专利名称：一种重组人胰岛素及其类似物的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域。更具体地，本发明提供一种新型N-端前导肽序列的人胰 岛素原或其类似物分子(PreproinsuUn)，及一种利用该分子生产人胰岛素的方法，以及有关的 表达载体与丄程细胞的构建、人胰岛素原的表达和纯化工艺。
背景技术：
糖尿病是仅次于心血管和肿瘤的第三大致死疾病，现今世界上已有2亿糖尿病患者，而 且每年新增约600万新病例，每年死于糖尿病及相关并发症者达到320万(2006年6月美国 糖尿病年会报告)。胰岛素从20世纪20年代用于治疗糖尿病，现在仍是无法替代的糖尿病特 效药，而且在治疗中使用胰岛素的剂量为mg水平。每个I型糖尿病病人每天需要用胰岛素 1.4-2.1mg，II型糖尿病患者对胰岛素也有相当大的需求，导致发达国家每年要消耗胰岛素4600 公斤。随着糖尿病患者人群的扩大和胰岛素用药方式的多样化(口服给药、肺部给药和口腔 喷雾给药等)，胰岛素的用量迅速增加。因此，提高胰岛素的产量，降低胰岛素的生产成本， 满足广大糖尿病患者用药的需求，不仅具有重要的经济意义，而且具有重要的社会意义。
现有技术
重组人胰岛素是人类使用基因工程的方法生产的第一个生物工程药物，并成功上市。从 国内国际市场的发展趋势来看，重组人胰岛素已逐步取代用提取法制备的动物胰岛素。
目前重组人胰岛素及其类似物的生产采用了两套系统，其一是用酵母系统(CN1414974A; CN1873006A; CN1125081C); 其二是用大肠杆菌系统(；CN1163600C; CN1011073006A; JuanA.Asenjo， CRCPress, 1990)。酵母系统采用了分泌人胰岛素原类似物的方式，分泌出来的人胰岛素前体己具有了天然的二硫键及正确的N-端。缺点在于酵母菌生长满，导致生产周 期长，且表达水平很低。应用大肠杆菌表达重组人胰岛素生产的方式主要包括三种方式一 种是美国礼来公司1982年采用的重组大肠杆菌分别表达胰岛素的A链和B链，表达产物经 溴化氰(bromine cyanide, CNBr)切下融合导肽片段后，得到的A链和B链经纯化后再进行 复性，最后得到有活性的重组人胰岛素。由于该方式的复性率只有10%左右，采用这条工艺 生产的胰岛素成本太高。第二种也是美国礼来公司建立的，目前仍然是诸多公司生产重组人 胰岛素的主要方式。由于正常序列的人胰岛素原(B-C-A)在大肠杆菌中不稳定而容易降解， 通常采用融合蛋白的形式，将人胰岛素原接在一个较大的N-端融合蛋白后面，大大增加了胰 岛素原的表达量(10%-30%) (Castellanos-Serra, et al. 1996; Tikhonov, et al. 2001),表达产物通 过溴化氰释放出人胰岛素原。由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，折叠率到 达70%，从而在一定程度上降低了胰岛素的生产成本。第三种方式是丹麦诺和诺德公司采用 的A、 B链同时表达的方法，在A链前端和A、 B链中间均有甲硫氨酸。表达产物经溴化氰 处理，得到A链和B链，再经过复性和纯化得到有活性的重组人胰岛素，这种方式与第一种 方式存在着同样的因为复性效率带来的成本问题。
另外，在应用大肠杆菌表达体系方面，美国礼来公司实验室(Heath, et al. 1992)使用了倒 置胰岛素原(A-B-C)在大肠杆菌系统的非融合形式表达，有一定的意义。倒置胰岛素原复 性率较高，后加工也有所简化，但是表达效率较低(10%),后加工时副反应强烈，从而阻碍 了这一方案在工业中的应用。该公司还开发了应用短导肽(仅两个氨基酸)表达正常人胰岛 素原及其类似物的方法(Belagaje, et al. 1997)。这类方法的优点是短导肽对胰岛素原的复性没 有影响，可以在复性后由胰蛋白酶切除，避免了溴化氰的使用。同吋由于短导肽仅两个氨基 酸残基，有效地增加了表达产物中胰岛素原的比例，具有一定优势，但表达量较低，在7%-15% 间。
综上所述，现有的重组人胰岛素的生产方法中存在表达量较低或者在生产过程中使用剧毒溴化氰的技术缺陷。虽然应用大肠杆菌系统的第二种方式在一定程度上有效的提高了融合 胰岛素原的表达量，但是胰岛素原在表达产物中所占比例较低。而溴化氰的使用，可能对环 境产生较大污染，操作条件苛刻。本发明综合现在胰岛素表达生产遇到的问题，提供了一类 新型含有N-端前导肽序列的人胰岛素原或其类似物分子，并提供了一种利用该胰岛素原分 子，采用大肠杆菌高密度发酵体系生产人胰岛素原的方法，可以大大提高胰岛素原的表达量， 而且克服现有技术中存在的使用有毒有害物质溴化氰的技术缺陷。
