桔梗花粉离体萌发液体培养基及利用其测定花粉活力的方法

专利名称：：桔梗花粉离体萌发液体培养基及利用其测定花粉活力的方法
技术领域：
：本发明属于植物花粉活力测定
技术领域：
，特别涉及一种桔梗花粉离体萌发液体培养基，以及基于该液体培养基的利用桔梗花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法。
背景技术：
：桔梗(户/a(ycocfowgra"^/7oraw(7ac^U.ZX:)属于桔梗科、桔梗属，为多年生双子叶草本植物，是一种药、食、赏兼用植物。桔梗根部可入药，其主要活性成分是皂甙，具有镇咳、抗炎、降血压、降血糖、减肥、抗肿瘤、提高人体免疫力等广泛的药理活性。桔梗嫩苗、根均可食用，在我国东北地区以及日本、韩国、朝鲜等东亚国家是一种常见蔬菜，具有很高的营养价值。桔梗花期长，花色鲜艳，有紫色、白色、黄色和粉色等多种；花冠钟形，合瓣花，近年还发现漏斗形花冠桔梗和重瓣桔梗2个变种，提高了桔梗的观赏价值。近年来，随着桔梗抗衰老、抑癌、抗虫杀菌和气味掩饰剂等功效相继被发现，促使对桔梗原材料的需求迅速增加，单靠野生桔梗资源已不能满足需求。在此情况下，各地普遍开展了桔梗野生种驯化和种质资源基础研究。丰富的种质资源是进行桔梗遗传研究和种质改良的物质基础，具有特异性状桔梗种质的研究鉴定及其保存是科学开展良种培育的前提。鉴于桔梗花粉作为桔梗遗传资源的主要载体，因此，进行桔梗花粉活力测定的研究，对桔梗种质资源保存与创新、优良品种的选育具有非常重要的理论和实践意义。桔梗为两性花，开花后花粉成熟并自花粉囊中散出附着在花药与柱头上，成熟的花粉粒具有一定的活力，在田间条件下其活力能保持一定时间，但随时间的推移其活力会发生一定的变化，了解桔梗开花后花粉活力在田间的变化规律，对桔梗杂交体系的建立以及桔梗传粉类型的花粉都具有十分重要的意义。目前，花粉活力测定的方法主要有显微镜形态观察法、染色法、离体萌发法等。形态观察法是依据不育花粉在生长过程中由于受到某些因素的影响，发育不完全或不良的花粉粒形态常常呈畸形，而正常花粉有规则的外形。桔梗正常花粉粒为正五边形或六边形，而不育花粉呈不规则形，根据形态可以鉴别花粉生活力。然而，桔梗花粉成熟后常常需要贮藏一段时间，贮藏过程中花粉活力会逐渐下降，由于桔梗正常花粉在贮藏过程中活力可能丧失，但形态并不发生明显变化；从而使得花粉粒形态观察法就不能鉴别贮藏后正常花粉活力变化情况。染色法是通过使用染色试剂对花粉粒进行染色，依据颜色变化判断花粉活力的高低，常用的染色试剂有I2-KI溶液和氯化三苯基四氮唑(TTC)等。用I2-KI溶液对发育良好的桔梗成熟花粉进行染色，花粉粒而没有被染成蓝色，而呈浅黄褐色，表明I2-KI溶液染色法不能测定桔梗花粉活力；而TTC染色法测定花粉活力实验重复性较差，会造成很大的实验误差，也不能准确测定花粉的实际活力高低。花粉离体萌发与花粉管生长测定结果较为稳定，更能反应花粉活力的实际状况。但花粉离体萌发需要适宜的培养基，常用的培养基基本成分是糖和硼，蔗糖浓度一般为10%~20%，硼酸为0.001%~0.005%，pH5.5~6.5。不同植物花粉萌发需要的培养基种类和浓度不同，二核型花粉较易萌发，在一般基本培养基上培养即可，而三核型花粉较难萌发，要在基本培养基的基础上添加其它促进花粉萌发的元素，如Ca2、Mg2+，K2+，PEG等成分。近年来，人们对药用植物花粉离体萌发和花粉管生长进行了较多研究，赵宏波等认为PEG对菊花、梅花花粉离体萌发生长具有显著促进作用；牛东玲等报道了肉苁蓉花粉离体萌发的适宜培养基，陈和明等研究了黄藤花粉离体萌发条件及低温贮藏对花粉活力的影响。然而，关于桔梗花粉离体萌发与花粉管生长的研究国内外尚未见报道。
