专利名称：用于柑橘溃疡病菌检测的引物对及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及柑橘溃疡病菌检测用引物和检测方法。
背景技术：
柑橘溃疡病是由柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. Citri)感染所致的
重要的检疫性病害，为国内外检疫对象，严重影响柑桔安全生产和对外贸易，已被我国国家
质检总局列入2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。 该病菌在叶、枝梢及果实的病斑中越冬，翌年春条件适宜时从病部溢出，借风雨、
昆虫传播，经寄主的气孔，皮孔和伤口侵入。使叶片、嫩梢和果实发病，目前还没有一种有效
根除该病菌的方法。我国多数甜橙和柚类产区此病有不同程度发生，在经济上造成损失最
大的是柑橘。 柑橘溃疡病的检疫目前大多以植株发病症状的观察为主，在一般情况下完全可凭 肉眼判断，但许多抗病或非敏感品种缺乏明显症状，易与其他病害混淆，同时由于黄单胞菌 的种类及变种繁多，针对柑桔溃疡病菌的生化鉴定十分繁杂和困难。目前国内外针对柑 橘溃疡病菌的检测技术研究基本建立在常规PCR和实时荧光PCR的基础上，王中康等和 H. D. Coletta-Filho设计了柑橘溃疡病菌的检测引物并采用常规PCR方法对该病菌进行了 检测，Vessela Mavrodieva等应用实时荧光PCR方法对柑橘溃疡病菌进行了检测方面的研 允。 双重PCR技术可针对两个不同区域的DNA序列进行检测，大大提高DNA分子检测 的精准度，达到提高检出率的目的。变性高效液相色谱(DHPLC)技术是通过将待测的PCR 核酸片段在缓冲液携带下流过专利的DNA分离柱，利用缓冲液的不同梯度变化，实现对不 同大小核酸片段的分离和分析，由紫外检测被分离的DNA样品；并在部分变性的柱温条件 下通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间不同的原理，检测分析DNA位点差异和突变，对 结果进行更灵敏的分析和比对。目前尚没有采用双重PCR结合高效变性液相色谱(doublx PCR-DHPLC)的技术对柑橘溃疡病进行快速准确检测的研究报道。
发明内容
本发明目的在于提供用于柑橘溃疡病菌双重PCR-DHPLC检测的引物和方法。
本发明通过已报道的柑橘溃疡病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri 0PM-12SCAR fragment区域序列(gb IAF312370. 1)设计了用于本发明的引物对SEQ ID NO. 1 和2，并结合Coletta-Filho等报道的引物SEQ ID NO. 3和4对进行双重PCR-DHPLC方法检 测柑橘溃疡病菌，所述的两对由正向和反向引物组成的引物对，其核苷酸序列分别为
SEQ ID NO. 1 :5' -ACGCTCGATCTGCACCTATT—3，；
SEQ ID NO. 2 :5' -CCAACGAGTCTCAAGCATCA-3，；
SEQ ID NO. 3 :5' -CGCCATCCCCACCACCACCACGAC-3';
SEQ ID NO. 4 :5' -AACCGCTCAATGCCATCCACTTCA-3，。
本发明还给出了应用上述引物的双重PCR-DHPLC方法，其以细菌DNA为模板，进行 双重PCR扩增，扩增后的PCR产物直接进行DHPLC分析。 其反应体系为10 X PCR buffer 2. 5 ii L， dNTPs (lOmmol/L) 0. 5 ii L， MgC12(25,l/L)2iiL，10iimol/L弓l物各l.OiiL， Taq DNA polymerase (2U/ii L) 1. 0 ii L， lng/ ii L 10ng/ ii L， DNA模板5 y L，灭菌超纯水补足至25 y L。 其中，上述反应条件可以是96。C预变性5min ;96。C变性30s， 63。C退火30s， 72°C 延伸30s，循环反应30次；72。C延伸5min。 DHPLC分析条件设定为进样量5 ii L，柱温50°C ，选择全片段检测程序进行检测， 流速0. 9mL/min。 本发明还建立了进一步对双重PCR-DHPLC分析得到结果阳性的PCR产物进行鉴定 的DHPLC分子鉴定体系和分子标本。即以设计的引物SEQ ID NO. 1和2扩增柑橘溃疡病菌 菌株DNA的PCR产物作为PCR-DHPLC鉴定方法的标记物。未知扩增产物通过与该标记物进 行半变性DHPLC分析可以对未知菌进行柑橘溃疡病菌的鉴定。DHPLC检测条件为设定片 段大小为236bp，每次进样5 ii L，检测温度Tm = 65°C ，以流速0. 9mL/min进行分析。
