专利名称：生菜γ-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程技术领域的蛋白编码序列，具体是一种生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列。
背景技术：
维生素E是一种脂溶性维生素，其天然产物依结构的不同分为八种类型，分别是a-生育酚、P-生育酚、Y-生育酚、S-生育酚(tocopherol)和a -生育三烯酚、P-生育三烯酚、Y-生育三烯酚、S-生育三烯酚(tocotrienol)，其中a-生育酚的生物活性最高，被认为是维生素E的主要活性成分。
1922年维生素E的生物学功能发现，医学研究表明，维生素E不仅与生殖系统有关，而且与中枢神经系统、消化系统、心血管系统和肌肉系统的正常代谢都有密切关系。维生素E对于人类和动物健康有重要作用。维生素E参与细胞膜的构建和维持，是动物和人体内重要的抗氧化物质。维生素E是治疗冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的重要辅助性药物，有助于降低血脂和血胆固醇含量，抗凝血、抗氧化并且消除自由基，从而起到预防及治疗血管栓塞的作用。维生素E对于提高机体免疫能力有着重要的影响，具有抗衰老的功能，可以消除细胞色素沉淀，改善皮肤弹性，减弱性腺萎縮，因而在大量保健品和美容用品中广泛使用。维生素E可以预防和治疗多种妇科疾病，治疗早产儿溶血性贫血和蚕豆病，治疗营养不良儿童的巨幼红细胞性贫血。维生素E可以促进胆汁分泌、胆管形成和胆红素分泌，对急慢性肝炎和肝硬化有着治疗作用。维生素E可以预防癌症发生，对于癌症患者的治疗也有重要的辅助作用。
维生素E的合成途径只存在于绿色光合植物中，包括低等单细胞植物蓝藻和高等植物；人体和动物体内不存在维生素E合成途径，故而日常营养所需的维生素E摄取自绿色植物，特别是各种油类作物的种子，以及由种子所搾取的植物油。
直接由植物油脱臭馏出物中获得的生育酚混縮液的生物活性很低，a -生育酚的含量较低。工业生产维生素E主要是以上述生育酚混縮液为原料，经过半合
3成法，将其中的非a-生育酚成分转变为a-生育酚，但是成本较高，而且产生的a-生育酚消旋性与天然a-生育酚不同，活性也低于天然a-生育酚。因此，提高植物天然生育酚含量及其a -生育酚比例具有很重要的应用价值。
随着近年来植物基因组学的发展，DellaPenna于1999年提出了营养基因组学(nutritional genomics)的概念，即充分的利用基因组学的研究成果，分离植物营养代谢途径的关键酶基因，解析植物微量营养素代谢途径，深入了解代谢途径的调控方式，从而利用代谢工程的方法和手段改良作物品质，提高作物营养价值。基于基因组学的基础，维生素E合成途径的基因分离、克隆和功能性研究已经取得了突破性的进展。人们已经初步完成了对参与维生素E合成途径关键基因的分离和功能验证工作，并分析了维生素E合成途径概貌。
维生素E合成途径主要由以下五个步骤组成(1)4-羟苯丙酮酸(HPP)在4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的催化下，生成尿黑酸(HGA) ; (2)尿黑酸在尿黑酸植基转移酶(HPT)催化下，与植基二磷酸(PDP)发生縮合，生成2-甲基-6-植基-苯醌；(3)2-甲基-6-植基-苯醌在甲基植基苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)的催化下，生成2，3-二甲基-6-植基-苯醌；(4)2，3-二甲基-6-植基-苯醌在生育酚环化酶(TC)的催化下，生成Y-生育酚；(5) Y-生育酚在Y-生育酚甲基转移酶(Y-TMT)的催化下，生成a-生育酚。
经对现有技术的文献检索发现，尚未见与生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列有关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列。本发明可提高蔬菜中维生素E的含量，改善食物的营养品质，可以使含Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列的转基因植物成为生物反应器，进而实现维生素E的大规模生产。本发明从菊科的生菜"ac^/ca ^"ra)中克隆到了 Y-生育酚甲基转移酶(Y-TMT)，并将该基因转化拟南芥，证明它确实对植物中维生素E含量的提高有重要的作用。
本发明是通过以下技术方案实现的
本发明涉及一种生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列，该序列具有SEQID NO. 3中第112-1008位所示的核苷酸序列。
根据所述基因序列编码的多肽具有SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。本发明还涉及一种利用生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列提高植物维生素E含量的方法，其步骤如下
步骤一，将生菜Y -生育酚甲基转移酶蛋白编码序列连接于植物表达调控序列上，得到含生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列的植物表达载体；
步骤二，将步骤一中的表达载体转入农杆菌，利用该农杆菌转化拟南芥；
步骤三，通过抗生素筛选，获得含有生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列的转化细胞，最终再生转基因植株及其后代。