发明内容本发明解决的问题在于提供一种桔梗花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，在确定桔梗花粉离体萌发培养体系的基础上，对桔梗花粉离体培养，可靠、有效的测定桔梗花粉活力。本发明是通过以下技术方案来实现一种桔梗花粉离体萌发液体培养基，以蒸馏水为溶剂，其包含的组分为ME3、BK、100g'L"的蔗糖和150g.U1的PEG,PH为5.8;所述ME3的组成为MgS04'7H20370mg'I/1、KN03950mg'U1、KH2P0485mg'U1、CaCl'21120880mg'I/1、NH4N03412.5mg'I/1、KC1175mg.1/1、H3B0350mg'L"、Na2EDTA7,45mg.L-1、FeS04'7H200.025mg.1/1、KI0.83mg.L-1、Na2Mo04.2H200.25mg.1/1、CuS04.5H200.025mg.L-1、CoCl2.6H200.025mg'U1、VB11.0mg'U1和VB61.0mg.L";所述BK的组成为H3B03100mg'U1、Ca(N03)2'4H20300mg七"、MgS04'7H20200mg,L"和KN03100mg.U1。本发明提供的利用桔梗花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，包括以下步骤1)花粉采集选取发育正常、无病虫危害的健壮植株，于桔梗盛花期选取正开花的花序，连同枝叶采取，移入盛有清水的容器瓶，室内放置待花蕾自然开放，花粉从花药中散出，收集花粉；2)花粉离体萌发及花粉管生长将花粉均匀撒在桔梗花粉离体萌发液体培养基上，光照条件下3(TC恒温培养;所述的桔梗花粉离体萌发及花粉管生长液体培养基为:ME3培养基+BK培养基+100g七"的蔗糖+150g七—1的PEG,PH为5.8;花粉离体萌发培养10min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径后，花粉管开始快速生长；3)花粉活力的测定离体培养1.5h后，以花粉管长度大于花粉离直径为花粉萌发标准；每次随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率，重复3次取平均数作为花粉萌发率测定结果，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例；同时，用显微测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10个花粉，每处理共测90个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、桔梗花粉在本发明提供的桔梗花粉离体萌发液体培养基上，3(TC光照条件下培养，桔梗花粉萌发率可达到96.0%，花粉管也能得到较好生长；由于添加了PEG，桔梗花粉管生长较直，便于观察测量。2、利用桔梗花粉离体萌发与花粉管生长测定技术测定花粉活力测定结果稳定可靠，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例，花粉管生长的观察与测量反应花粉粒生理状况的优劣，桔梗花粉离体萌发与花粉管生长测定技术为桔梗花粉活力的测定提供了一种可靠、有效的方法。图1为桔梗花粉离体培养不同时间的花粉萌发率和花粉管的统计图；具体实施例方式本发明提供一种桔梗花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，在确定桔梗花粉离体萌发培养体系的基础上，对桔梗花粉离体培养，测定花粉的萌发率和花粉管的生长情况，可靠、有效的测定桔梗花粉活力。下面结合附图对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。1、桔梗花粉的采集桔梗花粉于2008年7月中旬采自陕西商洛香菊制药公司药用植物园2年桔梗群体，采集方法为选取发育正常、无病虫危害的健壮植株，于盛花期上午7:008:00选取正开花的花序，连同一段枝叶一同将花序采下，迅速移入盛有清水的三角瓶中，放置室内待花蕾自然开放，花粉从花药中散出，收集花粉备用。2、花粉离体萌发培养条件的筛选2.1花粉离体萌发培养基的筛选培养基种类对植物花粉离体萌发有较大影响，不同植物花粉萌发的适宜培养基不同。设置3种不同的培养基分别为(1)BK+150g-U1PEG4000+100g.L"蔗糖；(2)ME3+150g'U1PEG4000+100g.1/1蔗糖；(3)BK+ME3+150g.L"PEG4000+100g.！