发明内容
本发明的目的就是提供一种用于制备重组人胰岛素及其类似物的新型胰岛素前体。 本发明的另一目的就是提供一种利用该新型胰岛素前体高效简便的生产人胰岛素或其类 似物的方法。
本发明的再一 目的就是提供用于该方法的表达载体及工程细胞。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
本发明的第一方面，提供了一种用于制备重组人胰岛素及其类似物的新型胰岛素前体， 其特征在于，所述前体从氨基端至羧基端分别含有以下元件
(a) 具有式Met-Ser-(Xaa)mZi所示的导肽元件，式中Xaa为20种天然氨基酸中任一种， m为0-30的正整数，Zi为Arg或Lys;
(b) 人胰岛素B链或其类似物；
(c) 具有式Z2(Xaa)nZ3所示的连接肽元件，式中Xaa为20种天然氨基酸中任一种，n 为非负整数或者0， Z2为Arg或Lys， Z3为Arg或Lys;
(d) 人胰岛素A链或其类似物。
在一优选例中，导肽元件Met-Ser-(XaaV^式中m=0， &为Arg且所述的导肽元件序列为MSR。
在另一优选例中，导肽元件Met-Ser-(Xaa)mZi式中m=2， Z！为Aig，且所述的导肽元件 序列为SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，导肽元件Met-Se"Xaa^Z！式中m=4， Zx为Arg，且所述的导肽元件 序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，导肽元件Met-Ser-(Xaa)n^式中m=6, Zi为Arg，且所述的导肽元件 序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，导肽元件Met-Ser-(Xaa)m^式中n^10， A为Arg，且所述的导肽元件 序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，导肽元件Met-Ser-(XaaVZi式中m-12， Z,为Arg，且所述的导肽元件 序列为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的连接肽元件为人胰岛素C肽。
本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA序列，它编码本发明上述的新型胰岛素前 体。还提供了含有所述DNA的表达载体，以及含有表达载体或所述DNA的宿主细胞。
在一优选例中，表达载体是上海一就生物医药有限公司提供的pAmk大肠杆菌表达质粒。 在另一优选例中，宿主细胞是五sc/ien'c/w'a co/"DHl)。
本发明的第三方面，提供了一种制备胰岛素或其类似物的方法，包括从表达上述新型胰 岛素前体并从前体中释放和分离胰岛素或其类似物的过程。
本发明的一种用于制备重组人胰岛素及其类似物的新型胰岛素前体能带来如下技术效 果该类前体能在上海一就生物医药有限公司提供的pAmk大肠杆菌表达体系中实现高表达 量的表达，胰岛素原在表达产物中所占比例达到96.6% (Met-Ser-Aig-proinsulin，简称 MSR-proinsulin)。该类前体能有效的应用常规胰岛素原复性方法复性，在转化成为胰岛素或 胰岛素类似物时只须用胰蛋白酶和羧肽酶B就能释放胰岛素或胰岛素类似物分子，不使用溴200 化氰，适合大规模生产重组人胰岛素或其类似物。
图1 质粒pAmk-MS-proinsulin结构图。
图2重组质粒pAmk-MS-proinsulin部分基因测序结果。
图3 SDS-PAGE电泳显示pAmk-MS-proinsulin的表达和纯化。1.标准分子量蛋白(kDa); 2.载荷pAmk-MS-proinsulin质粒的大肠杆菌BL21 (DH1)细胞全蛋白(乳糖诱导后)；3.载 荷pAmk-MS-proinsulin质粒的大肠杆菌BL21 (DH1)细胞全蛋白(乳糖诱导前)；4.阴离子 交换层析(DEAE-52)纯化后的MS-proinsulin。
