一种热带假丝酵母发酵分离阿拉伯糖的用途与高纯度阿拉伯糖分离产物的制药、保健用途的制作方法

专利名称：：一种热带假丝酵母发酵分离阿拉伯糖的用途与高纯度阿拉伯糖分离产物的制药、保健用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及热带假丝酵母发酵分离阿拉伯糖的用途与高纯度阿拉伯糖分离产物的制药、保健用途。
背景技术：
：半纤维素是植物细胞壁中除纤维素之外的聚糖类，含量随不同植物而有所差别，大致占植物体重量的20-35%，是地球上除纤维素之外最丰富的多糖。纤维素是完全由葡萄糖单元聚合成的均一性聚糖，而半纤维素则主要是由木糖以β-(1-4)糖苷键构成主链，阿伯糖、甘露糖和半乳糖形成支链结构的非均一性聚糖。半纤维素的木聚糖主链一般含有50-150个木糖单位，无结晶结构，结合在纤维素微纤维的表面。半纤维素比纤维素容易水解得多，用稀酸在100_13(TC条件下，就很容易将半纤维素，水解生成以五碳糖为主要成分的半纤维素水解物。发酵半纤维素水解物生产市场容量大的木糖醇、乙醇等各类化工产品，是能够大规模利用半纤维素资源的有效途径。虽然用稀酸将半纤维素水解生成以单糖为主要成分的水解物的过程并不困难，但是，稀酸水解过程会伴随产生一系列微生物代谢抑制物，要改善半纤维水解物的发酵性能，必须除去其中的微生物代谢抑制物，即脱毒过程是必不可少的。目前在半纤维素水解物中已鉴定的毒物成分已经有几十种，其中代表性毒物包括三大类，即糠醛类化合物，如糠醛，5-羟甲基糠醛；脂肪酸类化合物，如甲酸，乙酸，丙酸；木质素降解生成的一系列含有苯环的化合物，如愈创木酚，苯甲醛，阿魏酸等。已经报道真空蒸发，溶剂抽提，活性炭吸附，大孔树脂吸附，离子交换树脂处理，都可以脱去某些毒物，改善水解物的发酵性能。然而，一种物理或化学方法只能除去某一类有毒物质，通常需要联合采用多种理化措施处理，半纤维水解物才能达到比较好的脱毒效果。但是，脱毒是一个耗费成本的过程，同时使用多种理化措施对半纤维素水解物进行脱毒处理，必须大幅度提高产物发酵的成本。事实上，自然界的一些微生物对半纤维素水解物中的某些毒物具有降解活性。例如，例如降解木质素及由木质素降解生成的一系列酚类化合物的白腐菌(林海陆钢张庆娜，降解造纸废水木质素菌种的筛选鉴定及应用，北京科技大学学报。2007，29(6)569-573；陶杨廖俊和罗学刚，生物制浆技术最新应用研究进展。纤维素科学与技术。2007，15(1):70-74，降解糠醛，5-羟甲基糠醛细菌，酵母(代书玲，张鲁嘉，糠醛及其衍生物微生物降解(转化)研究进展。氨基酸和生物资源2007，29(4)41-45；刘爱平许学书樊行雪，利用酵母生物转化植物纤维为乙醇的研究进展。生物技术通讯，2004，15(2)193-196)，降解短链脂肪酸的子囊菌(何刚强堵国成刘立明，嗜热子囊菌利用短链有机酸生产角质酶。生物工程学报，2008，24(5)821-828)近年有人开始尝试以生物酶法去除水解物中的毒物。Jonsson等人用漆酶与过氧化物酶联合处理木材酸水解物，能除去了大部分的单环酚性物(monoaromaticphenoliccopounds)0处理后的水解物用于乙醇发酵，结果葡萄糖消耗速率与乙醇生成速率提高了近5倍(JonssonJL,PalmqvistE,NilvebrantN0.,Detoxificationofwoodhydrolysateswithlaccaseandperoxidasefromthewhite-rotfungusTrametesversicolor.Appl.MicrobiolBiotechnol.1998，(49):691_697))。但复杂的毒物成分需要复杂的酶系的联合降解，这无疑大大增加了脱毒的成本。Lopez等人以微生物ConichaetaligniariaNRRL30616发酵处理木质纤维稀酸水解物，不仅去除糠醛、5-羟甲基糠醛的效果显著，同时也明显减少了水解物中的酚类物质。经过这一菌株处理的水解物再用产乙醇酵母发酵，80h产生1.66%°乙醇，而未处理的去口没有乙酉享产生(LopezJΜ,NicholsNN,DienBSetal.Isolationofmicroorganismsforbiologicaldetoxificationoflignocellulosechydrolysates.ApplMicrobiolBiotechnol.2004,64(1):125_131)。上述研究表明，利用微生物降解木质纤维水解物中复杂有毒物质是可能实现的。尤其是，如果能够获得一种同时具备降解半纤维水解物中的三大代表性毒物的代谢系统，即可以同时降解糠醛、脂肪酸及含有苯环结构化合物的微生物，并且这种微生物又不能利用木糖的话，那么直接利用这种微生物发酵半纤维水解物进行脱毒物质处理，就能有效克服现有理化脱毒方法工艺繁琐、成本高的缺点，并具有环境友好的优势。此外，半纤维素容易水解，用稀酸或酶处理植物纤维材料，很容易生成以木糖、阿拉伯糖为主要糖类，还包括其它杂糖的水解物。只有将半纤维素水解物中的木糖、阿拉伯糖分别纯化出来之后，它们才能实现各自的商业应用价值。纯净的木糖主要用途是制备木糖醇。