本发明中，构建步骤一中含生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列的植物表达载体时可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白多肽时，可以将生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成步骤一 中的生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白表达载体；可操作地连于指，线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。
本发明中，步骤三含有生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列的转化细胞为真核细胞，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、拟南芥和其它植物的生殖细胞或愈伤组织细胞。
本发明具有如下的有益效果本发明可提高蔬菜中维生素E的含量，改善食物的营养品质；同时本发明可使含Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列的转基因植物成为生物反应器，实现维生素E的大规模生产；利用本发明的生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Y-生育酚甲基转移酶蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明中所涉及的农杆菌为根癌农杆菌菌株GV3101，该菌株已在《CsabaKoncz， Jeff Schell; The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specificexpression of chimaeric genes carried by a novel type of y4gro6a"en'謂binaryvector' Mol Gen Genet, 1986， 204: 383-396》文献中公开。根癌农杆菌GV3101可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar3。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例
步骤一，生菜Y-生育酚甲基转移酶基因的克隆
1、 RNA的提取
取生菜叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1. 5mL Eppendorf (EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
2、 基因的全长克隆
根据拟南芥中相关基因所编码的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)方法进行cDNA全长克隆，克隆使用Clontech试剂盒，克隆分三个阶段进行
(1) 首链cDNA的合成
利用Clontech试剂盒所提供的5' -CDS primer A和SMARTII A oligo引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成5'-RACE-Ready cDNA;利用Clontech试剂盒所提供的3' -CDS primer A为引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成3'-RACE-ReadycDNA。
(2) 3'-RACE
用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的基因特异引物2 (GSP2，见SEQ ID NO. 1)进行3'-RACE PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体上进行测序。
(3) 5'-RACE
用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的基因特异引物l (GSP1,见SEQ ID NO. 2)进行5'-RACE PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体上进行测序。将测序结果的重叠区拼接，得到该基因的完整编码区序列。BLAST分析结果证明从生菜中得到的基因确为一个Y-生育酚甲基转移酶的相关基因。通过上述步骤，获得了生菜中参与维生素E合成的Y -生育酚甲基转移酶蛋 白的全长编码序列(SEQ ID NO. 3)。
步骤二，生菜Y-生育酚甲基转移酶相关基因的序列信息与同源性分析 步骤一中得到的生菜7F7的全长cDNA长度为1131bp (SEQ ID NO. 3)， 其中开放阅读框位于112位-1008位核苷酸，根据所获得的cDNA推导出生菜Y -生育酚甲基转移酶的氨基酸序列(见SEQ ID NO. 4)，共298个氨基酸残基，分 子量为33057. 04,等电点为5. 86。
利用vectorNTI 9. 0软件对来源于各种植物的Y -生育酚甲基转移酶的相关 氨基酸序列进行同源比对，结果发现，克隆到的生菜Y-生育酚甲基转移酶基因 与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica n即us)、大豆(Glycine max)、 玉米(Zea mays)、棉花(Gossypium hirsutum)、小麦(Triticum aestivum)、马 铃薯(Solarium tuberosum)、 番茄(Solan咖 lycopersicum ) 以及向曰葵 (Helianthusannuus)中同源基因所编码的氨基酸序列相似性分别为65%、 64%、 67%、 64%、 68%、 62%、 64%、 66%、 89%(表2)。由此可见，低等单细胞生物衣藻
除外，生菜ri/r基因与其他高等植物中的7Fr相关基因在所编码的氨基酸
