专利名称：可用于防治栗疫病的含有弱毒性病毒chv1-cn280的菌株的制作方法
技术领域：
本发明为可用于防治栗疫病的含有弱毒性病毒CHV1-CN280的菌株 CHV1-CN280，简称菌株CN280，是一种存在于栗疫病菌菌株细胞质中的dsRNA病 毒及其应用于生物防治栗疫病的方法，属于植物保护领域，专用于板栗树栗疫病的防 治。
二背景技术：
板栗疫病由一种称作寄生隐丛赤壳(Co^/zow"n'"para甜/ca)的真菌危害引起栗 树枝干病害，有的地区又称栗胴枯病、栗干枯病，是一种世界性栗树病害，苗木及大 树均可受害，主要危害主干及枝条，使栗实产量和质量明显下降，严重时造成全株枯 死。
栗树疫病于上世纪初自亚洲传播到欧美，引起欧美三十年代的栗树疫病大流行， 由于病害发生在树皮的韧皮部，药液很难渗透进去，美国使用了大量杀菌剂试图扑灭 栗疫病的蔓延都归于无效，最终毁灭了美国的数十亿株栗树，并使与其相关的化工、 制革、建筑木材工业从繁荣迅速走向衰败。我国是栗树疫病的起源地，分布广泛。我 国的板栗曾被认为是高度抗病的，但不少省、市，如辽宁、河北、河南、山东、安徽、 浙江、江西、广东、广西、湖南等省均有发生，有的地方还十分严重，甚至造成大片 板栗失收林毁，被列为国内外检疫对象。近年来随着各地种植栗树面积迅速扩大，栗 疫病己成为影响板栗产量的重要限制因素，因此，栗疫病流行规律的研究和有效防治 显得十分重要。
随着人们对化学农药残留、环境污染以及病菌抗药性发生发展的认识，绿色食品 和有机农业的大力推广，研制生物防治病虫害的生物农药已成为生产实际和农林产品 出口的迫切需求。
六十年代，意大利的栗树疫病由于发生了弱毒力菌系的扩展而得到有效控制，濒 临灭绝的意大利栗林逐渐得到恢复。法国科学家将意大利恢复生长的栗树上分离到的 栗疫病菌弱毒力菌株成功地应用于生产上进行生物防治，也有效地控制住了法国栗树 疫病的蔓延。经研究，发现栗疫病菌的这种弱毒性特征是由于菌株感染了一种裸露的 双链核糖核酸病毒(double-stranded RNA，dsRNA)引起的，这种dsRNA病毒存在于 病菌的细胞质中，可依赖真菌菌株间的菌丝融合进行传播，也可通过分生孢子传递给 下一代。现共鉴定出的四种栗疫菌弱毒性病毒(CHV1、 CHV2、 CHV3禾nCHV4)，属 新建立的弱毒性病毒科(场pow'nW^单属科)。
CHV1病毒的基因组结构含有两个ORF: ORFA和ORFB。 ORFA编码一个多聚 蛋白p69，它可以自我剪切成两个蛋白p29和p40，实施这一剪切功能的是位于p29多肽链中的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶结构域。ORFB编码一个更大的多肽，其表达中也涉及到一个自我剪切的过程，在此过程中产生一个48kD的蛋白质，p48，它具有另外一个木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶位点；另外ORFB还编码两个比较保守的蛋白，RNA聚合酶和解链酶。
发明内容
技术问题本发明的目的是针对我国部分地区板栗栗疫病不能有效进行化学防
治的情况，筛选一种栗疫病菌弱毒性病毒CHV1-CN280毒株用于生物防治，含有该
病毒的弱毒力菌株能安全有效地将弱毒性病毒传播给毒力菌株，并由此控制和防治栗
树林中栗疫病的危害和蔓延，安全、无污染，有效期长。其内容和实施方案如下
可用于防治栗疫病的含有弱毒性病毒CHV1-CN280的菌株，其特征在于该栗疫病菌菌株CHV1-CN280含有CHV1-CN280病毒，分类上属于寄生隐丛壳(0>p/w"e"n'ap"raW!'ca)，现保藏于中国微生物菌种保藏委员会(北京)，保藏日期2009年6月29日，保藏号CGMCC No. 3136。