木糖醇由木糖还原生成，具有甜度与蔗糖相当，无致龋性，在体内代谢不需胰岛素参与，也不会造成血糖的急剧变化等重要特性，在防龋齿食品，糖尿病人食品具有重要的应用价值。纯净的阿拉伯糖不仅风味与蔗糖极为相近，它的许多特殊的功能也引起了人们的广泛关注。例如阿拉伯糖能够抑制蔗糖酶的活性，从而抑制人体对蔗糖的吸收，可用于控制因食用蔗糖引起的血糖升高；阿拉伯糖具有抑制脂肪合成酶的活性，可用于预防肥胖。此夕卜，阿拉伯糖还可用作合成核苷类药物的中间体，在医药工业中有应用范围。然而，无论木糖或阿拉伯糖，只有达到很高的纯度之后才可能体现出较高的商业价值。木糖、阿拉伯糖的分离纯化，就成为其制造过程中极为重要的环节。美国专利6，086，681，(从溶液中回收木糖的方法，Methodforrecoveryofxylosefromsolutions,UnitedStatesPatent(2000)6，086，681)提供了一种以结晶工艺从植物纤维的稀硫酸水解物中分离木糖的方法，该法将纯度为30-60%(对总糖)的木糖溶液浓缩到木糖过饱和，然后冷却析出晶体木糖。不过这一发明没有涉及如何分离残余在母液中的木糖，也没有涉及如何分离已知存在于水解物中的阿拉伯糖。美国专利6，872，316(木糖的回收，Recoveryofxylose,UnitedStatesPatent(2005)6，872，316)提供了一种纳滤(nanofiltration)工艺提高植物纤维水解液中的木糖纯度的方法。因为木糖能够较容易地透过纳滤膜，其它杂质如低聚糖、二价盐，己糖，色素等则较多地被截留滤膜内侧。因而植物纤维水解液的纳滤透过液的木糖纯度，可比原始水解液提高1倍以上，其后续的离子交换，脱色等工艺负担也随之减轻。在这一发明中，阿拉伯糖与木糖一样容易透过纳滤膜，因此它不能实现木糖与阿拉伯糖之间的分离。另外，纳滤对于单糖的分离效果也是十分有限的。阳离子对单糖(或糖醇)有吸附作用，利用携带有阳离子材料作色谱填料分离不同的单糖或糖醇，是人们从多种单糖的混合溶液中分离目标单糖(或糖醇)的手段之一。美国专利6，506,89用甜菜根制备阿拉伯糖，MethodofpreparingL-arabinosefromsugarbeetpulp.UnitedStatesPatent(2003),6，506，897提供的一种制备阿拉伯糖的方法，包括了下几个步骤a)用强碱溶液提取已经榨过糖的甜菜根。b)用强酸水解前一步骤所获得的粗阿拉伯聚糖。c)酸水解液中和，过滤。d)用单价阳子树脂(选用钠，或钾型)作为分离树脂，色谱分离出阿拉伯糖组分。e)经阳、阴离子交换树脂及吸附树脂进一步纯化所获得的阿拉伯糖溶液。f)结晶回收晶体阿拉伯糖，纯度98%以上。这一专利先用碱提取物料，再用酸水解的工艺显然比较繁琐，另外，专利中有介绍水解液中是否存在木糖，也没有介绍如何分离木糖的问题。中国专利01816511.7(
专利名称：弱酸阳离子交换树脂色谱分离法从溶液中回收单糖；国际申请PCT/FI2001/0008482001.9.28；专利权人芬兰，达尼斯科甜味剂股份有限公司；发明人H海基莱，J云帕伊宁等)介绍了利用结合了Na+、Mg2+、H+或Ca2+型的弱酸性阳离子交换树脂用于色谱分离，使用包括至少一个步骤的色谱分离的多步骤工艺，从含鼠李糖、阿糖、木糖和其混合物的单糖的溶液中回收选自鼠李糖、阿拉伯糖(阿戊糖)、木糖和其混合物的单糖的方法。这一专利的正文及附图描述均显示，它所提供的色谱分离方法中，其木糖组分与阿拉伯糖的组分并未完全分离。此外，它也未述及选择性转化糖为糖醇，以及如何进行糖醇与糖之间的分离问题。除了将阳离子交换树脂上作为糖的色谱分离填料之外，一些结合了阳离子的无机材料也被用于糖类的分离纯化。美国专利4，664，718从戊糖/己糖混合物中分离阿拉伯糖的方法；Chang；Chin-Hsiung,Processforseparatingarabinosefromapentose/hexosemixture()。UnitedStatesPatent(1987)，4，664，718介绍了以钙Y-型沸石，或钙X-型沸石作吸附齐U，从戊糖/己糖混合物中分离阿拉伯糖的方法，但这一专利没有涉及分离回收木糖，或木糖醇。美国专利4，857，从其它醛糖混合物中分离阿拉伯糖的工艺；Kulptathipanja,Processforseparatingarabinosefromamixtureofotheraldoses,UnitedStatesPatent(1989)，4，857，642介绍用铵X-型沸石作吸附剂，从其它醛糖混合物中分离阿拉伯糖的方法。美国专利4，880，919从醛糖混合物中分离阿拉伯Hl^J工；Kulptathipanja,Processforseparatingarabinosefromamixtureofa1doses,UnitedStatesPatent(1989)，4，880，919介绍用钙-铵型混合的阳离子交换树脂作吸附剂分离阿拉伯糖。这两个专利也均未涉如何回收木糖或木糖醇的问题。以水为洗脱剂，单糖、糖醇在阳离子树脂(或沸石)上的色谱分离效果，取决于它们分子结构的亲/疏水性能。