/1蔗糖；其中，ME3组成为(mg.L"):MgSO4.7H2O370mg.L-1、KN03950mg'L國1、KH2P0485mg'L"、CaCl'21120880mg'I/1、NH4N03412.5mg.L-1、KC1175mg.L"、H3BO350mg.L匿1、Na2EDTA7.45mg'L"、FeS04'7H200.025mg.L"、KI0.83mg.L-1、Na2Mo04.2H200.25mg.L歷1、CuS04.5H200.025mg.L"、CoCl2.6H200.025mg'L"、VB11.0mg'I/1和VB61.0mg.L";所述BK的组成为H3B03100mg.L"、Ca(N03)2.4H20300mg'I/1、MgS04.7H20200mg.L"和KN03100mg丄"。将花粉分别以相同的光照、温度条件下在上述3种培养基上培养，分析培养基对花粉离体萌发的影响;花粉的萌发率和花粉管的长度的测量方法为以花粉管长度大于花粉离直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率；用显微测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10个花粉，每处理共测90个花粉管长度，计算其平均值；结果如表1所示，桔梗花粉在设计的3种培养基溶液中均可萌发，但花粉萌发率和花粉管生长速度存在显著差异，其中在150g七"PEG+100g丄"蔗糖+ME3+BK培养基上桔梗花粉能够较好萌发，其萌发率可达到96.0%，花粉管也能得到较好生长。表1培养基对桔梗花粉萌发率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.2PEG浓度筛选PEG4000是一种高分子量化合物，主要起到渗透调节作用。把新鲜花粉分别均匀散布在添加了0g丄'1、100g'L"、150g1/1、200g1/1、250g七"的PEG4000的BK培养基(所述0g丄—1为不添加PEG)中，盖上盖玻片于光照培养箱培养o结果如表2所示，ME3+BK+100g丄"蔗糖培养基中加入不同浓度的PEG4000，可明显提高桔梗花粉萌发率，其中添加150g乇"PEG4000效果最为显著，花粉萌发率达到96.0%;低浓度PEG(lOOg.L-^SOOg.L")促进花粉管生长，且随浓度增加，促进作用逐渐减弱，高浓度PEG(》250g丄")抑制花粉管生长；在显微观察时还发现，在添加了PEG的培养基中，桔梗花粉管生长较直，而未加PEG的培养基花粉管生长弯曲，常交织在一起，不便观察测量。表2不同浓度PEG对花粉萌发生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>10084.383.379.082.2520.7501.5463.0495.115099.690.997.496.0446.7552.6441.9480.420076.686.189.684.1240.0277.8270.7262.925085.181.382.883.0160.0277.4317.0251.52.3蔗糖浓度试验蔗糖是一种渗透调节物质，同时也是花粉管生长的能源物质。在150g丄"PEG4000+BK的培养基中分别增加50g七"、100g丄'1、150g丄"、200g-L—1的蔗糖，比较不同浓度的蔗糖对花粉萌发和花粉管生长的影响。结果如表3所示，ME3+BK+150g/LPEG培养基中不同浓度蔗糖对桔梗花粉萌发率和花粉管生长影响不同，低浓度蔗糖(《100g，L")对花粉萌发和花粉管生长具有明显促进作用，而高浓度的蔗糖(》150g丄'1)可明显抑制花粉萌发和花粉管生长，且随着蔗糖浓度的增加，受到抑制程度越明显。在含有100g丄"蔗糖的ME3+BK+150g/LPEG培养基上桔梗花粉生长最好，培养3h后，其花粉萌发率和花粉管长度分别达到97.2%和531.6pm。表3不同浓度蔗糖互作对花粉萌发生长的影响蔗糖浓度(g.L")萌发率(％)花粉管长度Oun)ABC平均值BC平均值A064.479.071.371.6407.3427.3392.095072.389.081.580.9493.7633.0364.7497.110096.097.098.697.2618.7478.3497.7531.615038.185.086.970.0180.7301.0347.7276.42003.16.16.95.4153.3164.6181.8166.62.4PH梯度试验在PH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的BK+150g.L"PEG6000+100g.L-'蔗糖培养基上培养桔梗新鲜花粉，检测培养基不同PH对桔梗花粉萌发和花粉管生长的影响。