图4 SDS-PAGE电泳显示纯化的重组人胰岛素。1.纯化后的MS-proinsulin; 2.纯化的重组 人胰岛素(氧化态)；3.标准品人胰岛素(氧化态)；4.纯化的重组人胰岛素(还原态)；5.标 准品人胰岛素(还原态)。
图5纯化的重组人胰岛素AutoflexToF/ToF (BrukerDaitonics)质谱图。
图6胰岛素的HPLC检测结果，A为本发明制备的重组人胰岛素，B为标准品人胰岛素。
具体实施例方式
以下通过附图及实施例对本发明做进一步说明
材料
(1) 菌株和质粒
宿主菌Escherichia coli(DHl)是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究有关的实验室 一般都有保存。
质粒pET28a-23DT-proinsulin和质粒pAmk均由本公司实验室构建并保存。
(2) 酶和试剂
分子克隆工具酶和试剂、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品，PCR回收 试剂盒和琼脂糖胶回收试剂盒为上海华舜生物工程公司产品。
标准品天然人胰岛素、胰蛋白酶和羧肽酶B购至上海生物工程有限公司。
7(3) 培养基
LB培养基，配方见参考文献Sambrook J, Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。该书是基因工禾呈中支 术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。
(4) Cellouse-DEAE: DEAE-52为Whatman公司产品。
方法
质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌，这些 在基因工程研究领域都是常规操作方法，参见Sambrook J， Fristsh EF， Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Piess， 1989， pp. 16-340。
重组蛋白表达量的测定参见Sambrook J, Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，方法进1亍。
实施例1 MSR-proinsulin重组基因工程菌的构建 1.1 MS-proinsulin基因的获得
以pAmk为模板，设计引物P1和P2，两条引物核苷酸序列如下 PI: 5，GGAATTGTGAGCGGATAACA3， P2: 5'AAAACGACTCATAACGTATTCCTCT3'
通过PCR的方法扩增pAmk中Ascl酶切位点与表达导肽MS之间的片段。将其命名为 fragment-MS。使用Pfu DNA聚合酶扩增，扩增条件为94 °C， 45s、 53°C， 45s、 72°C， 30s。 共30个循环。PCR产物用DNA胶回收试剂盒纯化回收130bp左右的条带。
以本实验室构建的pET28a-23DT-proinsulin设计引物P3和P4: P3: 5'ATGAGTCGTTTTGTCAATCAGCACC3'P4: 5，CCGCCATGGCGCTTTTGATCC3，
扩增pET28a-23DT-proinsulin中胰岛素原与Nco I酶切位点之间片段。将其命名为 fragment-proinsulin。使用Pfu DNA聚合酶扩增，扩增条件为94 。C， 45s、 68°C， 120s。共30 个循环。PCR产物用DNA胶回收试剂盒纯化回收580bp左右的条带。
利用重叠区延伸法获得MS-proinsulin基因由于引物P2的5'端与引物P3的5'端有12 个碱基的互补，所以以fragment-MS与fragment-proinsulin为模板，通过PCR扩增，在退火 时可以使fragment-MS基因的单链与fragment-proinsulin基因的单链配对，通过DNA聚合酶 的作用，得到将fragment-MS与fragment-proinsulin连接的片段。命名为 fragment-MSR-proinsulin。使用Pfu DNA聚合酶扩增，扩增条件为94 °C， 45s、 57°C， 50s、 72°C， 80s。共30个循环。
PCR产物用DNA胶回收试剂盒纯化回收710bp左右的条带。 1.2 pAmk-MS-proinsulin质粒的构建及相应重组基因工程菌的构建