所含有的弱毒性病毒CHV1-CN280，分类上属于弱毒性病毒科(/fy/xmWAe)，弱毒性病毒属(H^pow'rt^)，栗疫病菌弱毒性病毒(Co^/w"ecWa/7>7 oWn ) 1号禾中。所述菌株和病毒均可在生物防治栗疫病方面的应用。其用于生物防治栗疫病的方法为利用含有CHV1-CN280弱毒性病毒的栗疫病菌菌株的菌丝或孢子接种栗树的栗疫病病斑周围从而使病斑愈合，栗树恢复正常生长。有益效果
CHV1-CN280来自我国北方的CHV1病毒，其部分29基因序列经分析属于亚型I ，与欧洲CHV1病毒的遗传距离为0.352，差异很大；而且该病毒对毒性菌株的平均转化率高，离体防治栗疫病效果较好。目前，国内尚无有关利用弱毒性病毒进行生物防治栗疫病的研究报道，而该生物防治菌剂的开发将有极为显著的经济和社会效
nrft.。
(1) 树上病毒传播率显著高于室内培养皿中测定结果
实验中发现在实验室条件下不能传递低毒力的供、受体菌，在田间配对接种或者已经转化的菌株与供体菌的野生型后代配对接种后表现的毒力都与供体菌相当，表现低毒力或中等毒力，再分离后测定表明，在栗树组织上可以发生低毒力的传递。这可能由于室内转化时间太短而降低了弱毒力的转换率，田间接种延长了菌株间的接触时间，可以提高弱毒力的转化率，这就大大提高了利用低毒力菌株进行栗疫病生物防治
的潜力。树上接种的病毒传播率(林间一个生长季节的病毒传递率可达90%以上)更能代表弱毒力菌株的防治栗疫病的实际效果。
(2) 无农药污染；无副作用
利用化学防治虽可收到一定的防效，但这种方法需要多次树体喷射、用药浓度高，板栗树体高大，以致防治困难、费力，并且容易产生抗药性，从而限制了化学防治。Jaynes等发现在树干内注射内吸性杀菌剂多菌灵可收到一定的防治效果。但这种方法需要多次注射，而且用药浓度高，不仅容易引起药害，而且栗疫病菌也会产生抗药性。针对这种情况，Elkins等在栗树根系附近的土壤中注射多菌灵防效也较佳，这种方法可以降低药害和减少施药次数。赵云琴等报道，病株在刮除病部腐朽组织后再涂以抗菌剂401的400倍药液，对此病有明显的防治效果。王万章等报道，碳酸钠和波尔多液亦有效。由于每年产生新病斑，长期使用农药会造成药害，病菌也会产生抗药性，从而限制了化学防治的应用。
应用弱毒力菌株进行生物防治在意大利和法国的效果较好，尤其是在意大利，有些原来疫病为害非常严重的地区，现在已难找到正常的溃疡斑。意大利菌株的VCG数量较少，毒力菌株较易转化成功，利用弱毒力进行防治，问题比较简单。
在法国，弱毒力菌株虽然不能迅速扩散，但毒力菌株的VCG不复杂，很少产生子囊孢子，使VCG的数量很难增加，而且毒力菌株每年扩展速度比较缓慢，因此，通过人工接种弱毒力菌株，可使其扩展和转化进程与毒力菌株的扩展和侵染同步。经过一段时间后，栗树园里即能有效地建立起一定数量的弱毒力菌株群体，使整个栗树园得到保护。
(3) 长期效果积累效应明显
弱毒力菌株的自然扩散以及意大利栗树条件的相应改善，可能是可传递性弱毒力的生物防治潜力的最好说明。自意大利第一次发现栗疫病的40年后，由于弱毒力菌株的自然扩散，该病害已不再成为当地栗树栽培的主要问题。在对弱毒力菌株的治疗性质进行论证之后，以及证明60年代以来，意大利的栗疫病明显受到这种现象的自然控制后，Grente制定了与法国农部合作的相当规模的栗疫病生物防治计划，计划中采用人工引入弱毒力菌株到法国栗树种植园中。操作程序包括前三年每公顷成功处理10个溃疡斑，以后2 3年每公顷处理5个溃疡斑，在10年内完成对所有栗树种植园的病害控制。