对于双重PCR-DHPLC而言，选择适当的引物是分析方法灵敏度和准确度的保障。
本发明还提供含有所述弓I物的试剂盒。 进一步，本发明提供的试剂盒中还有引物SEQ ID NO. 1或/和2编码的核酸分子。
本领域技术人员熟知，SEQ ID NO. 1或/和2中个别碱基的变化是可以容忍的。 本发明设计用于检测柑橘溃疡病菌的引物特异性好，检测灵敏度高，本发明的检
测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有柑橘溃疡病菌，为进出口安
全提供了保证。
图1双重PCR-DHPLC检测柑橘溃疡病菌DNA结果；
图2本发明方法灵敏度检测结果； 图3引物SEQ ID NO. 1和2扩增柑橘溃疡病菌DNA片段DHPLC半变性检测。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。 实施例1 引物的设计和合成*艮据矛艮道的树橘馈嫁病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri 0PM—12 SCARfragment区域序列(gb | AF312370. l)，设计了引物序列为
SEQ ID NO. l(正向):5， -ACGCTCGATCTGCACCTATT—3，;
SEQ ID NO. 2(反向):5， -CCAACGAGTCTCAAGCATCA-3，。
根据报道的引物，引物序列为 SEQ ID NO. 3(正向):5， -CGCCATCCCCACCACCACCACGAC-3，;
SEQ ID NO. 4(反向)5， -AACCGCTCAATGCCATCCACTTCA-3，。
实施例2
菌体的收集 平板上生长的菌落接种环直接挑取菌落至少5个至1. 5mL离心管中，加入lmL灭 菌水充分振荡，8000g离心3min，弃上清，再向管中加入lmL灭菌水，重复三次，取沉淀提取 DNA，进行双重PCR-DHPLC检测。 柑橘叶片或材料用6mm打孔器在柑橘叶片上打取小孔50片，有病斑材料打取病
斑部分，或取有病症组织材料约lg加入lmL灭菌蒸馏水充分振荡洗涤，取洗涤液8000g离
心5min，弃去上清，取沉淀提取DNA，进行双重PCR-DHPLC检测。 实施例3 细菌DNA的提取
1)在沉淀中加入TE缓冲液600 ii L， 10% SDS溶液30 y L， 20mg/mL蛋白酶K15 y L，
混匀，37t:水浴孵育lh。 2)加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24 : l)，混匀。10000g离心5min，将上清液
移至一个新离心管中。 3)加入等体积酚-三氯甲烷-异戊醇(25 : 24 : 1)，混匀，10000g离心5min，将
上清液移至一新离心管。 4)加入O. 6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-2(TC沉淀lh， 10000g离心5min，弃上清。
5)加入lmL70X乙醇洗涤沉淀，8000g离心，弃上清，晾干。
6)加入50 ii LTE缓冲液溶解DNA沉淀，-2(rC长期保存备用。
实施例4 双重PCR-DHPLC检测方法的建立 本方法选择了 5株不同来源的柑橘溃疡病菌菌株作为阳性对照，同时采用了柑橘
叶片中分离的部分微生物、几种常见并与柑橘溃疡病菌近缘的植物病原菌及部分其它植物
病原菌做为参试菌株进行比较分析。供试菌株具体情况如表1。 表1供试菌及其来源菌株编号菌种名称来源
Al中国检验检疫科学研究院
A2X(3"//z。;w。"as axoMopocfo pv. c/W中国检验检疫科学研究院
A3X朋Aootowos axoMopocifo pv. c"n'重庆大学
A4XaW/zow owas axoMO/W(fc pv,重庆大学