将扩增纯化后的fragment-MSR-proinsulin基因片段用Asc I与Nco I进行双酶切，酶切后 产物用PCR产物纯化试剂盒回收酶切产物。
采用碱裂解法对pAmk质粒进行抽提，抽提得到的质粒也用Asc I与Nco I进行双酶切， 酶切反应结束后用胶回收试剂盒回收大片段DNA。
将上述酶切回收后得到的fragment-MSR-proinsulin基因片段和pAmk质粒大片段用T4连接 酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌&c/tm'c/u'fl co/z' BL21(DH1)，筛选后得到含有 fragment-MSR-proinsulin前体胰岛素原蛋白基因的重组质粒的基因工程菌，称为 pAmk-MS-proinsulin重组基因工程菌，其结构示意图见附图l。从该工程菌中提取重组质粒， 委托上海英俊公司进行核酸序列分析，进一步验证MS-proinsulin前体胰岛素原蛋白基因及其 读码框的正确性，其结果见附图2。
9实施例2 pAmk-MS-proinsulin重组基因工程菌发酵表达
从pAmk-MS-proinsulin重组基因工程菌的培养平板上挑取单菌落，接种于含有25 y g/ml 链霉素的LB液体培养基中，于37'C恒温振荡培养过夜，按1免比例转接种入20升LB液体培养 基(25 U g/ml链霉素)中，并加入终浓度为0.5mmol/L的a-乳糖诱导表达融合蛋白MS-proinsulin。 诱导后12小时离心问收菌体(共计湿菌体5kg)， 15免SDS-PAGE电泳再经薄层扫描显示已经实 现了MS-proinsulin前体胰岛素原蛋白基因的表达，表达的蛋白占细菌总蛋白的44.2%，结果见 附图3。
实施例3 MS-proinsiilin前体胰岛素原蛋白的分离纯化
诱导表达后的工程菌经离心回收菌体，将菌体悬浮在菌体裂解液(pH8.0， 50mMTris-Cl， 0.5%TritOnX-100， 0.02%溶菌酶)中，37。C搅拌过夜。离心回收沉淀，沉淀经包涵体洗涤液 (pH8.0， 50mMTris-Cl, 0.2% Triton X-100)、低浓度尿素溶液(pH8.0， 50mMTris-Cl， 3M 尿素)洗涤，洗涤后离心回收沉淀。沉淀裂解于高浓度尿素中(pH8.0， 50mM Tris-Cl， 7M 尿素)，离心回收上清。上清经亚硫酸盐解(亚硫酸钠、连四硫酸钠)，阴离子交换(DEAE-52) 层析纯化。层析用缓冲液包含pH8.0， 50mMTris-Cl， 7M尿素，梯度洗脱用0-0.3M NaCl梯度 进行，目的蛋白层析峰经SDS-PAGE电泳检测已达到电泳纯，结果见附图3。
实施列4 MS-proinsulin前体胰岛素原蛋白转化为人胰岛素
为形成正确的二硫键，将纯化后的MS-proinsulin前体胰岛素原蛋白(-S-磺酸盐)溶解于 含有50mM甘氨酸的缓冲液pH10.6中，浓度为0.5g/1。在巯基乙醇(10mol/mol前体胰岛素原) 作用下，4'C搅拌过夜，然后用磷酸调节pH至3.5,离心去除沉淀。上清液用50mMTris调节pH 至9.0，按质量比l: IOOO-I: 1000 (E/S，即酶/前体胰岛素原)分别加入胰蛋白酶和羧肽酶B， 37。C反应30min，产物经阴离子交换层析(DEAE-52)纯化。层析用缓冲液包含pH9.0， 50raMTris-Cl，梯度洗脱用0-0.8M NaCl梯度进行，胰岛素析峰经SDS-PAGE电泳检测已达到电泳纯， 结果见附图4。目的峰经脱盐、冻干后保存。
冻干品经AutoflexToF/ToF 〔Bruker Daitonics)质谱测定分子量为5807.29Da，与理论分 子量相比误差为0.01%，见附图5。
实施列5重组人胰岛素RP-HPLC检测
实施例4中纯化的重组人胰岛素和人胰岛素标准品，分别按美国药典USP28th的方法进行 RP-HPLC检观U，见图6。结果表明重组人胰岛素和人胰岛素标准品具有同样的RP-HPLC保留性质。<110>上海一就生物医药有限公司 <120>—种重组人胰岛素及其类似物的制备方法
<160> 5
<210> 1
<211>5 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>当m=2时导肽元件的序列 <400> 1
