专利名称：：一种低产蛋白酶a的啤酒酵母的筛选方法
技术领域：
：本发明涉及一种低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，属于生物与发酵工程领域。
背景技术：
：纯生啤酒的泡沫稳定性衰减问题已成为其质量保证的难题，同时又是世界范围内的研究重点。由于纯生啤酒是不经过热处理而采用物理方式除菌，所以纯生啤酒中含有啤酒酵母自身分泌的蛋白酶A，其可能消化有助于啤酒泡沫稳定性的蛋白质，同时产生没有起泡性能的多肽，导致最终成品啤酒中泡沫稳定性变弱。蛋白酶A对啤酒泡沫的负面影响已经引起国内外许多研究者的研究兴趣，尤其在国内纯生啤酒高速发展的情况下，残留在啤酒中的蛋白酶A的活性问题更引起人们的重视。通过以下三种途径可以降低蛋白酶A对纯生啤酒泡沫的影响第一种途径是工艺控制，限制酶的产生和分泌。酵母在处于不利的生理条件下时蛋白酶A分泌会增多，例如氮缺乏、高乙醇浓度、高二氧化碳含量、高的渗透压。控制好这些工艺条件，可以有效地降低蛋白酶A在发酵液中的活性，从而减少在成品酒中的活性。第二种途径是用抑制剂对啤酒进行后修饰。通过添加酵母蛋白酶A的抑制剂抑制发酵结束后已分泌的蛋白酶A活力，从而降低蛋白酶A在货架期对啤酒泡沬稳定性的影响，例如，中国发明专利申请CN101298586A所公开的一种降低啤酒发酵过程中蛋白酶分泌量的方法。第三种途径是通过遗传育种的方法选育低产蛋白酶A啤酒酵母菌株，主要包括基因工程技术及诱变育种、杂交育种等方法，例如，中国发明专利申请CN1948462A所公开的一种啤酒酵母工程菌及其制备方法与应用。通过工艺控制，增加工艺来实现对酵母分泌蛋白酶A活性的控制，增耗人力物力。通过添加抑制剂降低蛋白酶A活性，目前的研究还比较少，并不是很成熟。在啤酒酿造时，只有选用产蛋白酶A活性低的酵母菌株，才能从根本上解决纯生啤酒泡沫衰减问题。因此选育低产蛋白酶A菌种对于改善纯生啤酒泡沬性能至关重要。无论是应用常规的物理和化学诱变方法还是通过基因工程的方法，最终都将涉及到从改造后的菌株中分离出低产蛋白酶A菌株的问题。
发明内容本发明的目的在于提供一种低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法。蛋白酶A是酵母中目前所知的唯——种在酸性pH范围内水解酸变性血色素(acid-denaturedhemoglobin)的酶，本发明利用蛋白酶A的这一特性从大量的诱变菌中筛选出产蛋白酶A低的酵母菌落，从而将上游的菌株改造技术与最终的菌株分离获得结合起来，在菌体经过改造处理后，快速地分离获得目的菌株，减少选育过程的盲目性，增强预见性，提高育种效率。本发明所述的低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，包括以下步骤(1)将被筛选啤酒酵母菌株涂布YPD平板，28'C培养2-3天；(2)挑选生长旺盛的菌落接种至甘油平板，28。C培养3天，激活蛋白酶A活性；(3)将酸变性血红蛋白覆盖液均匀倒于甘油平板，37。C放置2-3天；(4)在甘油平板中加入三氯醋酸平铺，根据水解圈大小判断蛋白酶A的酶活高低，将水解圈小的菌株筛选出来，获得要筛选的目标菌株。其中，所述YPD平板的成分为2%(w/v)葡萄糖；2%(w/v)蛋白胨；1%(w/v)酵母浸粉；2%(w/v)琼脂。所述甘油平板的成分为2%(w/v)甘油；1%(w/v)蛋白胨；1%(W/V)酵母浸粉；2%(W/V)琼脂。所述酸变性血红蛋白覆盖液的成分为1.5%(w/v)琼脂；0.3%(w/v)，pH值为3.0的酸变性血红蛋白；0.22%(v/v)TritonX-100;0.05M,pH值为4.5的磷酸二氢钾缓冲液。所述三氯醋酸的浓度为10%(v/v)，添加量优选为1-2ml。所述酸变性血红蛋白覆盖液通过以下步骤制得A.配制0.1M,pH值为3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液；B.配制3°/。(w/v)的血红蛋白溶液，用4M的HC1溶液调节pH值至1.0，放置1.5小时并同时在紫外灯下照射30-40分钟后，用O.IM的NaOH溶液调节pH值至3.0，然后用步骤A所制得的甘氨酸-盐酸缓冲液进行稀释，制得in/。(w/v)，pH值为3.0的酸变性血红蛋白溶液；C.配制0.05M，pH值为4.5的磷酸二氢钾缓冲液，121'C下灭菌15min;D.将琼脂粉、Triton-X100溶解于0.05M，pH值为4.5的磷酸二氢钾缓冲液中，煮沸至琼脂溶解，然后冷却(但不要凝固)；E.将步骤B所制得的酸变性血红蛋白溶液与步骤D所制得的混合溶液按照体积比为3:7的比例混合均匀。在本发明中，被筛选啤酒酵母菌株可以是经过基因修饰的或者未经基因修饰自然筛选的啤酒酵母。在本发明中，各种溶液的制备均使用经过反渗透处理的去离子水。