A5A-a"论。附cwas axo"qpo(sfo pv. c"W湖南农业大学
CK1自然界柑橘叶片中分离
CK2Jf朋决oOTOwas spp.自然界柑橘叶片中分离
CK3尸wwc cwo"as spp.自然界柑橘叶片中分离
CK4 Pcwtoea spp.自然界柑橘叶片中分离
CK5ATCC 11662
CK6CGMCC 1.1813
CK7/"■sewrfoTMOMas avewae pv. paniciCGMCC 1.1726
CK8CGMCC1. 1781
CK9XaW/zomowaw cawpeWWs pv. /jo/"'co/a.CGMCC1. 1530
CK10NCPPB 2274
CK11Xa滅,owas o，ae pv. Oyza^NCPPB 2446
CK12Jfaw决OOTonas or;^zae pv. O 7zZco/aNCPPB 1632
CK13Jc/ctovorax ave"ae subsp.c"ra/Zz'NCPPB 4207
CK14尸a",oeasubsp. Wevrart/z'ATCC 29227
CK15NCPPB 1269
CK16ATCC 15580
CK17ATCC 10200 对上述菌株进行DNA提取后，应用下述反应体系和条件进行双重PCR检测研究。所 使用PCR仪器为Biometra公司产品。 反应体系10XPCR buffer 2. 5 ii L， dNTPs (lOmmol/L) 0. 5 ii L， MgCl2 (25mmol/ L) 2 ii L， 10 ii mol/L弓|物各1. 0 ii L， Taq DNA polymerase (2U/ ii L) 1. 0 ii L， lng/ ii L 10ng/ ii L， DNA模板5 ii L，灭菌超纯水补足至25 y L。 反应条件96。C预变性5min ;96。C变性30s，63。C退火30s，72。C延伸30s，循环反 应30次；72。C延伸5min。 DHPLC分析条件设定为进样量5 y L，柱温50°C ，选择全片段检测程序进行检测， 流速0. 9mL/min。 将PCR产物放入DHPLC进样室，洗脱液由缓冲液A(O. lmol/L三乙胺乙酰盐)和缓 冲液B(O. lmol/L三乙胺乙酰盐和25%乙腈)组成，设置进样量5 y L，柱温50°C ，选择全片 段检测程序进行检测，流速0. 9mL/min，系统自动按照线性递增的方式，以流速0. 9mL/min 的流速将DNAS印柱上的DNA分子洗脱下来，波长260nm处读取吸光值，经系统自动处理后， 形成DHPLC峰型图谱，供分析鉴定。
特异性检测 采用提取得到的柑橘溃疡病菌阳性菌株DNA和其它参试菌株DNA进行检测，用水
作为对照进行扩增。 试验结果 5株柑橘溃疡病菌均扩增出明显的阳性峰，见图1。其它参试菌株DNA均无阳性信 号。
6
灵敏度检测 接种柑橘溃疡病菌于100ml PSA液体培养基中，2『C震荡培养24h，用平板计数法 对各菌浓度进行测定，并将培养液用生理盐水制成2X 105、2X 104、2X 103、2X 102、2X 101 6 个稀释梯度。提取菌液DNA，并进行PCR-DHPLC分析。 试验结果如图2，利用本方法能有效地从含有2X102CFU/mL的柑橘溃疡病菌的菌
液中检测出该病原菌。
实施例5 PCR-DHPLC分子标准体系的建立 通过鉴定5株柑橘溃疡病菌DNA扩增产物序列的同源性是否一致，以期建立统一 的分子标本和分子标准体系。 采用DHPLC对自行设计的引物对扩增得到的PCR产物间进行了序列半变性检测 将每两种同数量级浓度的PCR产物相互间按照1 : l的比例混合，将混合产物及单一PCR产 物在PCR仪上进行以下变性-复性过程95t:起始变性5min，94. 5。C变性20s，以后每20s — 个循环降低0. 5t:，缓慢降温到25°C，以形成同源或异源双链DNA分子混合物。将降温处理 后的PCR产物放入DHPLC进样室，输入被检测片段序列，设定每次进样5ii L。检测温度以该 序列片段的解链温度(Tm = 64. 9°C )为参照，分别选择柱温为65。C，设定片段大小236bp， 以流速0. 9mL/min，进行DHPLC分析。 通过变性并缓慢复性处理的PCR混合产物，进行半变性DHPLC分析结果为引物 SEQ ID NO. 1和2扩增柑橘溃疡病菌A1-A5DNA的PCR混合产物在4. 