欧洲栗疫病由于栗疫病菌低毒力菌株的自然扩散(意大利)或人工应用(法国)得以成功防治的报导，激起人们去努力试验这可传播的低毒性因子能否有效防治北美的栗疫病。康涅狄克农业试验站的研究者证实，在控制条件下，欧洲的弱毒力菌株可以治疗北美毒力菌株引起的溃疡。接着又发现北美几个不同的地区存在当地的弱毒力菌株，1976年，首先在密歇根州的存活美洲栗上分离到弱毒力菌株。Fulbright及其同事证实在整个密歇根州的不同地方都存在当地的弱毒力菌株，并提供了不断发展的生物控制的证据。
(4) 安全、经济、体现生态保护理念接种操作不会威胁工作人员的安全，不会发生使用农药会发生的中毒事件；每年接种一次生防菌，几年后可使弱毒力菌株成为栗树林中优势菌群而不再需要
实施栗疫病防治的其他措施，不像化学防治，每年需多次进行，永无宁日，因而经济效益可观；接种弱毒力菌株防治栗疫病，对栗树林中有益昆虫、微生物无害，保护了生态系统的平衡性，防止了生态环境的破坏与污染。 一些小动物、鸟类、昆虫和节肢动物在栗林中弱毒力菌株传播到其他栗树栗疫病病斑上的过程中起到极大的帮助作用。
四
图1栗疫菌弱毒性病毒CHV1-CN280 cDNA全序列(A)及氨基酸序列(B)与其他已测序的CHV1
病毒同源性比较图2 CN280菌株(左)及其脱毒菌株(右)的培养特征图3栗疫菌弱毒性病毒CHV1-CN280的电泳图谱特征
M:分子量标记；1， CHV1-CN280; 2, CHV1-354;
3， CHV1-EP713; 4， CHV1-238; 5， CHV1-250.图4培养皿中栗疫菌菌株间弱毒性病毒传播试验
A:野生型菌株；B:弱毒力菌株；C:病毒传播区图5 CN280菌株及其脱毒菌株的生长曲线
五具体实施例方式
含有CHV1-CN280病毒的栗疫病菌菌株CHV1-CN280是我实验室采集我国辽宁省栗树疫病标本后分离得到，分类上属于子囊菌门Ascomycota;粪壳菌纲Sordariomycetes;腐皮壳菌目Diaporthales; 隐丛赤壳菌禾斗Cryphonectriaceae; 隐丛赤壳菌属Cryphonectria; 寄生隐丛赤壳菌CV7/ /zo"g"r/a戸ra诚ca。 PDA培养基上含有CHV1-CN280病毒的栗疫病菌菌株的菌落呈白色(黑暗培养)或淡黄色(光照培养)，菌丝体表面生，菌丝有隔、分枝，气生菌丝较多；PDA培养不产生或极少产生分生孢子器(图2)，少量分生孢子由菌丝分枝生成，分生孢子单细胞无色，卵形或椭圆形，3 4nmxl.5 2(am。
dsRNA病毒CHV1-CN280其部分29基因序列经分析属于亚型I ，与欧洲CHV1病毒的遗传距离为0.352，差异很大。CHV1-CN280病毒分类上属于弱毒性病毒科(Hypoviridae )，弱毒性病毒属(Hypovirus )，栗疫病菌弱毒性病毒1号种(0;^/rawe"Wa/^; OT/ms l)，该病毒存在于栗疫病菌细胞质中，分子序列为12.730kb，含有两个开放阅读框架(ORF): ORFA和ORFB; ORFA可编码p69蛋白，并可自动裂解为p29和p40蛋白；ORFB编码一聚合酶基因和一解旋酶基因；序列的3'端为一polyC尾(图l)。 CHV1-CN280病毒的一个独特特征是在两个阅读框(ORFs)连接处的编码在CHV1-EP713、 CHV1- Euro7、 CHV1-EP721和CHV2-NB58的ORFA和ORFB连接处为UAAUG，而在CHV1-CN280中却是AUGUAUAA。
将上述含有CHV1-CN280弱毒性病毒的栗疫病菌菌株CHV1-CN280用于生物防治栗疫病的方法为在栗树的栗疫病病斑周围用打孔器打出孔洞(至形成层下，孔洞数量视病斑大小定)，将含有上述菌株菌丝体(菌丝及孢子)的琼脂块填进孔洞，以胶带封闭孔口即可。
