专利名称：一种新的植酸酶基因及其表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种合成的新的植酸酶基因，是一种符合毕赤酵母密码偏爱性的大肠 杆菌植酸酶密码子的DNA序列；尤其还构建了一种能高效分泌表达该合成基因的毕赤酵母 工程菌。属于微生物基因工程技术领域。
背景技术：
植酸(肌醇六磷酸)是谷物、豆类及油料等作物中磷的主要贮存形式，其含量高达 总磷量18%-88% (Reddy NR等，1982)。尽管作物植酸磷的含量很高，但是，由于单胃动物 消化道内缺乏植酸酶，不能把植酸在消化道内水解成无机磷酸盐，因此植酸的利用率低。植 酸酶(EC3. 1.3.8)能水解植物性饲料中植酸磷，从而提高猪禽等单胃动物对磷的利用率。 植酸酶的添加可使畜禽粪便中磷的排出量减少40% 75%，可大大减轻养殖业造成的江 河或水域等环境污染，对发展养殖业和环境保护都有重要意义。虽然植酸酶已在饲料工业中得到广泛使用，明显降低饲料生产成本、改善环保，产 生可观的经济效益和社会效益；但是，饲用植酸酶的生产的不足是制约饲料加工业发展的 因素之一。因此，用现代生物技术改造和提升产量已成为植酸酶产业化的发展方向，它也是 各生物产业公司提高产品竞争力和取胜的关键因素之一。植酸酶的来源较为广泛，如植物种子、米糠、原核生物如大肠杆菌、真菌如黑曲霉， 甚至是动物肠道。由于遗传密码的简并性，不同物种间存在着密码偏爱性，这也是影响基因 异源表达的重要因素。密码偏爱性改造是提高外源基因表达量的重要手段。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种新的植 酸酶基因，使其符合毕赤酵母的密码偏爱性，能够在毕赤酵母中高效分泌表达。本发明所要 解决的技术问题之二在于提供一种该植酸酶基因的表达载体，并构建一种产此植酸酶的毕 赤酵母工程菌，使之高效分泌表达该植酸酶基因，并可通过高密度发酵生产植酸酶用于动 物饲料。为解决上述技术问题，本发明利用人工合成基因的方法，将大肠杆菌植酸酶appA 基因的密码子改造为符合毕赤酵母的密码偏爱性，为其在毕赤酵母中超水平表达奠定基 础，并构建高水平表达植酸酶的毕赤酵母工程菌。本发明所采取的技术方案之一是一种新 的植酸酶基因，其符合毕赤酵母的密码偏爱性，具有大小为1236bp的下列DNA序列1ATGCAATCTGAACCAGAATTGAAGTTGGAATCTGTTGTCATCGTCTCTAG
51ACATGGTGTTAGAGCACCAACCAAGGCCACCCAACTTATGCAAGATGTCA
101CCCCAGACGCTTGGCCAACCTGGCCAGTCAAGCTGGGTTGGTTGACACCT
151AGAGGTGGTGAGCTCATTGCTTACTTGGGTCACTACCAAAGACAGCGTCT
201TGTTGCCGACGGATTGTTGGCCAAGAAGGGTTGTCCACAATCTGGTCAAG
251TAGCTATTATTGCTGACGTCGACGAAAGAACCCGTAAGACAGGTGAAGCC
4
301TTCGCCGCCGGTCTTGCTCCTGACTGTGCCATTACCGTTCACACCCAAGC
351TGACACTTCTTCTCCAGATCCATTGTTCAACCCTTTGAAGACTGGTGTTT
401GCCAATTGGACAACGCTAACGTTACTGACGCTATCTTGTCCAGAGCTGGA
451GGATCCATTGCTGACTTCACCGGTCACAGACAGACTGCCTTCAGAGAGTT
501GGAAAGAGTTCTTAACTTCCCACAATCCAACTTGTGCCTTAAGCGTGAGA
551AGCAAGACGAATCCTGTTCCTTGACTCAAGCATTACCATCTGAGTTGAAG
601GTCTCCGCCGACAACGTCTCTTTGACCGGTGCTGTCAGCTTGGCTTCCAT
651GTTGACTAAAATCTTTCTTCTGCAACAAGCTCAAGGTATGCCTGAGCCAG
701GTTGGGGTAGAATCACCGACTCTCACCAATGGAACACCTTGTTGTCCTTG
751CACAACGCTCAATTCTACTTGCTGCAGAGAACTCCAGAGGTTGCTAGATC
801CAGAGCCACCCCATTGTTGGACTTGATCAAGACTGCTTTGACTCCTCACC
851CACCTCAAAAGCAAGCCTACGGTGTTACCTTGCCCACTTCTGTCTTGTTC
901ATTGCCGGTCACGATACTAACTTGGCAAATCTCGGCGGTGCTTTGGAGTT
