专利名称：：一种检测多癌风险易感性的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属肿瘤分子遗传学领域，涉及多癌风险易感性检测及SNP诊断试剂盒的制备。
背景技术：
：肿瘤是一种多基因复杂性疾病，其发生是环境因素与肿瘤遗传易感因素共同作用的结果。而基因的单核苷酸点突变所造成的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)是遗传易感的重要物质基础之一。如果抑瘤基因的突变或多态性等位基因型，如SNP存在家族与人群聚集性，可显著提高患肿瘤的风险，那么对于这些SNP位点在健康或肿瘤人群中进行筛査，无疑能对具有肿瘤遗传易感倾向的人群起到的风险预警和早期诊断的作用。传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。这些技术虽在某种程度上能完成对SNP的检测，但由于它们必须通过凝胶电泳进行检测，因此，距快速、高效、自动化的检测目标还相差甚远。传统的RFLP只能检测到SNP的一部分，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，而且DNA链的二级结构还容易造成人工假相，使测序结果出现偏差，不适宜于SNP的检测；SSCP则很难满足自动化的需要，难以大规模开展工作。因此，这些方法均未被广泛采用。DNA芯片技术是近年来新开发的一种DNA序列变异检测工具，但如果涉及的SNP位点不多时，用高通量DNA芯片则因成本较高也不适宜。相比之下，变性高效液相色谱(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography,DHPLC)在SNP检测上具有较大的优势。DHPLC是一种在SSCP和DGGE基础上发展起来的新的高通量筛选DNA序列变异的技术，其原理是通过HPLC在部分变性的条件下将发生错配的异源杂合双链DNA与完全匹配的同源双链DNA分离幵来。该技术可以自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失，还可分离分析大小相近而序列存在差异的DNA，是一种高性价比的检测技术。与传统的测序法相比较，上样前PCR产物不需要酶切、纯化，可直接进行分析，同时过柱不需要灌胶、上样、电泳等繁琐的跑胶过程，大大降低了交叉污染的几率、减少了工作量和成本。因此具有高通量、自动化、快速、检出率高、重复性好、检测DNA片段大小范围广等优点。运用DHPLC技术的WAVE核苷酸片段分析系统可以快速、自动化地进行分析。国内外，DHPLC技术己在基因分型分析、癌症的突变检测、地中海贫血的基因诊断等方面得到了广泛的应用。
发明内容本发明的目的在于通过研究与肿瘤发生关联的SNP，从而提供一种检测人类多癌风险易感风险性的方法。本并针对SNPs位点制备出用于肿瘤遗传易感诊断的试剂盒，用于正常人群肿瘤遗传易感性的筛查，起到风险预警、早期诊断的作用。发明人通过研究证实AADAC基因(arylacetamidedeacetylase，基因存取号NM—001086)启动子区的两个SNP位点rsl6833935和rs8193024的特定基因型与癌家系的肿瘤发生共分离，这种基因型在家系内外的分布差异具有统计学意义(x2=48.00p<0.0001)。AADAC基因位于人类染色体3q25.1，其编码的蛋白产物是芳乙酰胺脱乙酰酶，参与芳香族化合物的生物代谢和生物转化。其外显子或调控区的改变或一些SNP可能与多种肿瘤的发生密切相关。目前在AADAC基因启动子区发现两个SNP位点的基因型在多癌家系内外及正常和肿瘤人群中的分布有统计学差异，提示这些位点特定基因型与肿瘤的发生有重要的关系，针对这些位点进行人群中的基因分型可以起到患癌风险预测的作用。在此研究基础上，发明人提出本发明的技术方案。本发明的检测人类多癌易感风险性的方法包括检测AADAC基因启动子区的两个SNP位点rsl6833935和rs8193024的特定基因型，rsl6833935特定基因型包括阴性基因型cc和多癌易感风险基因型tc/tt，rs8193024特定基因型包括阴性基因型aa和多癌易感风险基因型ga/gg。对这两个SNP位点的检测，可以采用各种常规方法，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等，但本发明推荐最好采用DHPLC方法。用DHPLC方法检测本发明两个SNP位点的基本步骤为(1)分离和提取待测样本gDNA;(2)选择和设计引物，针对两个SNP位点rsl6833935和rs8193024的上游300bp和下游300bp各600bp范围的片段分别设计两对引物；(3)以样本gDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增；(4)将待测样本PCR产物与阴性对照的样本DNA等量混合变性后，用HPLC系统进行检测，根据检测结果区分多癌风险易感阴性和阳性结果。