(一)栗疫病菌菌株间不同弱毒性病毒传递率的测定在对板栗疫病菌的遗传群体进行结构研究中，发现和鉴定出50余株含有dsRNA病毒的菌株，室内和林间的研究结果明确了 CHV1-CN280弱毒性病毒对不同营养体亲和群(相差l 4个w基因)的菌株的传递感染率最高，室内平板上培养2星期的传递率平均可达68.75%,而其他弱毒性病毒的传递率平均只有38.75% (表l)。林间一个生长季节的病毒传递率可达90%以上，可以有效地控制林中板栗疫病的发生与流行，显示出该病毒具有应用于田间生物防治栗疫病的较大潜力。
目前，国内尚没有有关利用弱毒性病毒进行栗疫病生物防治的研究报道，本发明得到的弱毒性病毒CHV1-CN280毒株在不同营养体亲和群的菌株间传播能力也比欧洲毒株CHV1-EP713和CHVl-Euro7高。
表1室内栗疫病菌菌株间不同弱毒性病毒传递率的测定
Vc基因差异传递率％EP713EP43267CN280
0薩100100100
1658085 85
24052.582.5卯
3252040
4001060
平均(l-4 vc差异)27.5039.3849.3868.75
注本表及附图中的EP155 (ATCC38755)、 EP713 (ATCC 52571)和EP43 (ATCC 38767)菌株为美国标准菌株收藏中心保存(American Type Culture Collection, Rockville， Md.);其他中国菌株(267、354、 238和250也为公知公用，见文献(徐陈贤，刘福秀,周晓云，王克荣.2004，中国东部栗疫病菌dsRNA群体的多样性.生物多样性，12(3):370-376)。菌株CN280为本发明含有弱毒性病毒CHV1-CN280的菌株CHV1-CN280。
(二) 含有CHV1-CN280病毒的栗疫病菌菌株与野生型菌株的毒力比较取直径为3.5 5.0cm、长50cm的1 2年生板栗枝段，在自来水下冲洗枝段表面，
自然晾千后用融化的白蜡将枝段两端及侧枝伤口处密封，防止水分散失和外来污染。在枝段两侧每隔12cm处用灭菌的打孔器(直径0.5cm)打孔，深达形成层下部。在孔中接入同样大小的幼嫩菌丝块，菌丝体朝内，并以少量灭菌湿棉球保湿，外用透明胶带封闭，标明菌株编号。每个菌株重复数个，并处不同板栗枝段上，以美国强毒力菌株EP155(ATCC 38755)为阳性对照，以PDA无菌琼脂块为空白对照。接种后的栗树枝段放入密封容器中，以湿纱布覆盖保湿。置于25'C室温下45天，取出测量病斑的长和宽，利用椭圆形面积公式计算病斑面积，以其病斑面积除以阳性菌株EP155的病斑面积并乘以IOO，得出其相对毒力。
野生型CN280菌株在栗树枝上可形成35 40cm2大小的病斑，而含有CHV1-CN280的弱毒力菌株形成的病斑只有10 14cr^的面积。
(三) CHVl-CN280病毒dsRNA的提取与电泳
用于提取dsRNA的菌丝体制备在PDA平板培养基上培养菌株至长满培养皿，在皿中加入10ml灭菌水，用刮刀刮取全部菌丝体，将全部繁殖体悬浮液倒入装有200ml马铃薯葡萄糖培养液(PDB)的500ml三角瓶中，将三角瓶放在振荡培养摇床上以250rpm的转速、25'C下培养4天，将强韧性滤纸铺在平底瓷质漏斗中，将漏斗连结好抽气三角瓶，三角瓶连接上负压水流，倒入菌丝体悬浮液，打开自来水开关，刮下滤纸上的菌丝体，放入50ml离心管中，置于一2(TC下过夜，旋松离心管盖子，放入真空干燥机中干燥，置于一20'C下备用(或直接粉碎)，用金属杆搅碎菌丝体成粉末备用或一2(TC下保存备用。dsRNA的提取和检测