水平上存在较高的同源性，可以认为它们的产物在功能上也有较高的相似性。
歩骤三，生菜Y-生育酚甲基转移酶相关蛋白或多肽在拟南芥细胞中进行真 核细胞表达及转基因植株的维生素E含量鉴定
1、 含目的基因(生菜的表达载体的构建
根据生菜r-7F7的全长编码序列(SEQIDN0.3)，设计扩增出完整编码阅读 框的引物，并在正反引物上分别引入^^1I和feci限制性内切酶位点，以便构 建表达载体。以实施例1中获得的5' -RACE-Ready cDNA为模板，经PCR扩增后， 将生菜7Fr的编码区序列连接至中间载体pMD18-T中进行测序，再将测序正 确的r-7i/r的编码区序列进一步克隆到表达载体pHB中，接着将其转入根癌农 杆菌，并进行PCR验证。结果表明，含生菜7Fr基因的植物表达载体已成功 构建到根癌农杆菌菌株中。
2、 采用浸花法转化拟南芥
(1) 取生长一个月、生长状况良好的植株，转化前可以提前一个星期将植 物去顶，使植物产生较多的花苞，提高转化效率，转化前一天浇水；
(2) 将含有转基因载体的农杆菌于28。C培养过夜，至0D6。。"2. 0， 4, 500 rpm
7离心10min;
(3) 菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液中，至终浓度OD6。。"0.8;
(4) 转化时小盆倒置，确保拟南芥地上部分全部花苞都被浸没入事先用转 化Buffer悬浮好的菌液中约5sec;
(5) 用吸水纸吸去多余的液体，将植物平放于一个密封的小盒内以保持湿 度，避光过夜；
(6) 第二天将植物取出，竖直，转移到正常条件下生长。待植物长至一定 程度后，将其依附竹签绑好，以便更好地结实；
(7) T。代种子成熟后将其整株剪下，过筛。种子铺于含5(Vg/mL潮霉素的 筛选培养基上，4'C春化48 h，移到人工气候室24 h连续光照条件下生长一周；
(8) 待长出绿色的转基因抗性幼苗后移栽入土继续生长，转化子为绿色的 幼苗且根较长；非转化子基本为黄化苗，或绿色无根幼苗；
(9) 单株收获转基因植株(因转基因的插入位点不同，每个都是不同的)标 成不同的株系；
(10) 单株收获的T2代种子已经出现性状分离。将种子均匀地铺到9 cm平 板上，因要确定是否是单位点插入，所以不加抗生素。待长至6-7片真叶后，喷 除草剂，筛选3: l单位点插入的株系，单株收获，继续筛选直至获得纯合的转 基因植株。
3、转基因拟南芥植株的PCR检测
根据CaMV 35S的序列设计正向引物，根据r-7F71的序列设计反向引物对 目的基因进行检测。结果表明，用CaMV35S正向引物和r-73/7"反向引物能扩增 出目的基因大小的特异DNA片段。而以非转化拟南芥基因组DNA为模板时，没有 扩增出任何片段。
步骤四，利用HPLC-UVD测定转基因拟南芥中维生素E含量
1、 HPLC-UVD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
HPLC:采用Waters 2695 s印arations module系统，色谱柱为C-18反相硅 胶柱(Calesil 0DS-100 C18)，具体规格为4.6mm内径X250mm长度，流动 相为甲醇与水，其中甲醇与水的体积比为98: 2，此时，生育酚的出峰时间为26. 3 min，峰型良好，柱温为30。C，流速1. OmL/min，进样量30叱。
UVD:采用Waters 2996 photodiode array detector系统，紫外光检测器检测波长292nm。精确称取Sigma公司的生育酚标准品2. 0 mg用lmL甲醇完全 溶解，得到2mg/mL生育酚标准品溶液，保存于-2(TC备用。
2、 标准曲线的制作
将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样5)al、 10 nl、 15^1、 20^1、 30 pl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X， pg)进行回归分 析。通过研究，本发明中生育酚在10叫-6(Vg范围内呈现良好的log-log线性 关系。生育酚对照品的log-log线性回归方程为Y=7.26e+002X+1.09e+004; R=0. 999740。
3、 样品的制备和生育酚含量的测定
生育酚的提取过程如下取新鲜的拟南芥叶片lg-2g (鲜重)，液氮研磨， 用4raL正己烷提取，超声30分钟。离心，收集上清液，用氮吹仪吹千，用适量 甲醇溶解提取物，用于HPLC检测。
采用HPLC-UVD测定生育酚含量，样品进样体积为30 pl，根据峰面积代入线 形回归方程计算出样品中的生育酚含量(mg)，折合成物质的量(pmol)，再除以 样品的拟南芥叶片鲜重(mg)，从而计算出拟南芥植株中生育酚的含量。
在本发明中编码Y-生育酚甲基转移酶的Y-TMT基因的转化显著提高了拟 南芥叶片中维生素E含量，这使得转基因植株中维生素E的含量超过对照的50% 以上。由此可见，Y-TMT基因可作为一种提高植物营养价值的候选基因，用于 利用转基因技术提高作物维生素E含量的研究和产业化生产中。序列表
<110〉上海交通大学
<120>生菜Y -生育酚甲基转移酶蛋白编码序列
〈160〉4
<210〉1
<211>25
<212>腿
<213〉
<400>1
tacctcccga aaagtcccta cgccc 25〈110〉上海交通大学
〈120〉生菜Y -生育酚甲基转移酶蛋白编码序列
<160>4
<210>2
〈211〉25
<212>DNA
〈213〉
<400〉2
ctgggcgtag ggacttttcg ggagg 25aio〉上海交通大学
〈120〉生菜Y -生育酚甲基转移酶蛋白编码序列
<160>4
<210>3
<211〉1131
〈212〉DNA
〈213>
<400〉 3
gattgttgac gcaataccac caccaccacc acgaggcagc ttctgcagtc actcaacact 60