结果如表4所示，培养基PH值变化对桔梗花粉萌发和花粉管生长均有显著影响，PH值在4.57.0范围内，随PH值的增加，花粉萌发率和花粉管长度均呈"单峰"曲线变化，即在PH值较小时花粉萌发率和花粉管长度随PH的升高而增加，PH5.5时达到最大，之后开始下降。表明培养基H+浓度过高或过低均不利于桔梗花粉萌发生长。在PH值在4.5-7.0范围内，筛选培养基最适PH的基础上，又设置PH值为5.4、5.6、5.8三种处理，最后结果表明PH5.8为桔梗花粉离体萌发生长的培养基最适酸碱度。表4不同PH值对花粉萌发生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.5培养温度和培养时间试验在20。C、25°C、30°C、35°C、40°C5种不同温度条件下，用150g.L"PEG6000+100g'L'1蔗糖+BK作为花粉萌发培养基，分别培养15min、30min、lh、1.5h、2h、3h、4h、6h、7.5h后观察花粉萌发和花粉管生长情况，筛选最适培养温度和培养时间。结果如表5所示，可以看出温度对桔梗花粉萌发生长具有显著影响，在2(TC3(TC范围，萌发率和花粉管长度随温度的升高而增大，当温度进一步升高时，花粉萌发率有所下降，生长也减缓；表明桔梗花粉萌发的最适培养温度为3(TC，再次温度下培养桔梗花粉萌发率和花粉管长度达到最大值分别为99.7%和654.6pm。表5培养温度对花粉萌发生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.6不同培养时间下桔梗花粉离体萌发及花粉管生长:将新鲜的桔梗花粉匀撒上在PH为5.8的BK+150g丄"PEG4000+100g-U1蔗糖的培养基上，置于底部垫有双层湿滤纸的培养皿中，盖紧盖子并放入恒温培养箱内30。C培养，培养后5min、10min、15min、30min、45min、lh、2h、3h、4h、6h、7.5h定时观测花粉管生长情况。桔梗花粉萌发生长情况如图l所示，其中，横坐标为培养时间，左边纵坐标表示花粉萌发率(％)，右边纵坐标表示花粉管长度(pm);桔梗花粉10min开始萌动，15min花粉管从花粉孔中突出，20min花粉管长度己超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长，在开始培养的lh随培养时间的延长桔梗花粉萌发率迅速提高，lh后多数有活力花粉均已萌发，1.5h达到最大，之后萌发率不再增加；花粉管长度在初始培养的1.5h之前快速生长，之后花粉管生长逐渐停顿，4h花粉管生长交织在一起，花粉管顶端开始膨大，5h许多花粉管顶端破裂，内容物放出。因此，在桔梗花粉在PH为5.8的BK+150g丄"PEG4000+100g丄"蔗糖的培养基上，3(TC恒温光照条件下离体培养1.5h后，测量花粉的萌发率和花粉管的长度，能够稳定有效的反应桔梗花粉的活力。3.离体萌发培养测定桔梗花粉活力1)待测花粉处理-待测材料为陕西香菊制药公司商洛药源基地的两年生桔梗栽培群体，2008年7月中旬于桔梗开花的盛花期间，选择生长发育健壮无病虫单株挂牌标记，次日早晨6:00选择即将开放的花蕾套袋，并于11:30摘取当天套袋开放的花朵10朵，以后每天11:30采集开花后l天、2天、3天、4天、5天、6天的套袋花朵10朵，带回实验室进行花粉萌发率、花粉管生长测定。2)花粉离体萌发及花粉管生长吸取23滴花粉培养液(ME3+BK+100g丄'1的蔗糖+150g丄.1的PEG，PH为5.8)滴入凹形载玻片凹槽中，将采集到的桔梗花粉混合均后，用毛笔蘸取适量匀撒上在上述培养基上，用牙签搅匀，将凹形载玻片置于底部垫有双层湿滤纸的培养皿中，盖紧盖子并放入3(TC恒温培养箱内光照培养；3)3(TC恒温光照条件下离体培养1.5h后，测量花粉的萌发率和花粉管的长度。