本发明所述的低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法可应用于纯生啤酒的酿造。4本发明所述的低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，能够从经过菌株改造的大量酵母菌中快速而高效地获得低产蛋白酶A的酵母菌株，因而减少了选育过程的盲目性，增强了预见性，提高了育种效率。该方法的建立为工业发酵生产低产蛋白酶A的酵母菌株的改造和筛选提供了有效手段，在啤酒发酵工业中具有广阔的推广和应用前景。具体实施例方式实施例l:酸变性血红蛋白覆盖液的制备配制O.IM，pH值为3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液称取3.75gGly，2.97gNaCl，定容到500ml;配制0.1MHCL溶液200ml;取配好的HCl溶液89ml,Gly-NaCl溶液411ml，混匀；将pH计的电极插入所配溶液中，用0.1MNaOH溶液微调pH至3.0。配制1%(w/v),pH值为3.0的酸变性血红蛋白溶液称取0.3g血红蛋白溶于10ml蒸馏水中，用4MHCl溶液调pH至1.0;放置1.5h,放置的同时在紫外灯下照30-40分钟，灭菌；再用0.1MNaOH溶液调pH至3.0;调好后用所制得的甘氨酸-盐酸缓冲液补足体积到30ml，备用。配制0.05M，pH值为4.5的磷酸二氢钾缓冲液称取3.403gKH2P04，定容至500ml，此时的pH值约为4.58，用HCl调pH至4.50，121。C下灭菌15min。将1.5g琼脂粉，220ulTriton-XlOO溶于70ml0.05MpH值为4.5的磷酸二氢钾缓冲液中，水浴加热煮沸至琼脂溶解，然后冷却，但不要凝固。最后，将该溶液与30ml酸变性血红蛋白溶液混合均匀，即制得酸变性血红蛋白覆盖液。实施例2选取啤酒企业分离得到的6号啤酒酵母，对其进行诱变。诱变后的菌液涂布YPD平板，每板约100个菌落，28'C培养2-3天，至菌落可见；挑取生长旺盛的菌落转移至甘油平板培养3-4天，激活蛋白酶A活性；将10ml酸变性血红蛋白覆盖液均匀倒于甘油平板，覆盖菌落，37'C放置2-3天；在甘油平板中加入lml浓度为10°/。(v/v)的三氯醋酸平铺。观察菌落周围产生的透明水解圈，筛选水解圈小于6号啤酒酵母出发菌株的5株诱变菌株。对筛选出的诱变菌株进行发酵培养挑取上述筛选出的菌种一环；接入10mL麦汁培养液中，28'C培养24小时；再将活化好的试管中菌液全部接入装有300mL无菌麦汁的三角瓶中，用发酵栓密封，12。C发酵9天，每天称重，记录每日失重量，当单日失重量在0,2克以内表明发酵结束。待发酵结束后，检测发酵液蛋白酶A活力。实施例3对购于中国食品发酵工业研究院微生物菌株平台(CICC)的啤酒酵母1894进行诱变。5诱变后的菌液涂布YPD平板，每板约100个菌落，28。C培养2-3天，至菌落可见；挑取生长旺盛的菌落转移至甘油平板培养3-4天，激活蛋白酶A活性；将10ml酸变性血红蛋白覆盖液均匀倒于甘油平板，覆盖菌落，37'C放置2-3天；在甘油平板中加入lml浓度为10%(v/v)的三氯醋酸平铺。观察菌落周围产生的透明水解圈，筛选水解圈小于啤酒酵母1894出发菌株的4株诱变菌株。对筛选出的诱变菌株进行发酵培养挑取上述筛选出的菌种一环；接入10mL麦汁培养液中，28。C培养24小时；再将活化好的试管中菌液全部接入装有300mL无菌麦汁的三角瓶中，用发酵栓密封，12'C发酵9天，每天称重，记录每日失重量，当单日失重量在0.2克以内表明发酵结束。待发酵结束后，检测发酵液蛋白酶A活力。实施例4对自中国食品发酵工业研究院酿酒部获取的酿酒酵母菌株yy进行诱变处理，此酵母菌株具备低产蛋白酶A的性质。诱变后的菌液涂布YPD平板，每板约100个菌落，28'C培养2-3天，至菌落可见；挑取生长旺盛的菌落转移至甘油平板培养3-4天，激活蛋白酶A活性；将10ml酸变性血红蛋白覆盖液均匀倒于甘油平板，覆盖菌落，37i:放置2-3天；在甘油平板中加入lml浓度为10%(v/v)的三氯醋酸平铺。观察菌落周围产生的透明水解圈，筛选水解圈小于酿酒酵母yy出发菌株的3株诱变菌株。对筛选出的诱变菌株进行发酵培养挑取上述筛选出的菌种一环；接入10mL麦汁培养液中，28。C培养24小时；再将活化好的试管中菌液全部接入装有300mL无菌麦汁的三角瓶中，用发酵栓密封，12t:发酵9天，每天称重，记录每日失重量，当单日失重量在0.2克以内表明发酵结束。待发酵结束后，检测发酵液蛋白酶A活力。实施例5:蛋白酶A活力的检测方法取1500pL磷酸氢二钾一柠檬酸缓冲液(pH=5.3)于一玻璃试管中，加入1368jiL去离子水，加入待测样品120nL，最后加入12pLlmM荧光底物。