具有相同碳原子数的同一类糖(例如，属于五碳醛糖的木糖与阿拉伯糖)，或具有相同碳原子数的糖醇(如五碳的木糖醇与阿拉伯糖醇)之间，彼此互为同分异构体，而其化学性质十分相近，同一种阳离子树脂对它们之间吸附能力的差异也就很小。所以，无论用阳离子树脂(包括Na+、Mg2+、H+或Ca2+)直接分离半纤维素水解物中的五碳糖(木糖与阿拉伯糖)，或者是分离水解物经化学氢化后所生成的醇液(糖生成相应的醇)，都存在设备分离效率不高，产品的收率与纯度偏低等难于解决的困难。为了提高分离效率，许多学者采用了生物发酵辅助纯化的手段，即利用只能同化特定单糖的微生物选择性除去不需要的糖类，使水解液中目标单糖的纯度相对提高，以提高后续分离工序的效率。Nyun等人NyunHoPark,ShigekiYoshida,AkiraTakakashi,etal.AnewmethodforthepreparationofcrystallineL-arabinosefromarabinoxylanbyenzymatichydrolysisandselectivefermentationwithyeast.BiotechnologyLetters2001，23:411_416用来源于绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)培养物的粗酶液水解富含阿拉伯木聚糖(Arabinoxylan，含28.阿拉伯糖，32.8%木糖)的玉米皮，结果有21.3%(w/w)阿拉伯糖，18.7%(w/w)木糖被水解出来。此外，水解物中还含有一些其它单糖及低聚糖。水解物用能够代谢木糖，但不能代谢阿拉伯糖的土星拟威尔逊酵母(ffilliopsissaturnus)通气培养96小时，结果95%%的阿拉伯糖在发酵液中保存下来，而木糖仅残留量只相当于原始阿拉伯木聚糖重量的0.002%。这种发酵液经活性碳脱色，离子效换树脂脱盐，浓缩后结晶，所获得的晶体中未检测出木糖。用生物发酵选择性地除去木糖的方法，虽然可以解决阿拉伯糖与木糖难于分离的困难，但却浪费了宝贵的木糖资源。李道义等人李道义，闫巧娟，江正强等(中国农业大学)，酵母菌发酵玉米皮酸水解液制备结晶L-阿拉伯糖。食品科学，2007，28(4)125-127，用自己筛选的酵母菌株WYS15-3发酵玉米皮的稀酸水解物7天，结果选择性地除去了水解液中的葡萄糖与木糖。发酵液经脱色，脱离子、浓缩结晶等步骤，获得含量为97%的阿拉伯糖，得率为玉米皮干基的9.6%。按这一实验所用的菌株与方法纯化玉米皮水解液制备阿拉伯糖，不仅没有利用木糖资源，而且生产过程太长(7天)。此外，由于所用酵母菌株不能同化水解液中的半乳糖，存在于阿拉伯糖过饱和溶液中的半乳糖，直接影响了阿拉伯糖的结晶收率。中国专利200510040433.0
专利名称：一种从木糖母液或木糖水解液提取木糖和木糖醇的方法；发明人彭奇均提供了一种从木糖水解液或木糖母液中分离制备高纯度木糖或木糖醇的技术。具体方法是以木糖水解液或木糖母液为原料，以酿酒酵母发酵除去其中的葡萄糖，以合成的专用钙型阳离子树脂作为色谱分离树脂，以水为洗脱剂，通过模拟移动床使木糖与阿拉伯糖等杂质分离，得到富含木糖的组分。或者将富含木糖，阿拉伯糖的糖液直接氢化，使它们生成为相应的醇之后，再通过模拟移动床色谱分离，获得不同的糖醇组分。但是，在本发明的举例中，分离水解液(糖液)的过程未能将木糖与其它杂糖(主要是阿拉伯糖)彻底分离，将水解液中的糖加氢还原为糖醇之后再进行的色谱分离，也未能将不同的糖醇(主要是木糖醇与阿拉伯糖醇)彻底分离。此外，这一专利虽然已经使用了微生物除葡萄糖的技术，也介绍了糖液氢化后木糖醇的分离，但并没有涉及如何选择性地将木糖转化为木糖醇，然后再将木糖醇与其它的糖分离的问题。由于以水为洗脱剂的离子色谱法在分离糖类方面的固有缺陷，人们也尝试用其它的方法解决这一问题。美国专利2006010042从单糖混合物中分离与制备阿拉伯糖及木糖的工艺Hollingsworth；RawleI，Processforthepreparationandseparationofarabinoseandxylosefromamixtureofsaccharides；UnitedStatesPatentApplication，20060100423]利用单糖与酮或醛试剂反应，生成糖乙缩醛(acetalsofthe7saccharides)，根据不同的糖乙缩醛对极性、非极性有机溶剂溶解性能的差异，可以使不同的糖乙缩醛彼此分离，最后再分别将其水解为相应的单糖。不过，大量使用有机溶剂在工业生产中的缺点是显而易见的。冯亚青等人介绍冯亚青，刘燕同，张晓东等，从L-阿拉伯树胶提取L-阿拉伯糖，精细化工，2003，20(5):288-290，以微晶纤维素，或硅胶为固定相，以正丁醇、乙酸乙酯、异丙醇与水的混合物为流动相，连续进行二次色谱分离，最后可获得含量99%的阿拉伯糖晶体。但是，本文并没有使来源于植物细胞壁的半纤维素作原料，它所介绍利用有机溶剂作为流动相的色谱分离方法，在大规模工业性生产中也存在诸多的安全隐患。综上所述可见，当前工业化生产木糖醇的化学工艺、或直接从半纤维水解物中分离阿拉伯糖，都无法解决木糖与阿拉伯糖之间难于分离的问题。