花粉萌发和花粉管长度检测以花粉管长度大于花粉离直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率；同时用显微测微尺测量花粉管长度Oim),每视野随机测量10个花粉，每处理共测90个花粉管长度，计算其平均值。具体如表6所示，结果说明当天的花粉活力最好，包括萌发率和离题花粉管长度在6天的检测中结果最好；随着时间增加花粉的活力逐渐下降，尤其是第6天与前5天相比，下降尤为明显。表6桔梗花粉的活力在16天的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1、一种桔梗花粉离体萌发液体培养基，其特征在于，以蒸馏水为溶剂，其包含的组分为ME3、BK、100g·L-1的蔗糖和150g·L-1的PEG，PH为5.8；所述ME3的组成为MgSO4·7H2O370mg·L-1、KNO3950mg·L-1、KH2PO485mg·L-1、CaCl·2H2O880mg·L-1、NH4NO3412.5mg·L-1、KCl175mg·L-1、H3BO350mg·L-1、Na2EDTA7.45mg·L-1、FeSO4·7H2O0.025mg·L-1、KI0.83mg·L-1、Na2MoO4·2H2O0.25mg·L-1、CuSO4·5H2O0.025mg·L-1、CoCl2·6H2O0.025mg·L-1、VB11.0mg·L-1和VB61.0mg·L-1；所述BK的组成为H3BO3100mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O300mg·L-1、MgSO4·7H2O200mg·L-1和KNO3100mg·L-1。2、一种利用桔梗花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于，包括以下步骤-1)花粉釆集选取发育正常、无病虫危害的健壮植株，于桔梗盛花期选取正开花的花序，连同枝叶采取，移入盛有清水的容器瓶，室内放置待花蕾自然开放，花粉从花药中散出，收集花粉；2)花粉离体萌发及花粉管生长将花粉均匀撒在桔梗花粉离体萌发液体培养基上，光照条件下3(TC恒温培养；所述的桔梗花粉离体萌发及花粉管生长液体培养基为ME3培养基+BK培养基+100g'L"的蔗糖+150g'U1的PEG,PH为5.8;花粉离体萌发培养lOmin后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长；3)花粉活力的测定离体培养1.5h后，以花粉管长度大于花粉离直径为花粉萌发标准；每次随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率，重复3次取平均数作为花粉萌发率测定结果，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例；同时，用显微测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10个花粉，每处理共测卯个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。全文摘要本发明公开了一种桔梗花粉离体萌发液体培养基及利用其测定花粉活力的方法，在确定桔梗花粉离体萌发培养体系后，对桔梗花粉离体培养，可靠、有效的测定桔梗花粉活力。所述的花粉离体萌发液体培养基，以蒸馏水为溶剂，其包含的组分为ME₃、BK、100g·L^-1的蔗糖和150g·L^-1的PEG，pH为5.8；将花粉均匀撒在桔梗花粉离体萌发培养基上，光照条件下30℃恒温培养；离体培养1.5h后，测定花粉离体萌发与花粉管生长反应花粉的活力以花粉管长度大于花粉离直径为花粉萌发标准，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例；测量花粉管长度，计算平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。文档编号C12N5/04GK101633902SQ20091002368公开日2010年1月27日申请日期2009年8月25日优先权日2009年8月25日发明者刘凤霞,刘自刚,呼天明,杨亚丽,薛粉丽申请人:商洛学院