951GAACTGGACTCTTCCTGGTCAACCTGATAACACTCCACCAGGTGGTGAGC
1001TCGTTTTCGAAAGATGGCGTAGACTATCTGATAACTCTCAATGGATTCAG
1051GTTTCGTTGGTCTTCCAAACTTTGCAGCAGATGAGAGACAAGACTCCACT
1101GTCTTTGAACACGCCTCCAGGAGAAGTCAAATTGACCTTGGCTGGATGTG
1151AAGAGAGAAATGCTCAGGGTATGTGTTCCTTGGCTGGTTTCACTCAAATT
1201GTTAACGAAGCTAGAATTCCAGCTTGTTCTTTGTAG。
本发明根据已报道的大肠杆菌植酸酶基因序列，按照毕赤丨酵母偏爱密码子表，把
编码植酸酶的密码子转换成毕赤酵母偏爱的形式。上述植酸酶基因通过以下途径合成首先人工合成16条寡聚核苷酸引物，即正向引物8条F1_F8，反向引物8条 R1-R8，长度分别在95 106nt之间，引物间含20 23bp的重复序列(见引物表1)。取引 物Fl和Rl各25pmol进行PCR反应，反应体积50 μ L，反应条件95°C 4min ；94°C 40s, 52°C 40s, 72°C 20s，共25个循环；72°C延伸7min。反应后取0. 1 μ L反应产物做为模板，以F2和 R2 为引物，进行第 2 次 PCR 反应，反应条件94°C 4min ；94°C lmin，52°C 30s, 72°C 30s，共 25 个循环；72°C延伸lOmin。依此类推，进行其余6个PCR反应，但每个反应的延伸时间增加 IOs0共连续进行8次PCR反应，合成具有上述基因序列的符合毕赤酵母密码偏爱性的植酸 酶基因。一种含有上述植酸酶基因的表达载体pKDN-Ι，通过以下途径获得设计引物Phy-F和Phy-R(见引物表1)，引物两端分别引入Eco RI和Not I酶切 位点；以上述合成的植酸酶基因作模板进行PCR扩增。琼脂糖凝胶回收PCR扩增产物，接着 进行Eco RI和Not I双酶切反应，然后再次凝胶回收酶切产物；将此酶切产物定向连接到 已Eco RI和Not I双酶切载体PPIC9K，则获得表达载体，命名为pKDN_l。一种含有上述表达载体pKDN-1的毕氏酵母菌，命名为Pichiapastoris KDN-I,已 保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 209130。其通过以下途径获得将载体pKDN-Ι酶切线性化后电击导入毕氏酵母菌GS115，筛选转化植酸酶基因高 拷贝数的重组毕赤酵母菌株，然后进行高密度发酵验证，最后获得高效表达植酸酶的毕赤 酵母工程菌。
表1合成植酸酶基因以及构建表达载体所用引物表
权利要求
一种新的植酸酶基因，其具有ID NO1所示的大小为1236bp的DNA序列，其符合毕赤酵母的密码偏爱性，编码具有ID NO2所示氨基酸序列的植酸酶。
2.根据权利要求1所述的植酸酶基因，其编码的植酸酶具有IDNO :2所示氨基酸序列， 该氨基酸序列不含植酸酶的信号肽序列，其编码的植酸酶为去信号肽的成熟蛋白，即N端 22氨基酸残基的信号肽被剔除。
3.一种含有权利要求1所述植酸酶基因的表达载体pKDN-1。
4.一种含有权利要求3所述表达载体pKDN-1的毕氏酵母菌，其含有权利要求1所述的 植酸酶基因，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 209130。
5.一种构建权利要求4所述保藏编号为CCTCC M 209130的毕氏酵母菌的方法，包括下 列内容A、首先人工合成16条寡聚核苷酸引物，即正向引物8条，反向引物8条，连续进行8次 PCR反应，合成具有权利要求1所述基因序列的符合毕赤酵母密码偏爱性的植酸酶基因；B、设计引物Phy-F和Phy-R，引物两端分别引入EcoRI和Not I酶切位点；以步骤A合 成的植酸酶基因作模板进行PCR扩增；琼脂糖凝胶回收PCR扩增产物，接着进行Eco RI和 Not I双酶切反应，然后再次凝胶回收酶切产物；将此酶切产物定向连接到已Eco RI和Not I双酶切载体PPIC9K，获得表达载体pKDN-Ι ；C、将载体pKDN-Ι酶切线性化后电击导入毕氏酵母菌GS115，筛选转化植酸酶基因高拷 贝数的重组毕赤酵母菌株，获得高效表达植酸酶的毕赤酵母工程菌。