试样混合均匀，放入30°C水浴锅中，反应30min后，放入8(TC灭活5min，快速冷却到室温，用荧光分光光度计测量荧光强度，激发波长XeF328nm，发射波长Xen^393nm。待测样品先进行除气(成品啤酒)或者先经双层滤纸过滤(发酵液)，空白样品为去离子水。蛋白酶A活力以荧光值计算。蛋白酶A活力降低率按照以下公式计算出发菌株酶活的相对值=出发菌株的酶活力值一空白酶活力值诱变菌株酶活的相对值=诱变菌株的酶活力值一空白酶活力值诱变菌株酶活的降低率(％)=(出发菌株酶活的相对值一诱变菌株酶活的相对值)/出发菌株酶活的相对值X100%按照上述检测方法，分别对实施例2、3、4中所筛选得到的诱变菌株的蛋白酶A活力进行检测，并分别计算其蛋白酶A活力降低率，计算结果见表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>检测结果表明，本发明所述的低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，能够从经过诱变处理的大量酵母菌中快速而高效地筛选出低产蛋白酶A的酵母菌株。权利要求1、一种低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，包括以下步骤(1)将被筛选啤酒酵母菌株涂布YPD平板，28℃培养2-3天；(2)挑选生长旺盛的菌落接种至甘油平板，28℃培养3天，激活蛋白酶A活性；(3)将酸变性血红蛋白覆盖液均匀倒于甘油平板，37℃放置2-3天；(4)在甘油平板中加入三氯醋酸平铺，根据水解圈大小判断蛋白酶A的酶活高低，将水解圈小的菌株筛选出来，获得要筛选的目标菌株。2、根据权利要求1所述的低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，其特征在于，所述酸变性血红蛋白覆盖液含有以下成分1.5%(w/v)琼脂；0.3%(w/v)，pH值为3.0的酸变性血红蛋白；0.22%(v/v)TritonX-100;0.05M，pH值为4.5的磷酸二氢钾缓冲液。3、根据权利要求2所述的低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，其特征在于，所述酸变性血红蛋白覆盖液通过以下步骤制得A.配制0.1M，pH值为3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液；B.配制3%(w/v)的血红蛋白溶液，用4M的HCl溶液调节pH值至1.0，放置1.5小时并同时在紫外灯下照射30-40分钟后，用O.IM的NaOH溶液调节pH值至3.0，然后用步骤A所制得的甘氨酸-盐酸缓冲液进行稀释，制得1%(w/v)，pH值为3.0的酸变性血红蛋白溶液；C.配制0.05M，pH值为4.5的磷酸二氢钾缓冲液，121。C下灭菌15min;D.将1.5%(w/v，以终体积计算)琼脂粉、0.22%(v/v，以终体积计算)Triton-X100溶解于0.05M，pH值为4.5的磷酸二氢钾缓冲液中，煮沸至琼脂溶解，然后冷却；E.将步骤B所制得的酸变性血红蛋白溶液与步骤D所制得的混合溶液按照体积比为3:7的比例混合均匀。4、根据权利要求1所述的低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，其特征在于所述三氯醋酸的浓度为10%(v/v)，添加量为1-2ml。5、根据权利要求1至4的其中之一所述的低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，其特征在于所述被筛选啤酒酵母菌株是经过基因修饰的或者未经基因修饰自然筛选的啤酒酵母菌株。6、权利要求1所述的低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法在酿造纯生啤酒中的应用。全文摘要本发明公开了一种低产蛋白酶A啤酒酵母的筛选方法，包括以下步骤(1)将被筛选啤酒酵母菌株涂布YPD平板，28℃培养2-3天；(2)挑选生长旺盛的菌落接种至甘油平板，28℃培养3天，激活蛋白酶A活性；(3)将酸变性血红蛋白覆盖液均匀倒于甘油平板，37℃放置2-3天；(4)在甘油平板中加入三氯醋酸平铺，根据水解圈大小判断蛋白酶A的酶活高低，将水解圈小的菌株筛选出来，获得要筛选的目标菌株。该方法能够从经过菌株改造的大量酵母菌中快速而高效地获得低产蛋白酶A的酵母菌株，减少了选育过程的盲目性，增强了预见性，提高了育种效率，在啤酒发酵工业中具有广阔的推广和应用前景。文档编号C12N1/18GK101481661SQ200910036880公开日2009年7月15日申请日期2009年1月22日优先权日2009年1月22日发明者孔祥诚,宋绪磊,琳李,李惠萍,王德良申请人:广州珠江啤酒股份有限公司