Met Ser Leu Asn Arg 1 5
<210> 2 <2">7 <212> PRT <213>人工序列<220>
<223>当ra=4时导肽元件的序列 <400> 2
Met Ser Leu Asn Thr Ser Arg 1 5
<210> 3 <211>9 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>当m=6时导肽元件的序列 <400> 3
Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Arg 1 5
<210> 4 <211>13 <212> PRT<213>人工序列 <220>
<223>当m-lO时导肽元件的序列 <400> 4
Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Arg 1 5 10
<210> 5 <211>17 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>当m=12时导肽元件的序列 <400> 5
Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gin Glu Glu Arg 15 10 1权利要求
1. 本专利涉及一种用于制备重组人胰岛素及其类似物的新型胰岛素前体。
2. 条款l所述的胰岛素前体，其特征在于，所述前体从氨基端至羧基端分别含有以下元件a) 具有式Met-Ser-(XaaV^所示的导肽元件，式中Xaa为20种天然氨基酸中任一种，m为 0-30的正整数，Zi为Arg或Lys;b) 人胰岛素B链或其类似物；c) 具有式Z2(Xaa)nZ3所示的连接肽元件，式中Xaa为20种天然氨基酸中任一种，n为非负 整数或者O， Z2为Aig或Lys， Z3为Arg或Lys;d) 人胰岛素A链或其类似物。
3. 条款1或2所述的前体，其特征在于a) 当m-O时，导肽元件的序列为MSR;b) 当m=2时，导肽元件的序列为SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列；c) 当m=4时，导肽元件的序列为SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列；d) 当m=6时，导肽元件的序列为SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列；e) 当m=10时，导肽元件的序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；f) 当m-12时，导肽元件的序列为SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。
4. 一种分离的DNA序列，其特征在于，它编码条款l-3中一项或多项所述的胰岛素前体。
5. —种表达载体，其特征在于，它含有条款4所述的DNA序列。
6. —种宿主细胞，其特征在于，它含有条款5所述的表达载体或含有条款4所述的DNA序列。
7. —种制备胰岛素或其类似物的方法，其特征在于，表达条款1-3中一项或多项所述的胰岛素 前体并从前体中释放并分离胰岛素或其类似物。
8. 条款l中的重组人胰岛素类似物包括甘精胰岛素、谷甘胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素等。
全文摘要
本发明提供了一种新型N-端前导肽序列的人胰岛素原或其类似物分子(Preproinsulin)，及一种利用该分子生产人胰岛素的方法，以及有关的表达载体与工程细胞的构建、人胰岛素原的表达和纯化工艺。将编码带有本发明N-端前导肽序列的人胰岛素原或其类似物的核酸序列导入原核表达载体，再转入大肠杆菌中实现该类分子以包涵体形式的表达。产物具有表达量高、易纯化、制备方法不使用CNBr、加工成为重组胰岛素过程工艺简单的优点。
文档编号C12R1/19GK101519446SQ20091003004
公开日2009年9月2日 申请日期2009年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者景 侯, 刘景晶, 刘素丽, 刘言华, 婧 孔, 张笑岩, 杨亚男, 豪 范, 勇 鲁 申请人:上海一就生物医药有限公司