此外，由于化学还原过程的非选择性，以现有的化学工艺也无法直接利用半纤维素水解物同时制备出木糖醇与阿拉伯糖。微生物也能够催化木糖生成木糖醇。利用微生物直接发酵半纤维素水解物生产木糖醇，由于具有节能，无需化学工艺所必不可少的木糖纯化过程等优势，已经引起人们的极大关注。但目前发酵法生产木糖醇的效率还很低，尽管相关的研究报道甚多，但大多数仍局限于半纤维素水解物的制备方法，木糖醇发酵工艺优化方面。从木糖发酵液制备结晶木糖醇方面的研究甚少，也没有人研究发酵工艺木糖醇与阿拉伯糖制备相结合的问题。本发明人蔡爱华，张厚瑞，何成新等从蔗渣半纤维素水解物发酵液中分离纯化木糖醇。食品科学。2006，27(7):136-139曾经介绍，蔗渣半纤维素水解物发酵液经超滤处理，超滤透过液经离子交换柱层析脱盐之后，再经活性炭脱色，这种木糖醇液浓缩至可溶性固形物含量为80%，即可结晶得到含量>98.5%的木糖醇产品。本发明人在该报道中还注意到，结晶母液的阿拉伯糖浓度超过木糖醇浓度的45.0%，木糖浓度超过木糖醇浓度的12.6%时，它们都容易随木糖醇一起结晶析出。如果发酵液中的木糖或阿拉伯糖超过这一浓度比例范围，将难于通过结晶的方法有效纯化出木糖醇。这一由发酵液制备结晶木糖醇工艺的特点是，将发酵液净化处理之后直接浓缩结晶，得出木糖醇晶体产品，剩下难以进一步结晶纯化，含有木糖醇，阿拉伯糖，木糖等成分的结晶母液。发明人当时显然没有意识到木糖醇发酵与阿拉伯糖提取结合的问题。丁兴红等人丁兴红夏黎明影响半纤维素发酵液中分离纯化木糖醇关键因子的研究。中国食品学报。2006，6(6):87-90以木糖醇溶液与半纤维素发酵液为研究对象，考察了木糖醇初始浓度、残糖(阿拉伯糖)、晶种和结晶温度对木糖醇结晶动力学的影响，并确定了木糖醇初始质量浓度为750g/L，结晶温度为-4°C。在木糖醇溶液中添加1%。木糖醇晶种，能缩短结晶诱导期的延续时间，提高结晶速度。木糖醇溶液中少量的阿拉伯糖能提高木糖醇结晶速度，但当阿拉伯糖质量浓度高于120g/L时，木糖醇晶体的纯度会降低。这篇报告所述工艺路线，也是将净化后的发酵液直接浓缩，浓缩液直接结晶制出木糖醇产品。虽然它提到了发酵液中阿拉伯糖的存在将影响木糖醇晶体的纯度，但并没有论述木糖醇与阿拉伯糖之间的分离问题。应国清等人应国清，王普，张峰，虞炳钧发酵法生产木糖醇的分离纯化工艺。中国医药工业杂志。2002，33(3):117—123则在含有残余木糖的发酵液(转化液)中加入一定浓度的NaOH，沸水回流约2h，将残留在发酵液中的木糖降解为相应的酸和并生成相应的盐类，再用阴、阳离子交换树脂除去盐，最后浓缩结晶得到木糖醇晶体。这一工艺显然不考虑回收发酵液中的其它糖类。我们用钙型阳离子树脂对木糖、阿拉伯糖及木糖醇进行色谱分离的过程中发现，木糖与阿拉伯糖的色谱峰大部分相互重叠，但是，这两种糖与木糖醇的色谱峰却基本不重叠(图3)。显然，木糖醇-阿拉伯糖(糖-醇)之间的色谱分离效率，要比木糖-阿拉伯糖(糖-糖)之间的分离效率高得多。如果我们能够选择性地将半纤维素水解物中的木糖转化为木糖醇，并使阿拉伯糖不参与反应，那么就可以实现将对原料木糖-阿拉伯糖的分离，转变成为对产品木糖醇_阿拉伯糖的分离，木糖与阿拉伯糖之间的分离难题也就迎刃而解了。某些酵母菌具有代谢消耗葡萄糖，转化木糖生成木糖醇，但不能利用阿拉伯糖的特性。原来以木糖_阿拉伯糖_葡萄糖为主要成分为半纤维素水解物，经这种微生物发酵之后就会转变为以木糖醇_阿拉伯糖为主要成分的发酵液。于是，用这种酵母对半纤维素水解物进行一次发酵，不仅能达到生物转化(木糖转化为木糖醇)与生物纯化(细胞代谢消耗除去葡萄糖，木糖醇与阿拉伯糖的纯度相对提高)的双重效果，而且后续的产物色谱分离的效果也将得到有效改善。此外，对发酵液的一次色谱分离过程，事实上同时纯化了木糖醇与阿拉伯糖两个产品，从而避免了单纯生产木糖醇或阿拉伯糖时对原料选择的严格限制，并提高原料的综合利用水平，节约了生产成本。
发明内容本发明的目的是为了解决现有的半纤维素水解物理化脱毒工艺所存在的过程烦琐，成本高的问题。本发明的内容包括发明人自造纸厂，木糖厂，糠醛厂周围土壤污泥样富含培养、分离、筛选，获得能有效改善木质纤维水解物发酵性能的两个分离物S-7和Lj-3。发明人鉴定分离物S-7属于东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)，它在2006年9月18日被保存到中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNOM206098，不能利用木糖；分离物Lj-3属于西方伊萨酵母(Issatchenkiaoccidentalis)，它在2006年9月18日被保存到中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO:M206097，利用木糖的能力极微弱。发明人用这种脱毒活性新菌株建立了半纤维水解物的生物脱毒法；将脱毒活性菌株与发酵木糖生成木糖醇微生物混合接种，实现半纤维素水解物同步脱毒发酵生产木糖醇；将脱毒活性菌株与发酵木糖生成乙醇的微生物混合接种，实现半纤维素水解物同步脱毒发酵生产乙醇。