dsRNA的分离纯化方法是根据纤维素对核酸的亲和吸附作用原理，采用柱层析法进行的。在15%-17%乙醇存在的条件下，纤维素CF-ll对dsRNA有特异性吸附作用，从而使dsRNA与其它类型的核酸(DNA和单链RNA)分离开来，达到纯化的目的。溶液(Solutions) : 10xSTE: 1MNaCl
0.5MTris pH8.010mM EDTAlxSTE2xSTE
Column Wash Buffer: 500ml 2xSTE
170ml EtOH330ml dH20
Extraction Buffer (per 10 ml): 2xSTE 1 ml 10xSTE
0.01%NaDIECA O扁g2% SDS 0.02g
A. 制备层析用CF-11纤维素将30 g CF-11纤维素粉加入250 ml层析柱洗脱缓冲液使之充分膨胀，4"C下保存；
B. 制备层析柱将膨胀后的纤维素加入层析管中达2cm左右高度；
C. 平衡数分钟。
(1)称取0.5g菌丝粉，加入10ml提取缓冲液，振荡混匀，加入8ml酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1)，轻微振荡，3500rpm离心15分钟，将上层水相移入洁净的10ml刻度试管中，准确地计量体积，加入(边低速振荡边滴入)无水乙醇至其浓度为17%，装入层析柱，静置，使dsRNA充分吸附到纤维素CF-ll上，至少用60ml洗柱缓冲液进行洗脱，当柱上端只有2mm的缓冲液留下时，暂停洗脱，加入50pl溴酚蓝，将洗柱缓冲液全部放空，接着加入lxSTE7ml，当溴酚蓝到达层析柱的底部时，开始收集流下的液体于一个10ml的刻度试管，加入1/10体积的3M NaAc和两倍体积的无水乙醇，在-7(TC下放置15分钟，在4。C下，8000rpm离心1小时，用500pl H20重悬浮沉淀。加入50pl3mol/lNaAc和2倍体积的无水乙醇，-20"下过夜。12000rpm离心沉淀，70%酒精洗涤一次，晾干，灭菌双蒸水溶解。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA。栗疫病菌dsRNA琼脂糖凝跤电泳检测比较结果见图3，电泳图像表明，在分子量为12.7kb处，欧洲病毒CHV1-EP713和中国各病毒均有一明显的核酸带，
8CHV1-CN280在2.5kb, 2.7kb,2.9kb和3.2kb处还各有一条副带。
(四) CHV1病毒的传播测定
(1) 培养皿中试验
将活化好的含有弱毒性病毒的弱毒力菌株和无病毒感染的毒力菌株的菌丝块移 至PDA平板上配对培养，两菌丝块相距0.5cm以内，置于25i:条件下，3 5天后检 查传播结果。传播成功的结果验证将PDA上病毒传播成功的生长区域(图4-C)挑 取小块菌丝块，移至新鲜PDA平板上培养，根据其菌落的形态特征初步确定是否传 播成功；将初步认为传播成功的菌株液体培养后提取dsRNA,电泳后明确其传播结果。
一般在两菌株菌丝接触后两三天，橘黄色菌落的毒力菌株靠近弱毒力菌株的菌丝 体会发生白化现象，并逐渐扩展直至蔓延整个毒力菌株以后形成的菌落。将白化菌落 挑取小块培养，可形成稳定的白色菌落；将其菌丝体提取dsRNA电泳，可形成 CHV1-CN280特征性电泳条带，即在分子量为12.7kb处有一明显的核酸带，在2.5kb， 2.7kb, 2.9kb和3.2kb处还各有一条副带。
(2) 板栗树上试验
