专利名称：：一种表达外源蛋白的表达系统的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种表达系统。本发明具体涉及一种由质粒pAmk与大肠杆菌组成的表达系统。本发明具体涉及由pAmk质粒与大肠杆菌组成的表达系统表达外源蛋白的表达方法。
背景技术：
：在生物技术与生物工程领域中，通过将外源基因克隆于表达载体上，转入到一个适当的宿主细胞中，来达到表达与生产重组蛋白的目的。应用到工业生产中，通过发酵可以达到大量生产外源蛋白，达到工业化的水平。在表达系统的选择上，有细菌，酵母，植物细胞，动物细胞等，而大肠杆菌表达系统，以其简易，迅速，培养廉价等优点，一直以来是表达各种外源蛋白的首选。大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统。随着分子生物学技术的不断发展，大肠杆菌表达系统也得到不断的发展和完善。与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等特点。在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。而在许多种以大肠杆菌为表达宿主菌的表达系统中，研究者们一直在寻找，更加简单，方便，产量高，适合于发酵罐等大规模生产的表达外源蛋白的表达系统。致力于寻找更高效表达的策略。影响外源基因在大肠杆菌中的高效表达因素有很多，其中有一点是宿主细胞对密码子的偏爱性，如果差异性过大，稀有密码子较多的话，其表达量较低。所以如果外源基因为真核基因，或者其他来源的稀有密码子较多的基因，按照本表达系统的密码子使用频率，根据表达系统对密码子的偏爱对基因进行重新设计，构建表达工程菌株，可以更有利于外源基因在表达系统中的表达。将外源基因直接克隆于质粒载体pAmk融合启动子的下游，通过诱导，发现宿主菌并没有表达外源蛋白。但是在启动子3'端下游保留一段基因，再克隆入外源基因，并在外源基因的5'端连接编码导肽的DNA序列。经检测，发现有外源蛋白的表达。所以我们对这段位于启动子下游的基因序列进行研究。发现在启动子下游保留一种基因序列形式更适合于外源蛋白的表达。以表达胰岛素原为例，将胰岛素原基因序列5'端加入编码导肽的DNA序列，克隆于启动子3'端下游，构建表达质粒。将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得工程菌，通过乳糖诱导，经SDS-PAGE检测菌体蛋白，发现表达的胰岛素原包涵体蛋白量占菌体总蛋白量的36%-38%。通过在发酵罐(30L)中扩大发酵培养基因工程菌。培养33小时，OD值达到150时结束发酵收集菌体，获得的湿菌体量约为200g/L，通过细胞破碎，离心获得包涵体湿重约为18g/L。超过国内现有文献报道水平(李红霞，余蓉，李晓红.人胰岛素原在基因工程菌中的高效表达[J].华西药学杂志，2005，20(1):014017)
发明内容本发明的一个目的是提供一种适用于表达外源蛋白的表达质粒载体pAmk。本发明的一个目的是提供一种基因序列形式Xfa)ATGAGTY其中X代表位于质粒pAmk启动子下游的一个包含n个碱基DNA序列，n的取值为1-150。^mAQI编码两个氨基酸的导肽序列MS，Y代表位于MS后编码一个氨基酸或一个多肽的DNA序列。上述序列形式中n优选取值为98，X(n)的具体的优选形式为GCCTGGTCGGCAGGGTACGTTTGAATTATTCATAAGAGGAATACGTT这种基因序列形式对外源基因在本表达系统中的表达起着重要的作用。结合以下的优选实例对段基因序列形式做进一步的说明。优选实例l，构建表达质粒pAmk-MS32-proinsulin:其中n取98，X的具体形式为GCCTGGTCGGCAGGGTACGTTTGAATTATTCATAAGAGGAATACGTT将编码N端带32个导肽的胰岛素原序列克隆于上述序列下游，构建表达质粒pAmk-MS32-proinsulin，通过诱导，检测到宿主菌中有胰岛素原的包涵体表达。其中，32个导肽的序列为MSLNTSGLGASTMQISIGGAGGNNGLLGTHMF，即为ATGAGTY的一种优选形式所编码的多肽序列。优选实例2，构建表达质粒pAmk-MS16-proinsulin:方法如例1，将例1中的32个导肽序列，换成16个导肽序列，构建表达质粒pAmk-MS16-proinsulin，通过诱导，检测到宿主菌中有胰岛素原的包涵体表达。其中，16个导肽的序列为MSLNTSGLGASTMQIS，即为ATGAGTY的一种优选形式所编码的多肽序列。优选实例3，构建表达质粒pAmk-MS8-proinsulin:方法如例1，将例1中的32个导肽序列，换成8个导肽序列，构建表达质粒pAmk-MS8-proinsulin，通过诱导，检测到宿主菌中有胰岛素原的包涵体表达。