考虑到人群中大量样本为阴性，本发明在传统DHPLC方法上进行改进，不是将单纯样本PCR产物上DHPLC仪进行检测，而是采取将待测样本PCR产物与阴性对照的样本DNA等量混合，变性后上DHPLC检测。这样DNA双链经变性后打开，如果有突变的话，缓慢复性后重新结合的双链中就会出现异源链，从而在DHPLC图中出现双峰。混合法可以减少的DHPLC次数并提高一次DHPLC的判别效能。可以只用一次DHPLC就区分风险易感人群和正常人群。为适应DHPLC方法快速检测上述两个SNP，本发明提供一种用于检测人类多癌风险易感风险性的诊断试剂盒。该试剂盒包括常规DNA抽提试剂，PCR试剂和DHPLC检测用试剂。在PCR试剂中包括常规PCR试剂，如高保真Taq酶、MgC产缓冲液、PCR专用去离子水等之外，还包括两个待测SNP位点rsl6833935和rs8193024的上下游PCR引物，两对引物分别针对两个SNP位点rsl6833935和rs8193024的上游300bp和下游300bp各600bp范围的片段而设计，产物大小在200300bp之间。在DHPLC检测用试剂中，除包含常规HPLC试剂外，还包括所述两个SNP的阴性对照基因组DNA。所述引物具体核苷酸序列如下-(1)针对位点rsl6833935的引物序列LEFTPRIMER5'-tccctttccaagtccttctc-3'RIGHTPRIMER5'画gcagcgtaatggatgatttc-3'(2)针对位点rs8193024的引物序列LEFTPRIMER5'-aagccattctgaagaggaaac-3'RIGHTPRIMER5'-tactaccagtgcccacaaagc-3'本发明试剂盒的使用方法为(O用枸橼酸钠抗凝管收集待测个体外周血样本，抽提基因组DNA(大于50ng/样本)；(2)用本发明试剂盒进行PCR扩增，得到产物特异目的条带；(3)取PCR产物与阴性纯合子DNA等量混合，用变性高效液相色谱系统进行检测，区分多癌风险易感阴性和阳性结果。本发明的优点为本发明首次发现位于人类染色体3q25.1的AADAC基因的启动子区存在两个SNP位点rsl6833935和rs8193024，该两个SNP的特定基因型在家系中与肿瘤疾病共分离。因此在此基础上提出一种通过SNP来检测人类多癌易感风险性的方法和试剂盒，并且经临床实验研究验证，本检测方法具有可行性，本发明的检测试剂盒具有良好灵敏性、稳定性和特异性。用本发明的试剂盒对正常人群进行肿瘤遗传易感性的筛查，能有效起到风险预警、早期诊断的作用。本发明的进一步优点在于运用DHPLC对上述两个SNP进行检测时，在传统DHPLC的检测方法上，本发明采用混合的方法，即将阴性纯合子和待测样本等量混合，以提高单次DHPLC的判别效能，这种方法较传统检测方法更加适合含有大量阴性样本的筛査。图l:是本发明的检测方法流程图；图2:本发明中研究的多癌家系图谱；图3:用GeneHunter软件对MS结果进行单点、多点的参数和非参连锁分析的LOD值图4:琼脂糖凝胶电泳得到特异目的条带；图5:rsl6833935基因分型的测序图；图6:rs8193024基因分型的测序图。具体实施例方式实施例1:前期研宄发现3q24-26与多癌家系紧密连锁前期研究中，发明人在湖南发现一个罕见多癌大家系，有六代超过103人。其中患者15人，存活有10人，涉及多种良恶性肿瘤，多癌家系图谱参见附图2。为了定位与疾病连锁的染色体区段，我们首先采用了高通量SNP芯片(Affymetrix公司HumanMapping500KSNPArray)进行全基因组扫描和分型，通过Merlin软件进行单点参数连锁分析，在3q24-3q26得到了LOD值大于2的区域。后来进一步针对该区域采用微卫星进行精细定位，通过Genehunter软件进行多点非参连锁分析时，最大LOD值达到了10.674(p=0.00195)，定位于D3S1584D3S3710之间，证实了该区段确实与疾病位点密切连锁(参见附图3)。在进一步用Cyrillic软件进行的单体型分析中，也发现有典型的单体型区间(D3S1555-D3S3575)与疾病共分离。而后，发明人对该区段感兴趣的Refseqgene展开了突变筛査工作，首先锁定了一些可能与肿瘤发生发展密切关联的基因。针对这些基因的外显子及内外显子交界、启动子区进行测序，最终在基因AADAC的启动子区发现了两个SNP位点rsl6833935和rs8193024的某种特定基因型在家系中与疾病共分离(参见表2)，这种基因型在家系内外成员的患者或携带者、非携带者或正常外系中的分布差异通过卡方检验具有统计学意义(p<0扁1)。