caaggagtta tgagtacggt ggttgctgat gcaacagttc ctccgatgac aatggcgact 120
gcagcggatg agcagc3gca aca^c3gct8肌aB肌gg^ tsgcagaBtt ctacgatg肌 180
tcttcgggga tgtgggagaa tatatgggga gaacacatgc atxacggatt ctacgacacc 240
10<image>image see original document page 11</image>Val Asp Val Gly Cys Gly lie Lys Tyr Gly Arg
Ala 100 Gin
Cys 85
Glu Cys His
Ala Leu Ala
Glu Arg Ala 115
Ser Phe Gin Val Ala Asp 130
Asp Leu Val Trp
Gly Gly Ser 90
Gly lie Thr Leu Ser Pro 105
Ala Thr Gin Gly Leu 120
Leu Asn Gin Pro
Ser Arg Tyr Leu Ala Arg 95 Gin
Val Gin Ala 110
Asp Lys Val
Phe 145
Leu Lys Phe Val
Ala 135
Met Glu Ser Gly
Ala 125
Pro Asp Gly Lys
Ser 165
lie lie lie Val Thr Trp Cys 180
Ser Leu Arg Pro Glu Glu Glu 195
Leu Pro Ala Trp
Ser 150
Glu Leu Ala Arg
Phe 140
His Met Pro Asp
Glu 155
Ala Ala Pro Gly
Phe Phe Leu Pro Ala Trp Cys 210 215 Glu Ser lie Ser Leu Gin Asp 225 230 Val Ala Pro Phe Trp Pro Ala 245
Gly lie Thr Ser Leu Leu Arg 260-
Met Val Met Pro Ser Met lie 275
Phe Ser lie lie Thr Cys Lys 290 295
Val 170
His Arg Asp Leu Leu Pro 185
Lys lie Leu Asn Lys 200
Ser Thr Ala Asp
Pro 190
Cys
Ala 175 Glu
Ser
Lys 160 Thr
Lys
Gly
lie 205
Val Lys Leu Leu
Tyr 220
lie Lys Ala Glu Asp Trp Ser Gly Asn 235 240 Val lie L>ys Thr Ala Leu Ser Trp Lys 250 255 Trp Lys Thr lie Arg Gly Ala
Ser Gly 265
Glu Gly Phe Lys 280
Lys Pro Glu
Lys Asp 285
Arg 270
Val lie Lys
1权利要求
1、一种生菜γ-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列，其特征在于，具有SEQ IDNO.3中第112-1008位所示的核苷酸序列。
2、 根据权利要求1所述的生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列编码的多 肽，其特征在于，具有SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。
3、 一种利用如权利要求1所述的生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列提 高植物维生素E含量的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，将生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列连接于植物表达调控序 列上，得到含生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列的植物表达载体；步骤二，将步骤一中的表达载体转入农杆菌，利用该农杆菌转化拟南芥； 步骤三，通过抗生素筛选，获得含有生菜Y-生育酚甲基转移酶蛋白编码序 列的转化细胞，最终再生转基因植株及其后代。
全文摘要
一种基因工程技术领域的生菜γ-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列，该序列具有SEQ ID NO.3中第112-1008位所示的核苷酸序列，该序列编码的多肽具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；利用该序列提高植物维生素E含量的方法，包括如下步骤将生菜γ-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列连接于植物表达调控序列上，得到植物表达载体；将步骤一中的表达载体转入农杆菌，利用该农杆菌转化拟南芥；通过抗生素筛选，获得含有生菜γ-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列的转化细胞，最终再生转基因植株及其后代。本发明可提高蔬菜中维生素E的含量，改善食物的营养品质，可以使含γ-生育酚甲基转移酶蛋白编码序列的转基因植物成为生物反应器，进而实现维生素E的大规模生产。
文档编号C12N9/10GK101514346SQ20091004635
公开日2009年8月26日 申请日期2009年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者任薇薇, 唐克轩, 唐岳立, 王玥月 申请人:上海交通大学