其中8个导肽的序列为MSLNTSGL，即为ATGAGTY的一种优选形式所编码的多肽序列。优选实例4，构建表达质粒pAmk-MS4-proinsulin:方法如例1，将例1中的32个导肽序列，换成4个导肽序列，构建表达质粒pAmk-MS4-proinsulin，通过诱导，检测到宿主菌中有胰岛素原的包涵体表达。5其中4个导肽的序列为MSLN，即为ATGAGTY的一种优选形式所编码的多肽序列。优选实例5，构建表达质粒pAmk-MS-proinsulin:方法如例1，将例1中的32个导肽序列，换成3个导肽序列，构建表达质粒pAmk-MSR-proinsulin，通过诱导，检测到宿主菌中有胰岛素原的包涵体表达。其中2个导肽的序列为MSR，即为ATGAGTY的一种优选形式所编码的多肽序列。优选实例6，构建表达质粒pAmk-23-proinsulin:方法如例1，将例1中的32个导肽序列，换成23个导肽序列，诱导后，通过检测，并没有发现有胰岛素原的表达。其中23个导肽的序列为MGDEIIHLTDFDVSLALTQTGSK从上述的几个优选实例中，我们得到了一个结论是，在进行外源蛋白的表达时，将外源基因克隆入pAmk时在启动子下游保留一段碱基序列的距离，并且至少保留两个导肽的序列MS所以在融合启动子下游保留的基因序列形式为Xfa)ATGAGTY其中X代表一个包含n个碱基DNA序列，n的取值为1-150。n优选取值为98，X(n)具体形式为TCACACAGGAAACAGCTGGCGCGCCCAGCTTCGGCATGGCACGTTTGACGTGCCTGGTCGGCAGGGTACGTTTGAATTATTCATAAGAGGAATACGTT。ATGAGT编码两个氨基酸的导肽序列MS，Y代表位于MS后编码一个氨基酸或一个多肽的DNA序列。如在例l，2，3，4，5中。Y分别代表了编码短肽，LNTSGLGASTMQISIGGAGGNNGLLGTHMF，LNTSGLGASTMQIS，LNTSGL，LN，以及R的DNA序列。本发明的一个目的是提供表达质粒pAmk转化的宿主细胞大肠杆菌。其中宿主细胞大肠杆菌优选为BL21(DE3)本发明的一个目的在于提供与本表达系统相应的宿主菌的密码子使用频率分析。本发明的目的还在于提供运用通过本表达系统构建的工程菌株生产外源蛋白的方法。图1为pAmk-MSR-proinsulin表达质粒的构建过程。图2为SDS-PAGE电泳检定图其中泳道1为阴性对照，DE3菌体蛋白图谱。泳道2和泳道3为基因工程菌的菌体蛋白电泳图。图3为对构建的表达质粒pAmk-MSR-proinsulin进行测序得到的测序报告。以下结合具体实例对本发明作进一步的说明，以表达外源蛋白胰岛素原为例来具体描述此表达系统的使用方法与特点，包括表达质粒构建，诱导表达外源蛋白等方面。具体实施例方式实施例1表达质粒pAmk-MSR-proinsulin的构建1.1质粒与菌株pAmk全长5.59Kb，启动子为由脂蛋白启动子和乳糖启动子构成的融合启动子，脂蛋白终止序列，链霉素抗性，质粒由本实验室构建。pET28a-23DT-proinsulin表达质粒，其中含有胰岛素原的基因序列，抗性为卡那霉素，由本实验室构建。菌株为DH5a，BI21(DE3)，均为本实验室保藏。1.2工具酶及试剂限制性内切酶AscI，Ncol，T4连接酶，购于TAKARA公司。PfoDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶购于南京金思特公司，质粒抽提试剂盒，PCR产物纯化试剂盒，DNA胶回收试剂盒购于上海生工生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。引物由南京金思特公司合成。1.3载体质粒的准备将本实验室构建的携带有pAmK的DH5a与携带有pET28a-23DT-proinsulin的DH5a分别接种到含有链霉素(25iig/ml)和卡那霉素(25yg/ml)的LB培养基中，培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒，用灭菌的双蒸水溶解洗脱。1.4载体质粒的酶切反应将抽提的质粒pAmK依次进行AscI和NcoI酶切，酶切产物通过琼脂糖电泳回收5.21Kb的载体片段，并通过DNA胶回收试剂盒进行纯化。1.5通过PCR扩增外源基因片段将外源蛋白proinsulin基因插入到pAmk的启动子下游导肽MSR后端，首先要得到MSR-proinsulin的基因片段。具体通过以下步骤得到该片段。1.5.1以pAmk为模板，设计引物，扩增pAmk中AscI酶切位点与表达导肽MSR之间的片段。将其命名为fragment-MSR。