春季栗树发芽时，在低于五年生的健康树干上用打孔器打出相邻0.5cm的孔洞， 深至形成层下，在两孔洞中各填入一块含有弱毒性病毒的弱毒力菌株和无病毒感染的 毒力菌株的菌丝块，无菌湿棉球保湿，外用透明胶带封闭，做好接种菌株记录。秋季 及第二年秋季落叶时，进行病斑扩展测量，并在接种毒力菌株的病斑边缘取样分离， 观察其是否被转化。
第二年在毒力菌株形成的病斑周围有愈伤组织形成，表明毒力菌株已被转化为弱 毒力菌株；将其病斑边缘取样分离，得到白色菌落的栗疫病菌，也表明了毒力菌株已 被转化为弱毒力菌株。
(五) CN280弱毒力菌株及其脱毒菌株的生长率比较 ' 采用单孢分离法，利用野生型菌株和弱毒力菌株的培养特征差异，在CN280弱
毒力菌株的单孢后代菌落中分离得到脱毒菌株，在PDA平板培养基上比较二者的生 长速率。采用内径5mm的打孔器切取菌丝块，置于PDA平板培养基中心处，五皿重 复结果表明(图5):弱毒力菌株培养7天的生长速率稍大于脱毒菌株。
(六) CN280弱毒力菌株林间防治试验 在林中有栗疫病的树干上的病斑边缘，用打孔器打出孔洞，深达韧皮部下，将预
先制备好的菌丝块植入孔洞中，以胶带封闭；同时选择同等大小的病斑不作任何处理 作为对照。深秋后或一年后测量处理病斑和对照病斑的大小，计算防治效果病斑抑 制率=(对照病斑面积一处理病斑面积)/对照病斑面积xlOOX。
防治效果与接种菌和被转化菌间的营养体亲和性基因差异数量也有关系。 一般相 差l-2个vc基因的防治效果都较好，病斑转化率可达100%;如果菌株间vc基因差
异太多，防治效果要差些(参见表l)，因此在进行田间防治试验和推广防治时，还要
注意接种菌株的vc基因型搭配。
权利要求
1.可用于防治栗疫病的含有弱毒性病毒CHV1-CN280的菌株，其特征在于该栗疫病菌菌株CHV1-CN280含有CHV1-CN280病毒，分类上属于寄生隐丛壳(Cryphonectria parasitica)，现保藏于中国微生物菌种保藏委员会(北京)，保藏日期2009年6月29日，保藏号CGMCC No.3136。
2. 权利要求1所述菌株含有的防治栗疫病的含有弱毒性病毒CHV1-CN280，其 特征在于所述CHV1-CN280病毒分类上属于弱毒性病毒科(7fy/wwWc/ae)，弱毒 性病毒属(ify/ww'nw)，栗疫病菌弱毒性病毒(07/ /w從"〃'a/^/xm'n/51) 1号禾中。
3. 权利要求l所述菌株在生物防治栗疫病方面的应用。
4. 权利要求2所述病毒在生物防治栗疫病方面的应用。
5. 权利要求1所述菌株用于生物防治栗疫病的方法利用权利要求1所述含有 CHV1-CN280弱毒性病毒的栗疫病菌菌株的菌丝或孢子接种栗树的栗疫病病斑周围 从而使病斑愈合，栗树恢复正常生长。
全文摘要
本发明为可用于防治栗疫病的含有弱毒性病毒CHV1-CN280的菌株，属于植物保护领域。弱毒性栗疫病菌菌株(CHV1-CN280)含有12.7kb的dsRNA病毒。该菌株的菌丝或孢子接种栗树的栗疫病病斑周围从而使病斑愈合，栗树恢复正常生长。CHV1-CN280病毒在栗疫病菌的不同菌株间的传播率高于其他同类病毒，在相差1～4个VC基因的菌株间的平均传播率为74％(培养皿，14天)，而其他同类病毒的传播率平均为48％(34～65％)；而在栗树上病斑上的传播率两年后可达95％。因而对目标栗树上栗疫病的病斑防治效果可以达到95％以上。
文档编号C12N1/14GK101649294SQ200910034989
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月17日 优先权日2009年9月17日
发明者平 丁, 兰春能, 包小梅, 华朝晖, 云 叶, 张林巧, 涛 李, 林少波, 王东龙, 王克荣, 肖江涛, 邓清超, 坤 高 申请人:南京农业大学