_表2两个SNP位点在家系中的基因型分布rsl6833935基因分型rs8193024基因分型合计tt/tcccgg/ga患者/携带者13013013<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>发明人将收集的200例正常人群和100例各种肿瘤病人的DNA中采用限制性酶切位点分析法进行这两个位点的基因分型，证实这两个位点的特定基因型在正常和肿瘤人群中的分布差异同样具有统计学意义(p<0.0005)。提示它与肿瘤的风险易感相关，可作为肿瘤风险预测的分子耙标。实施例2:肿瘤风险易感SNP诊断试剂盒的制备(一)针对SNP位点的引物设计1.模板序列的选取模板序列来自UCSC数据库(http:〃ge薩e扁c.edu7)，针对SNP位点上下游各300bp选取，以保证PCR产物在合适的片段范围便于检测。2.引物设计PCR引物设计有3条基本原则首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。具体考虑因素包括引物长度(primerlength)、产物长度(productlength)、序列Tm值(meltingtemperature)、AG值(internalstability)、引物二聚体及发夹结构(duplexformationandhairpin)、错误引发位点(falseprimingsite)、引物及产物GC含量(composition)等。在考虑了以上因素后，采用在线软件Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/)设计引物，我们在诸多输出引物结果中选择了两对最合适的两对引物。具体引物序列如下针对位点rs16833935的引物序列LEFT5'-tccctttccaagtccttctc-3'，RIGHT5'-gcagcgtaatggatgatttc-3';针对位点rs8193024的引物序列LEFT5'-aagccattctgaagaggaaac-3'，RIGHT5'-tactaccagtgcccacaaagc-3'。3.引物特异性检测为了验证引物的特异性，进一步在UCSCBlat数据库中进行序列比对(http:〃genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatcommand=start)。在输出的结果中刚好只有引物所在染色体正反链位置上的两条序列比对上，就说明该对引物的特异性很好，可以初步选为SNP诊断试剂盒的引物序列。发明人用PCR实验和跑胶进一步确认了所选择引物的特异性，选择的引物出现特异性目的带(参见附图4)。(二)SNP诊断试剂盒的制备通过前期实验证实，具校正功能的DNA聚合酶比Taq聚合酶更适合于DHPLC突变或SNP分析。因此，我们选择了TaKaRa公司具有校正功能的高保真DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase作为SNP诊断试剂盒的PCR酶。SNP诊断试剂盒的核心组分包括如下(1)DNA抽提试剂TaKaRa公司全血基因组抽提试剂盒(UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0)(2)PCR相关试剂令Marked上下游引物干粉(各20D):2支今Marker2上下游引物干粉(各20D):2支今高保真DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase:100jil今5xPrimeSTARTMBuffer(Mg2+Plus):1mlx2今dNTPMixtureC各2.5mM):800|xl今两个SNP各自的阴性对照(纯合子AA)BloodgDNA(50ng/nl):lOOplx2々MiniQTM超纯水5ml(3)DHPLC所需的常规试剂今BufferA:O.ITEAA溶液；今BufferB:O.ITEAA溶液；今BufferC:WashSolution;今BufferD:StorageSolution(75%acetonitrile);今DNA分子量标准100bpDNAladder(100至600bp的Marker),参照片段(bp)600500400300200100主要溶液今红细胞裂解液；今白细胞裂解液今TE(lOmMTris+lmMEDTA)今饱和NaCl5M今6M凝胶加样缓冲液今5M电泳缓冲液(TBE)引物人工合成。通过测序方法筛査两个SNP位点基因型为阴性的纯合子(AA)个体，并采用全血基因组抽提试剂盒提取其外周血gDNA，跑胶呈均一条带，测吸光度OD值在1.8左右为质量合格，将其作为阴性对照DNA。另外根据各条引物的Tm值，在Tm上下五度范围，采用梯度PCR摸索得到两对引物各自的最佳退火温度。