上游引物a，(20bp)5'GGAATTGTGAGCGGATAACA3'下游引物b，(25bp)5'AAAACGACTCATAACGTATTCCTCT3，使用PfuDNA聚合酶扩增，扩增条件为94t:，45s、53°C，45s、72°C，30s。共30个循环。PCR产物进行琼脂糖电泳，在紫外灯下回收130bp左右的条带，DNA胶回收试剂盒纯化目的条带。1.5.2以本实验室构建的pET28a-23DT-proinsulin为模板，设计引物，扩增pET28a-23DT-proinsulin中胰岛素原与NcoI酶切位点之间片段。将其命名为fragment-proinsulin上游引物c，(25bp)5'ATGAGTCGTTTTGTCAATCAGCACC3，下游引物d，(21bp)5'CCGCCATGGCGCTTTTGATCC3'使用PfuDNA聚合酶扩增，扩增条件为94t:，45s、68°C，120s。二步PCR，共30个循环PCR产物进行琼脂糖电泳，在紫外灯下收580bp左右的条带，DNA胶回收试剂盒纯化目的条带。1.5.3重叠区延伸法获得融合基因由于下游引物b的5'端与上游引物c的5'端有12个碱基的互补，所以以fragment-MSR与fragment-proinsulin为模板，通过PCR在退火时可以使fragment-MSR基因的单链与fragment-proinsulin基因的单链配对，通过DNA聚合酶的作用，得到将fragment-MSR与fragment-proinsulin连接的片段。命名为fragment-MSR-proinsulin。使用PfuDNA聚合酶扩增，扩增条件为94t:，45s、57°C，50s、72°C，80s。共30个循环。PCR产物进行琼脂糖电泳，在紫外灯下回收710bp左右的条带，DNA胶回收试剂盒纯化目的条带。1.6转化与筛选扩增得到的fragment-MSR-proinsulin片段两端分别含有AscI与NcoI酶切位点，将经AscI与NcoI酶切后的pAmk载体片段与经AscI与NcoI酶切后的fragment-MSR-proinsulin片段通过14连接酶进行连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5a中，涂布于含有链霉素的LB平板(链霉素浓度为25iig/ml)过夜培养。得到转化子，挑取转化子，培养，提取质粒，以质粒为模板通过PCR来筛选阳性转化子。采用扩增fragment-MSR片段的上游引物a，与扩增fragment-proinsulin片段的下游引物d，用于PCR反应筛选阳性克隆，引物序列如下上游弓I物(20bp)5，GGAATTGTGAGCGGATAACA3，下游引物(21bp)5'CCGCCATGGCGCTTTTGATCC3'采用TaqDNA聚合酶，PCR反应条件为94°C，45s、57°C，50s、72°C，80s。共30个循环。PCR产物进行琼脂糖电泳，阳性克隆条带位于710bp左右。我们合成了测序引物5'GGAATTGTGAGCGGATAACA3'，对阳性克隆进行DNA序列测定(南京金思特公司)，测序结果表明，我们构建的表达质粒pAmk-MSR-proinsulin，与我们预期相同，即将MSR-proinsulin的序列克隆入质粒pAmk中。质粒的构建过程见图1实施例2工程菌的构建与诱导表达2.1工程菌株的构建将表达质粒pAmk-MSR-proinsulin转化入宿主菌BL21(DE3)中，涂布LB平板(链霉素的浓度为25iig/ml)，过夜培养，获得转化子。2.2外源蛋白的表达与电泳分析取例2.1中获得的转化子单菌落接入到5毫升LB培养基中(其中链霉素的浓度为25iig/ml)，37度180rpm，其间添加乳糖，过夜培养。取200ul菌液，5000rpm离心20分钟，弃上清，菌体沉淀中加入60ul蒸馏水重悬，加入1X载样缓冲液，在沸水浴中放置5分钟后进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结果见图2。其中泳道1为阴性对照，为BL21(DE3)菌体蛋白图谱。泳道2和泳道3为基因工程菌的菌体蛋白电泳图。通过软件分析，胰岛素原表达量约占菌体总蛋白量的35%以上描述的具体实施方式在于阐述本发明的最佳实施方式而不是以任何形式限制本发明。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本发明专利申请的权利要求范围之内。序列表<110>上海一就生物医药有限公司<120>—种表达外源蛋白的表达系统<160>10<210>1<211>98<212>DNA<213>人工序列<220><223>位于融合启动子与起始密码子之间的DNA序列的一种优选形式。