上述两种酵母的保藏信息参见本专利申请所附的两份保藏受理通知书。属于本发明的两个生物脱毒活性菌株S-7(CCTCCNO:M206098)和Lj_3(CCTCCNO:M206097)，其分离筛选、及分类鉴定的过程如下用蔗渣半纤维素水解物为分离培养基的基本成分，适当真空后用碱调节pH5-6。如果制成平板，外加琼脂20g/L作为固形剂。从纸浆厂废水污染的环境采集的土壤、淤泥作分离样品。250ml三角瓶装量25ml，接入废水或淤泥分离样品约lg，30°C，200rpm摇瓶富集培养72h。取有菌体生长的培养液在同一培养基平板上划线分离，选择能够快速生长的类型，转到斜面保存。斜面培养物转移到半纤维稀酸水解物中并在摇瓶条件下培养24小时，离心除去菌体，然后接入能够同化木糖的酵母菌株进行发酵，选留那些能够有效改善半纤维素稀酸水解物发酵性能的脱毒活性菌株。如此经过十余个批次的样品分离，获得改善半纤维素水解物发酵性能活性最强的两个分离物，编号分别为S-7和Lj-3。高效液相色谱的检测结果表明，S-7和Lj-3对半纤维素稀酸水解物中的代表性毒物醋酸，糠醛及酚性物均有良好的降解活性，其中S-7不利用木糖，Lj-3只能微弱利用木糖。上述方法分离得到的两个菌株于4°C冷藏或冻干法保藏。按照《酵母菌鉴定手册》(青岛海洋大学出版社)一书提供的方法，鉴定了S-7和Lj-3的细胞、菌落与生理生化特征(表1，表2)。分离物S-7的生理、生化特征与《酵母菌鉴定手册》中所描述的东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)完全相同；分离物Lj_3的生理、生化特征与同一书中所述的西方伊萨酵母(Issatchenkiaoccidentals)完全相同。用引物5，-GCATATCAAAAGCGGAGGAAAAG-3，和5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，，聚合酶链式反应(PCR)扩增S-7和Lj-3的26SrDNAD1/D2区域核酸序列(方法参照KurtzmanCP,FournewCandidaspeciesfromgeographicallydiverselocations.AntonievanLeeuwenhoek,2001,79353-361)0测定扩增产物的核酸序列(表3，表4)，并用此序列在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索(Nucleotide-nucleotideBLAST)。搜索结果表明，S-7的26SrDNAD1/D2区域的核酸序列，与GenBank现有Issatchenkiaorientalis同一区域核酸序列同源性均达100%；Lj-3与其中与Issatchenkiaoccidentalis同一区域核酸序列的同源性达到100%。根据上述的细胞、菌落形态、生理生化与分子生物学特征的可以确定，S-7的分类地位属于东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)；Lj-3的分类地位属于的西方伊萨酵母(Issatchenkiaoccidentalis)。东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)S-7在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏号为CCTCCNO:M206098，它的26SrDNAD1/D2区域的核苷酸序列在GenBank的登记号为EF030708http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer,fcgi？db=nucleotide&val=116834296；西方伊萨酵母(Issatchenkiaoccidentalis)Lj_3在CCTCC的保藏号为CCTCCNO:M206097，它的26SrDNAD1/D2区域的核苷酸序列的GenBank登记号为EF030710http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer,fcgi？db=nucleotide&val=116834298。表1分离物S-7、Lj-3的细胞与菌落形态特征<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)S-7(CCTCCNO:M206098)26SrDNADl/D2区域的核酸序列(GenBank登记号EF030708)1taagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcggcaaga61gctcagatttgaaatcgtgctttgcggcacgagttgtagattgcaggttggagtctgtgt121ggaaggcggtgtccaagtcccttggaacagggcgcccaggagggtgagagccccgtggga181tgccggcggaagcagtgaggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctccaa241gcgggtggtaaattccatctaaggctaaatactggcgagagaccgatagcgaacaagtac301tgtgaaggaaagatgaaaagcactttgaaaagagagtgaaacagcacgtgaaattgttga361aagggaagggtattgcgcccgacatggggattgcgcaccgctgcctctcgtgggcggcgc421tctgggctttccctgggccagcatcggttcttgctgcaggagaaggggttctggaacgtg481gctcttcggagtgttatagccagggccagatgctgcgtgcggggaccgaggactgcggcc541gtgtaggtcacggatgctggcagaacggcgcaacaccgcccgtcttgaaacacgga西方伊萨酵母(Issatchenkiaoccidentalis)Lj-3(CCTCCNO:M206097)的26SrDNAD1/D2区域核酸序列(GenBank登记号EF030710)ltatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcg61gcaaaagctcagatttgaaatcgtgtttcggcacgagttgtagattgcaggttggagtct121ttgtggaagcgtgtgtctaagtcccttggaacagggtgccattgagggtgagagccccgt181gagacgcgtgcggaagctgtaaggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagct241ctaagtgggtggtaaattccatctaaggctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaa301gtactgtgaaggaaagatgaaaagcactttgaaaagagagtgaaacagcacgtgaaattg361ttgaaagggaagggtattgggctcgacatgggatttgcgcaccgctgctccttgtgggcg421gcgctctgtgcttttcctgggccagcatcggtttttgccgcaggagaaggcgtgctggaa481tgtggctcttcggagtgttatagccagtgcgagatgctgcgtgcggggaccgaggactgc541gacatctgtctcggatgctggcacaacggcgcaataccgcccgtcttgtaa本发明按下述方法制备所需要的半纤维素水解物将甘蔗渣、玉米芯、稻草等作物秸秆粉碎至适当粒度，按固液比167加入0.33%(w/w)的稀硫酸或稀盐酸溶液，搅拌均勻，在耐酸的压力容器内加热至100130°C，维持0.53小时。水解结束后滤除残渣，滤液即为半纤维素水解物。用固体碳酸钙或氢氧化钙将半纤维素稀酸水解液调至PH值38，可直接或浓缩后再进行生物脱毒。一般地，较高酸浓度的条件可以使用较低的水解温度，或相应缩短水解时间，较低的酸浓度则必须提高水解温度或延长水解时间。本发明按下述方法培养用于半纤维水解物生物脱毒，木糖醇发酵，乙醇发酵的微生物菌种脱毒菌株种子液的培养将CCTCCNO:M206098或CCTCCNO:M206097的斜面培养物接入液体种子培养基，装液量为摇瓶容量的20%，在27--30°C，转速200rmp条件下摇床培养1218小时，即可获得可用于脱毒的种液。种子培养基组成为葡萄糖50g/L，MgS04.7H202g/L,K2HP044g/L，KH2P046g/L，酵母膏5g/L。发酵木糖生成木糖醇的菌株种子液培养所用的菌株为热带假丝酵母(Candidatropicalis)CCTCCNO:M205067，它在2005年6月15日被保存到中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCN0:M205067，分类命名为热带假丝酵母l-18Candidatropicalis1-18,(见发明专利“热带假丝酵母菌株的分离及其用于木糖醇生产的方法”，发明专利申请号200510037580.2)，含葡萄糖20g/L，木糖20g/L，其余成分与培养条件同脱毒菌株种子培养。发酵木糖生成乙醇的菌株种子液培养所用的菌株为保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)的嗜单宁管囊酵母(Pachysolentannophilus)CICC1770，培养基成分及培养条件同发酵木糖生成木糖醇的菌种培养。本发明按下述方法进行半纤维素水解物生物脱毒半纤维素水解物总糖含量为420%(w/w)，其中还原性单糖占总糖含量>90%以上，以木糖为主成分。用碱液(氢氧化钙，氨水等)调节至PH3-7，按10%(v/v)接种量接入培养好的CCTCCNO:M206098或CCTCCNO:M206097种子液，在2535°C，通气条件下发酵脱毒520小时，其中的大部分微生物有毒成分即可被降解除去。