实施例3:SNP诊断试剂盒的使用步骤使用步骤参见附图l。步骤l血液样本的采集和gDNA的抽提血液样本的采集与处理使用德国格雷那公司VACUETTE(非可替)5mlEDTA抗凝管，采集待测个体外周血样本5ml，4"C保存，两周内抽提gDNA。如果不马上抽提gDNA，可以将抗凝管放至冰箱-2(TC保存，待收集了多个样本后一起抽提。gDNA抽提使用TaKaRa公司全血基因组抽提试剂盒(UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0)提取BloodgDNA(步骤详见产品说明书)。取2|ilDNA样本跑胶，同时取2^1gDNA样本稀释到lOOnl，测吸光度值，按照公式DNA浓度吸光度值x稀释倍数x40(单位为ng/pl或pg/ml)计算抽提的DNA浓度，取250ng稀释为50ng^d(共50pl)待用，余下样本-8(TC保存。步骤2PCR扩增(1)引物稀释将SNP试剂盒中的装有干粉引物的离心管取出，常温点离，按照说明配制5x引物原液(50mM)，再按照h5稀释一部分为lx引物工作液(1CHiM)，待用。引物原液于-20。C保存，引物工作液于4t:保存。(2)PCR体系按下列组分配制PCR反应液:_5xPrimeSTARTMBuffer(Mg2+plus)lO(ildNTPMixture(各2.5mM)4plPrimer1(10|iM)lplPrimer2(IO一)l|il模板DNA50ngPrimeSTARTMHSDNAPolymerase(2.5，)0.5jilMiniQ水upto50fxlPCR反应条件设置如下①3Step法98°C10sec55。C5sec或15sec72°C1mi幽p②2Step法30Cycles98°C68。C10sec1min/kbp30Cycles凝胶电泳反应结束后，取5nlPCR产物加入lfil6xTaKaRa上样缓冲液，与6^1TaKaRaDL2000Marker在含EB的1.5%琼脂糖上一起凝胶电泳，电压100mV，30min后在紫外分析仪(美国BIO-RAD凝胶成像分析系统)上检测PCR扩增产物的特性。如为相应长度的单一PCR扩增条带，即认为扩增成功，待DHPLC步骤3DHPLC检测DHPLC所用设备及试剂1)仪器WAVETM2100核酸片段分析系统(美国Transgeneomic公司)；2)试剂今BufferA:O.ITEAA溶液(50ml2MTEAA+250placetonitrile定容至1L);今BufferB:O.ITEAA溶液(50ml2MTEAA+250|_dacetonitrile定容至1L);今BufferC:WashSolution(8%acetonitrile:80mlacetonitrile定容至1L);今BufferD:StorageSolution(75%acetonitrile:750mlacetonitrile定容至1L);DNA分子量标准100bpDNAladder(100至600bp的Marker),北京天为时代生物有限技术公司产品，参照片段(bp)600500400300200100主要溶液的配置今红细胞裂解液氯化铵78g碳酸氢铵8gEDTA18g溶解至1000ml蒸馏水中，PH调定至7.8，使用时稀释10倍，4"C保存。今白细胞裂解液Tris-CllOmmol/LEDTA2mmol/LNaCl400mmol/L今TE(lOmMTris+lmMEDTA)今饱和NaCl5M146.2g溶解至500ml蒸馏水中今6M凝胶加样缓冲液0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF50%甘油水溶液今5M电泳缓冲液(TBE):Tris30.25gEDTA-2Na1.6g硼酸13.35gDHPLC检澳!)因为DHPLC具有很高的敏感性和准确性，取PCR产物1.4lU，与纯阴性样本的DNA等量混合，95'C变性5min后以1°C/min速率缓慢降至65°C复性，然后以不同的溶解温度(Marked:61°C;Marker2:60°C)上DHPLC进行检测，根据不同峰型区分基因型。在我们的研究中，假设阴性对照的基因型为AA，而AB和BB的基因型(参见图5、图6)是具有肿瘤患病风险的基因型，因此我们首要的目的是区分阴性和肿瘤患病风险阳性这两类基因型。由于人群中大量样本可能为阴性，传统方法使得大部分样本都需要进行第二次的DHPLC才可以区分AA和BB基因型。而本发明则将传统DHPLC进行改进，将样本PCR产物与阴性样本DNA等量混合，部分变性后上DHPLC仪进行检测。将待测样本和阴性对照的样品等量混合，变性后上DHPLC检测，这样DNA双链经变性后打开，如果有突变的话，缓慢复性后重新结合的双链中就会出现异源链，从而在DHPLC图中出现双峰(参见表3)。