 苏氨酸;0. 005mM L_ 色氨酸;0. 02mM L_ 酪氨酸.2Na2H20 ;0. 04mM L_ 缬氨酸;0. 5mM L_丙氨酸;20mM L-牛磺酸;0. 5mM谷氨酸(0. 39mM) ;20mM L_谷氨酰胺或0. 25mML_甘 氨酸;3. lmM(0. 235g/L)氯化钙;0. 72mM(0. 087g/L)硫酸镁;4. 8mM(0. 355g/L)氯化钾; 0. 11M(6. 171g/L)氯化钠;0. 88mM(0. 108g/L)磷酸二氢钠;0. 004mM(0. 0005g/L)氯化胆碱; 0. 0024mM(0. 0006g/L)D-生物素;0. 0067mM(0. 0012g/L)肌醇;0. 005mM(0. 0006g/L)烟酰 胺;0. 0025mM(0. 0005g/L)D-泛酸;0. 003(0. 0006g/L)吡哆醇 HC1 ;0. 00016mM(0. 00006g/ L)核黄素;0. 0018mM(0. 0005g/L)硫胺素 HC1 ;0. 0014mM(0. 006g/L)叶酸;616pM(800ng/L) 维生素 B12 ;0. 010mM(0. 004g/L)维生素 E ;4. 3mM(0. 78g/L)D-葡萄糖;0. 3mM(0. 02975g/ L)丙酮酸钠;5. lmM(0. 92g/L)果糖;10mM(l. 13g/L)乳酸钠;0. 3mM(0. 092g/L)谷胱甘肽; 0. lmM(0. 0418g/L)EDTA ;0. 031mM(0. Ollg/L)酚红;2. 8 微摩尔 D-甘露醇;26. 2mM(2. 2g/L) 碳酸氢钠;75mg/L青霉素G ;和1. 5mg/L硫酸庆大霉素。
46.权利要求45的基本上无蛋白质的细胞培养基,其中硫酸庆大霉素的浓度为4mg/L。
47.权利要求45的基本上无蛋白质的细胞培养基,其中D-葡萄糖的浓度为 3. 3mM(0. 59g/L)-大约 3. 6mM(0. 65g/L),并进一步包含 15mM(3. 6g/L)HEPES。
48.权利要求45的基本上无蛋白质的细胞培养基,其中D-葡萄糖的浓度为 3. 3mM(0. 59g/L)-大约 3. 6mM(0. 65g/L),并进一步包含 25mM(5. 96g/L)HEPES。
49.权利要求46的基本上无蛋白质的细胞培养基,其中D-葡萄糖的浓度为 3. 3mM(0. 59g/L)-大约 3. 6mM(0. 65g/L),并进一步包含 15mM(3. 6g/L)HEPES。
50.权利要求46的基本上无蛋白质的细胞培养基,其中D-葡萄糖的浓度为 3. 3mM(0. 59g/L)-大约 3. 6mM(0. 65g/L),并进一步包含 25mM(5. 96g/L)HEPES。全文摘要
本发明公开一种用于辅助生殖技术(assisted reproductive technologies)的含14kDa甲基纤维素的基本上无蛋白质的细胞培养基。
文档编号C12N5/075GK101945992SQ200880127343
公开日2011年1月12日 申请日期2008年12月19日 优先权日2007年12月21日
发明者贾法·阿里宾M·阿布杜拉 申请人:贾法·阿里宾M·阿布杜拉
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