收集离心沉淀的菌体重复用于下一批新鲜的半纤维素水解物脱毒，离心上清液可直接或者浓缩后用于木糖醇发酵，或乙醇发酵。本发明按下述方法发酵脱毒后的半纤维素水解物生产木糖醇已经过CCTCCNO:M206098，或CCTCCNO:M206097发酵脱毒过的半纤维素水解物，真空浓缩至木糖约150g/L，氨水调节至pH=6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇发酵的半纤维素水解物培养基。木糖醇发酵用摇瓶进行，摇瓶装量10%，按5%(v/v)接种量接入热带假丝酵母(Candidatropicalis)CCTCCNO:M205067种子液，200rmp，33°C进行发酵至木糖消耗完。收集离心沉淀的菌体，投入到新鲜的半纤维素水解物培养基中继续新一轮的木糖醇发酵，离心上清液用于制备木糖醇。本发明按下述方法利用半纤维素水解物进行同步脱毒发酵生产木糖醇真空浓缩半纤维素水解物至木糖含量约100-150g/L，用碱(氢氧化钙，或氨水)调至pH3-pH7，，离心或过滤除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纤维素水解物培养基，分装于三角瓶；取培养好的株CCTCCNO:M206098种子液，或者CCTCCNO:M206097的种子液，并与等体积的CCTCCN0:M205067种子液混合，然后按5%(v/v)和用种量接入半纤维素水解物中，摇瓶培养至木糖消耗完。离心收集沉淀的酵母细胞并用于新鲜的培养基中，继续同步脱毒发酵。如此不断地循环，直至酵母细胞不能利用。对预先进行脱毒处理后获得的半纤维素水解物后续进行木糖醇发酵和制备阿拉伯糖的方法包括如下步骤S1.对经过CCTCCNO:M206098发酵脱毒的半纤维素水解物真空浓缩至木糖约150g/L，氨水调节至pH=6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇发酵的半纤维素水解物培养基；S2.木糖醇发酵用摇瓶进行，摇瓶装量10%，按5%(v/v)接种量接入CCTCCNOM205067种子液，200rmp，33°C进行发酵至木糖消耗完；S3.收集离心沉淀的菌体，投入到新鲜的半纤维素水解物培养基中继续新一轮的木糖醇发酵，离心上清液制备木糖醇；S4.对木糖醇发酵液除去细胞后，经离子交换净化，再用钙型阳离子树脂进行色谱分离，获得纯净的木糖醇分流，所述分流的木糖醇发酵液经浓缩、结晶，获得结晶木糖醇；S5.分流木糖醇发酵液后，获得阿拉伯糖分流发酵液，对阿拉伯糖分流发酵液用铵型阳离子树脂进行色谱分离，提高阿拉伯糖纯度，再通过浓缩、结晶，获得结晶阿拉伯糖。利用半纤维素水解物进行同步脱毒发酵生产木糖醇和阿拉伯糖的方法包括如下步骤S1.真空浓缩半纤维素水解物至木糖含量约100-150g/L，用碱(氢氧化钙，或氨水)调至pH3-pH7，，离心或过滤除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纤维素水解物培养基；S2.取培养好的CCTCCNO:M206098种子液，并与等体积的CCTCCNO:M205067种子液混合，然后按5%(v/v)和用种量接入半纤维素水解物中，摇瓶培养至木糖消耗完；S3.离心收集沉淀的酵母细胞并用于新鲜的培养基中，继续同步脱毒发酵；如此不断地循环，直至酵母细胞不能利用；S4.对木糖醇发酵液除去细胞后，经离子交换净化，再用钙型阳离子树脂进行色谱分离，获得纯净的木糖醇分流，所述分流的木糖醇发酵液经浓缩、结晶，获得结晶木糖醇；S5.分流木糖醇发酵液后，获得阿拉伯糖分流发酵液，对阿拉伯糖分流发酵液用铵型阳离子树脂进行色谱分离，提高阿拉伯糖纯度，再通过浓缩、结晶，获得结晶阿拉伯糖。本发明按下述方法利用半纤维素水解物进行同步脱毒发酵生产乙醇同步脱毒发酵生产乙醇所用的半纤维素水解物的培养基，与同步脱毒发酵生产木糖醇的培养基相同。取培养好的株CCTCCNO:M206098种子液，或者CCTCCNO:M206097的种子液，与等体积的CICC1770种子液混合，然后按5%(v/v)和用种量接入半纤维素水解物培养基摇瓶中，培养至木糖消耗完。离心收集沉淀的酵母细胞循环用于发酵新鲜的培养基，继续同步脱毒发酵，如此不断地循环，直至酵母细胞不能利用。蒸馏回收离心上清液中的乙本发明用高效液相色谱法检测生物脱毒菌株对半纤维素水解物中的代表性毒物质，及主要酚类物质降解活性。选择乙酸、糠醛及愈创木酚作为半纤维素水解物中不同类型抑制物的代表，将这三种化合物一起加入到普通酵母培养基中，并接入脱毒活性菌株(CCTCCNO:M206097,或CCTCCNO:M206098)进行发酵。利用这三种化合物均在198nm处均有较强的紫外吸收的特点，在如下色谱条件WaterS486高效液相色谱仪，ZORBAXXDB-C18色谱柱，流动相甲醇磷酸(0.2%，w/w)=7525(v/v)，对比检测这三种化合物在发酵前后的含量变化，判断这两个菌株对这三种代表性有毒成分均具有降解活性(图1)。