6min (图3)左右均只 出现一个明显的吸收峰，结果与相同处理后的单一PCR产物结果一致。试验证明通过引物 SEQ ID NO. 1和2进行PCR扩增后，各柑橘溃疡病菌DNA的PCR产物片段序列一致，同源性 高，无突变位点。 因引物SEQ ID NO. 1和2扩增5株菌株的PCR产物序列均一致，可以建立起以引 物SEQ ID NO. 1和2扩增Al-A5中任意一株菌株DNA的PCR产物作为PCR-DHPLC鉴定方法 的标记物。将未知的片段大小一致或相近的PCR产物与分子标本进行变性并缓慢复性处理 后，进行DHPLC半变性分析。DHPLC鉴定条件为设定片段大小为236bp，每次进样5 y L。检 测温度Tm = 65°C ，以流速0. 9mL/min，进行DHPLC分析。结果出现单一的峰型且其它峰型 正常情况下，可判断为柑橘溃疡病菌。
序列表 〈110〉湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心
〈120〉用于柑橘溃疡病菌检测的引物对及检测方法
〈130>PLH091016
〈140〉
〈141〉
〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 1
〈210>1
〈211>20
〈212>DNA
7
〈213〉人工序列 〈400〉1 acgctcgatc tgcacctatt 20 <210>2 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>2 ccaacgagtc tcaagcatca 20 〈210>3 〈211>24 〈212>DNA <213>人工序列 〈400>3 cgccatcccc accaccacca cgac 24 〈210>4 <211>24 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>4 aaccgctcaa tgccatccac ttca 2权利要求
用于柑橘溃疡病菌检测的引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO.15’-ACGCTCGATCTGCACCTATT-3’；SEQ ID NO.25’-CCAACGAGTCTCAAGCATCA-3’；SEQ ID NO.35’-CGCCATCCCCACCACCACCACGAC-3’；SEQ ID NO.45’-AACCGCTCAATGCCATCCACTTCA-3’。
2. —种由SEQ ID NO. 1或2编码的核酸分子。
3. —种检测柑橘溃疡病菌的方法，该方法以柑橘溃疡病菌的DNA为模版，利用权利要 求1所述的引物进行双重PCR扩增，反应结束后应用DHPLC进行结果分析和判定。
4 如权利要求3所述的方法，其特征在于，双重PCR的反应过程中的退火温度为63°C。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，DHPLC检测过程中，检测片段设定大小为 236bp。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，DHPLC判定过程中，应用权利要求2中的核 酸分子作为分子标本并建立分子标准体系进行柑橘溃疡病菌的判定，检测柱温为50°C。
7. 含有权利要求1所述引物的试剂盒。
8. 如权利要求7所述的试剂盒，其还包括权利要求2所述的核酸分子。
全文摘要
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及柑橘溃疡病菌检测用引物和检测方法。本发明目的在于提供用于柑橘溃疡病菌双重PCR-DHPLC检测的引物和方法。本发明设计用于检测柑橘溃疡病菌的引物特异性好，检测灵敏度高，本发明的检测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有柑橘溃疡病菌，为进出口安全提供了保证。
文档编号C12Q1/68GK101712983SQ200910044688
公开日2010年5月26日 申请日期2009年11月4日 优先权日2009年11月4日
发明者左静, 朱金国, 王象贤, 莫瑾, 陈小帆 申请人:中华人民共和国湖南出入境检验检疫局