表3.不同基因型所对应的峰型待测个体基因型等量加入阴性对照变性复性后存在的基因型峰型分型AAAA单峰AAABAB、AA双峰进一-步确认基因型BBAB、BB、AA双峰进一-步确认基因型混合法可以减少的DHPLC次数并提高一次DHPLC的判别效能。可以只用一次DHPLC就区分风险易感人群和正常人群。接下来对于目标人群可以采用测序的方法进一步确认其基因型，也可以用患者没有参合阴性对照的PCR产物再次进行DHPLC,结果呈双峰的为杂合子(基因型AB)，呈单峰的为阳性纯合子(基因型BB)。将DHPLC分析后的特异峰型与己知的或本发明提供不同位点不同基因型的峰型进行比较，根据比较结果确定SNP基因型。实施例4:SNP检测试剂盒特异性、稳定性的验证发明人收集了180例待测样本，用本试剂盒对样本进行SNP基因型检测，结果如表4。同时，采用基因分型的金标准测序法验证检测结果，其结果统计如表4所示。通过对两种方案的比较，我们可以看出，本发明所涉及的方法和试剂盒具有良好的可行性和稳定性。表4测序法和DHPLC法的比较基因型测序法(金标准)DHPLC法符合不符漏检符合率％准确率。/。检出率％rsl6833935tt00廳雨100tc161600100100100cc1591551197.599.498.1合计1801781198.999.499.4rs8193024gg4400100100100121200100100100aa1641622098.8100100合计1801782098.9100100权利要求1.一种检测多癌风险易感性的方法，包括检测与肿瘤发生关联的SNP等位基因，其特征在于所述的与肿瘤发生关联的SNP位于AADAC基因启动子区的两个位点rs16833935和rs8193024，rs16833935位点的特定基因型包括阴性基因型cc和多癌易感风险基因型tc/tt，rs8193024位点的特定基因型包括阴性基因型aa和多癌易感风险基因型ga/gg。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于检测所述SNP的方法为变性高效液相色谱方法，包括步骤(1)分离和提取待测样本gDNA;(2)选择和设计引物，针对两个SNP位点rsl6833935和rs8193024的上游300bp和下游300bp各600bp范围的片段分别设计两对引物；(3)以样本gDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增；(4)将PCR产物用HPLC系统进行检测，根据检测结果区分多癌风险易感阴性和阳性结果。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中针对位点rsl6833935的引物序列L:5'國tccctttccaagtccttctc-3'，R:5'-gcagcgtaatggatgatttc-3';针对位点rs8193024的引物序列为L:5'-aagccattctgaagaggaaac画3'，R:5'-tactaccagtgcccacaaagc-!3'04.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述步骤(4)是在将待测样本PCR产物中加等量阴性对照的样本DNA混合，变性后上HPLC系统检测。5.用于权利要求4所述方法的SNP检测试剂盒，包括常规DNA抽提试剂，PCR试剂和DHPLC检测用试剂，其特征在于在PCR试剂中包含两个待测SNP位点rsl6833935和rs8193024的上下游PCR引物，两对引物分别针对两个SNP位点rsl6833935和rs8193024的上游300bp和下游300bp各600bp范围的片段而设计，产物大小在200300bp之间；在DHPLC检测用试剂中，还包括所述两个SNP的阴性对照基因组DNA。全文摘要本发明公开了一种检测多癌风险易感性的方法及试剂盒，包括检测与多癌家系发生关联的AADAC基因启动子区的两个SNP位点rs16833935和rs8193024的特定基因型，rs16833935特定基因型包括阴性基因型cc和多癌易感风险基因型tc/tt，rs8193024特定基因型包括阴性基因型aa和多癌易感风险基因型ga/gg。为适应DHPLC方法快速检测上述两个SNP，本发明提供一种用于检测人类多癌风险易感风险性的诊断试剂盒。本发明的检测方法和试剂盒具有可行性、稳定性和特异性，用本发明的试剂盒对正常人群进行肿瘤遗传易感性的筛查，能有效起到风险预警和早期诊断的作用。文档编号C12Q1/68GK101613747SQ20091004302公开日2009年12月30日申请日期2009年4月3日优先权日2009年4月3日发明者周艳宏,张文玲,利曹,曾朝阳,李桂源,武明花,炜熊,岚肖,谭世明申请人:中南大学