<400>1tcacacaggaaacagctggcgcgcccagcttcggcatggcacgtttgacgtgcctggtcg60gcagggtacgtttgaattattcataagaggaatacgtt98<210>2<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>位于胰岛素原N端的32个导肽序列。<400>2MetSerLeuAsnThrSerGlyLeuGlyAlaSerThrMetGinlie151015SerlieGlyGlyAlaGlyGlyAsnAsnGlyLeuLeuGlyThrHis202530MetPhe<210>3[O川]<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>〈223〉位于胰岛素原N端的16个导肽序列。<400>3MetSerLeuAsnThrSerGlyLeuGlyAlaSerThrMetGinlie151015Ser<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>位于胰岛素原N端的8个导肽序列。<400>4MetSerLeuAsnThrSerGlyLeu15<210>5<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>位于胰岛素原N端的4个导肽序列。<400>5MetSerLeuAsn1<210>6<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223>位于胰岛素原N端的23个导肽序列。<400>6MetGlyAspGlulielieHisLeuThrAspPheAspValSerLeu151015AlaLeuThrGinThrGlySerLys20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>扩增片段fragment-MSR所设计的5'引物。<400>7ggaattgtgagcggataaca20<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列10<220><223>扩增片段fragment-MSR所设计的3'引物。<400>8aa^cgactcataacgtattcctct25<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>扩增片段fragment-proinsulin所设计的5'引物。<400>9atgagtcgttttgtcaatcagcacc25<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>扩增片段fragment-proinsulin所设计的3'引物。<400>10ccgccatggcgcttttgatcc211权利要求提供一种表达外源蛋白的表达载体质粒pAmk。2.按照权利要求1所述的表达载体质粒pAmk，其特征在于包含由脂蛋白启动子(plpp)和乳糖启动子(P01ac)组成的融合启动子。3.按照权利要求1所述的表达载体质粒pAmk，其特征在于包含位于权利要求2中融合启动子3'端下游的一段基因序列形式。4.按照权利要求3中所述的基因序列形式，其具体形式为Xfa)ATGAGTY其中X代表位于权利要求2中所述的启动子下游的一个包含n个碱基DNA序列，n的取值为1-150。ATGAGT编码两个氧基酸的导肽序列MS，Y代表位于MS后编码一个氨基酸或一个多肽的DNA序列。5.按照权利要求1所述的表达载体质粒pAmk，其特征在于包含脂蛋白终止序列(lpptranterm)。6.按照权利要求1所述的表达载体质粒pAmk，其特征在于包含链霉素抗性基因(str)。7.按照权利要求1所述的表达质粒载体pAmk，其所转化的宿主菌为大肠杆菌。8.将外源基因克隆入权利要求1所述的载体质粒pAmk，将表达质粒转化入权利要求7所述的大肠杆菌中，诱导工程菌表达外源蛋白的方法。9.按照权利要求7所述的宿主菌，对其密码子使用频率进行分析，结果见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>全文摘要本发明提供了一种表达质粒pAmk，以及在表达质粒中位于融合启动子下游一种基因序列形式。以通过pAmk表达外源蛋白胰岛素原(proinsulin)为例，介绍本发明表达系统的特点。提供以起始质粒pAmk建构表达质粒、转化入表达宿主菌、通过乳糖诱导表达生产外源蛋白的方法。文档编号C12P21/02GK101691578SQ20091003004公开日2010年4月7日申请日期2009年3月31日优先权日2009年3月31日发明者侯景,刘景晶,刘素丽,刘言华,孔婧,张笑岩,杨亚男,范豪,鲁勇申请人:上海一就生物医药有限公司