6.根据权利要求5所述的构建毕氏酵母菌CCTCCM 209130的方法，其内容如下A、根据大肠杆菌植酸酶的CDS编码氨基酸全序列中、编码其在第23个氨基酸Gln处 经酶切后形成的分子量为44. 8kD、具有410个氨基酸残基的成熟蛋白质的序列，从第23位 Gln残基起设计符合毕赤酵母密码偏爱性的引物，合成16条寡聚核苷酸引物，即8条正向 引物Fl至F8，8条反向引物Rl至R8 ；取引物Fl和Rl各25pmol进行PCR反应，反应体积 50 μ L，反应条件:95V 4min ；94°C 40s, 52°C 40s, 72°C 20s，共 25 个循环；72°C延伸 7mi η ； 反应后取0. 1 μ L反应产物做为模板，以F2和R2为引物，进行第2次PCR反应，反应条件 950C 4min ；94°C lmin, 52°C 30s, 72°C 30s，共 25 个循环；72°C延伸 7min ；依此类推，进行其 余6个PCR反应，但每个反应的延伸时间增加IOs ；连续进行8次PCR反应，合成符合毕赤 酵母密码偏爱性的植酸酶成熟蛋白编码区DNA片段；B、设计引物Phy-F和Phy-R，引物序列如下Phy-F :5’ -AA }/GAATT(^ CAATCTGAACCAGAATTGAAG-3，.................EcoRI ；Phy-R :5，-AA \GCGGCCGdf CTACAAAGAACAAGCTGGAAG-3‘..........Not I ；ι以合成的植酸酶基因为模板，以Phy-F和Phy-R为引物进行PCR扩增；PCR条件为 950C 4min ；94°C 40s, 52°C 40s, 72°C lmin，共 30 个循环；72°C延伸 7min ；凝胶回收 PCR 产物 并以Eco RI和Not I双酶切；同样，以Eco RI和Not I双酶切pPIC9K ；然后把酶切后两个 双酶切产物连接获得重组表达质粒PKDN-I ；C、高效分泌表达毕赤酵母工程菌的筛选a.重组质粒pKDN-Ι的线性化重组质粒pKDN-Ι用Bgl II酶切电泳鉴定后，经乙醇沉 淀浓缩，测定DNA浓度，以3 μ g/ μ L浓度稀释质粒片段保存备用；b.毕赤酵母GS115感受态细胞的制备挑取GS115单菌落，在YPD培养基中30°C振荡 培养过夜，再转移到IOOmL YPD培养基中，培养至0D600 = 1. 5，冰浴IOmin, 4°C 5000rpm离 心3min，收集菌体；用预冷的无菌双蒸水洗涤菌体2次，然后重悬于ImL预冷的电泳缓冲液 中，该缓冲液含 ImM MgCl2, IOmM HEPES，250mM 蔗糖，pH 7. 8 ；c.电击转化在80μ L感受态细胞中加入5 μ L线性化重组质粒pKDN-Ι ；用Imm电击杯 在EMC830电转仪转化，其电击条件为300V，16ms ；最后涂布于匪平板培养，挑选重组菌株； 该MM培养基组分1. 34% YNB，4X10_5%生物素，0. 5%甲醇；d.筛选高拷贝重组转化子将尼龙膜转放在浸过预变性液的滤纸上孵育15min，该预 变性液为50mM EDTA, 2. 5% β -巯基乙醇，pH 9. 0 ；然后把尼龙膜转放在浸过酶解液的滤纸 上，37°C孵育4小时，该酶解液为lmg/ml Zymolyase 100T ；尼龙膜转放在浸过变性液的滤 纸上5min，该变性液为0. 5M NaOHU. 5M NaCl混合液；将尼龙膜转放在浸过中和液的滤纸 上5min，该中和液为1. 5M NaCUO. 5M Tris-Cl混合液；将尼龙膜转放在浸过2 X SSC (柠檬 酸三钠)的滤纸上5min ；然后室温干燥尼龙膜30min ；将尼龙膜置于紫外灯下照射4min ； 进行Southern杂交，筛选获得一个杂交信号强烈的菌种，将其命名为Pichia pastoris KDN-I，其保藏编号 CCTCC M 209130。
全文摘要
本发明公开了一种新的植酸酶基因，其具有ID NO1所示的大小为1236bp的DNA序列，其符合毕赤酵母的密码偏爱性，编码具有ID NO2所示氨基酸序列的植酸酶。并提供了一种含有该植酸酶基因的表达载体pKDN-1及利用表达载体pKDN-1转化的毕氏酵母工程菌，将其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 209130。还提供了一种构建毕氏酵母菌CCTCC M 209130的方法。本发明所提供的植酸酶基因，其符合毕赤酵母的密码偏爱性，能够在毕赤酵母中高效表达，所构建的高表达工程菌CCTCC M 209130进行高密度发酵时，酶活最高可达2000U/mL。
文档编号C12N1/19GK101955957SQ20091001774
公开日2011年1月26日 申请日期2009年8月21日 优先权日2009年8月21日
发明者岳寿松, 彭虹旎, 陈刚, 黄亦钧 申请人:青岛康地恩生物科技有限公司