由于酚类化合物在270nm附近均有强的紫外吸收，故以270nm为检测波长，以高效液相对比检测操作1的蔗渣半纤维素水解物、操作3的经东方伊萨酵母CCTCCNO:M206098生物脱毒，经西方伊萨酵母CCTCCNO:M206097生物脱毒的蔗渣半纤维素水解物(图2)。并分析这一检测波长条件下的一些特征峰的信息(表4)，可知半纤维素水解物经生物脱毒处理之后，其中的糠醛及许多有毒的酚类物质已被降解。本发明用对比生物发酵的方法检测生物脱毒菌株对半纤维素水解物的脱毒效果用CCTCCNO:M205067对比发酵经CCTCCNO:M206097,或经CCTCCNO:M206098脱毒处理前后半纤维素水解物，检测发酵产物木糖醇；或用CICC1770对比发酵经CCTCCNOM206097，或经CCTCCNO:M206098脱毒处理前后半纤维素水解物，检测发酵产物乙醇。可以发现，经过本发明所提供的生物菌株及脱毒方法处理后的半纤维水解物，无论用于木糖醇发酵或乙醇发酵，发酵物的产量、生成速率均有大幅度提高。由此即可肯定，本发明提供的生物脱毒菌株及生物脱毒方法能有效地提高半纤维素水解物的发酵性能。本发明突出的实质性特点和显著进步是1.本发明发现并提供的东方伊萨酵母CCTCCNO:M206097，西方伊萨酵母CCTCCNO:M206098这两个菌株，对半纤维水解物中三大代表性微生物代谢抑制物以醋酸为代表的有机酸，以糠醛为代表的糖类降解产物，及以愈创木酚为代表的酚类化合物，均同时具有降解活性，它们对半纤维水解物均具有突出的生物脱毒活性。2.本发明利用东方伊萨酵母CCTCCNO:M206097，或西方伊萨酵母CCTCCNO:M206098生物降解半纤维素水解物中的多种有毒成分，事实减少了基质中的杂质。与传统的理化脱毒工艺相比，用本发明对半纤维素水解物进行脱毒，显然具有简捷、低成本、及环境14友好的突出优势。3.本发明提供的两个脱毒活性菌株，其中CCTCCNO=M206097完全不能同化木糖、CCTCCNO=M206098对木糖的代谢能力也十分微弱，利用它们对半纤维素水解物脱毒，并并不会造成其中的木糖损失。由于这一特点，将它们与发酵木糖生成木糖醇，或发酵木糖生成乙醇的微生物置于同一发酵系统中，可实现半纤维水解物脱毒过程与木糖醇发酵，或与乙醇发酵相偶联，极大地简化发酵半纤维素水解物生产木糖醇发酵，或生产乙醇的工艺。具体而言，本发明还提供了一套通过发酵半纤维素水解物生产木糖醇，与从半纤维素水解物提取阿拉伯糖相结合的新方法，有效解决了化学工艺生产木糖醇的过程中，以及由半纤维素水解物提取阿拉伯糖的过程中，由于木糖与阿拉伯糖之间化学性质相近带来的分离效率低，产品收率低，或使用有机溶剂带来的安全隐患。与现有从发酵液制备木糖醇的工艺相比，本发明多收获了阿拉伯糖；与现有的阿拉伯糖的生产工艺相比，本发明多收获了木糖醇。本发明对于提高资源利用率，降低木糖醇及阿拉伯糖生产成本方面的优势十分明显。本发明的整个过程包括用酸或酶水解富含木聚糖的原料，获得以木糖，阿拉伯糖为主成分，同时含有葡萄糖，甘露糖，半乳糖等杂糖的水解物。这种水解物经除去微生物生长抑制物的脱毒处理之后，接入能够同化利用葡萄糖，专一性地转化木糖为木糖醇，但不能利用阿拉伯糖的酵母菌株。当发酵液木糖浓度低至一定限度之后停止发酵，得到以木糖醇与阿拉伯糖为主成分的发酵液。发酵液经细胞分离，离子交换脱盐，脱色之后适当浓缩，直接用钙型阳离子树脂为吸附剂，以纯水为洗脱剂进行色谱分离，分别得到纯度99%以上的高纯度木糖醇液，及以阿拉伯糖一杂糖溶液。高纯度木糖醇液减压浓缩，降温结晶获得晶体木糖醇。阿拉伯糖一杂糖溶液改用铵型阳离子交换树脂为吸附剂，仍以纯水为洗脱剂进行色谱分离，获得纯度1较高的阿拉伯糖液。最后将阿拉伯糖浓缩结晶，获得晶体阿拉伯糖。虽然上述色谱分离过程可以在填充了阳离子树脂的固定色谱柱上完成，但工业化的模拟移动床色谱装置能有效提高分离效率。用于本发明的半纤维素水解物是按如下方法制备的。将富含半纤维素的材料如玉米皮(cornfiber)、玉米芯(corncob),蔴·(sugarcanebagasse)等，以质量分数为0.5-2.5%(w/w)的稀硫酸，或盐酸，以酸液能够浸泡过物料为宜，在110-140°C条件下水解0.5-2.5h。水解后收集液体部分，用Ca(OH)2或CaCO3调节至pH3_pH4，除去沉淀，上清液再用相当于原料重量1一3%的活性碳吸附处理。滤去活性碳的溶液再依次通过阳离子，阴离子交换树脂净化，浓缩后即得到可用于发酵的半纤维素水解物。本发明按如下的方法，在发酵罐内利用酵母细胞选择性地催化将半纤维素水解物中的木糖经生物催化转化为木糖醇，而阿拉伯糖不参与生物催化反应。本发明所指的微生物主要是热带假丝酵母。这种酵母能够利用半纤维素水解物中的葡萄糖，半乳糖，甘露糖等六碳糖作为碳源生长，而不会生成相应的糖醇；对于五碳醛糖，热带假丝酵母能够转化木糖为木糖醇，却不能利用同属五碳醛糖的阿拉伯糖。本发明实际使用的菌株由本发明人筛选的，并保存于中国典型培养物保藏中心的热带假丝酵母菌株CandidatropicalisCCTCCM20506专利申请号:200510037580.2，发明者周玉恒,张厚瑞,蔡爱华,覃香香,陈海珊申请人:唐传生物科技(厦门)有限公司