AtNRT1.8基因增强农作物对重金属或盐胁迫的抗性的应用的制作方法

专利名称：AtNRT1.8基因增强农作物对重金属或盐胁迫的抗性的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物工程和植物改良基因工程领域。具体地说，本发明涉及 AtNRTI. 8基因在增强作物对重金属、盐或干旱胁迫的抗性中的用途，以及通过转入所述基 因来改进植物对重金属、盐或干旱胁迫的抗性的方法及转基因植物。
背景技术：
重金属镉污染对植物造成毒害的重要原因在于显著抑制重要的氮吸收同化过程， 导致植物体缺氮，体内蛋白质降解，因此对于作物的一个直接后果就是严重减产。此外，重 金属在作物可食用部位比如稻米内的积累，也会导致安全品质的下降，对于食用这些受污 染的食品的人或动物造成极大的安全危害。其中最为著名的公害事件就是上世纪发生在日 本的“痛痛病”事件，原因就在于居民长期食用镉污染的大米导致骨骼松软易碎。改革开放以来，中国的工业得到迅速发展，但环保措施相对滞后，导致了包括重金 属在内的严重环境污染。据10年前的不完全统计，我国受重金属污染的耕地面积近2000 万公顷，约占总耕地面积的1/5，受重金属污染的粮食达1200万吨，而由于重金属污染导致 的粮食减产也在1000万吨之上。国家环保总局的监测表明重金属污染在我国有不断恶化 白勺趋势(http://www. sepa. gov. cn/natu/yjsp/) 0因此，分离并阐明调控植物重金属抗性的关键基因，并通过转基因技术培育重金 属抗性作物，将在生产上产生巨大的经济和社会效益。我国农业面临的另外一个严重问题是由于长期灌溉导致的盐渍化胁迫，如何提高 作物对盐的抗性能力对于提高产量，解决中国的粮食安全也具有重大的意义。AtNRTI. 8基因(AGI编号At4g21680)属于NRT1基因家族，也称作P0T/PTR基因 家族，在模式植物拟南芥中共有53个家族成员(见Tsay YF的综述，FEBSLetters，2007， 581 :2290-2300)，主要编码低亲和力硝酸根转运蛋白，也发现有部分成员编码寡肽转运蛋 白。AtNRTI. 8基因序列及其结构如图1所示。然而，本领域中尚未有任何涉及AtNRTI. 8基因与植物(尤其是作物)对重金属、 盐或干旱胁迫的抗性之间关系的研究或报道。

发明内容
本发明的目的正是明确AtNRTI. 8基因与作物对重金属、盐或干旱胁迫的抗性之 间的关系，为增强作物对重金属、盐或干旱胁迫的抗性提供了一种新的途径。本发明的另 一目的是提供具有增强的重金属、盐或干旱胁迫抗性的转基因植物的制备方法及转基因植 物。在本发明的第一方面，提供AtNRTI. 8基因或其编码的蛋白质或多肽在增强植物 对重金属的抗性、对盐胁迫的抗性或对干旱的抗性中的用途。在一个优选例中，所述AtNRTI. 8基因是拟南芥AtNRTI. 8基因。
在另一优选例中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物，优选作物。在另一个优选例中，所述植物选自禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔 属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选拟南芥、棉花、油菜、水稻、玉 米、小麦、大麦或高粱，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、拟南芥或棉花，最优选为水稻、玉米、 小麦、拟南芥或棉花。在本发明的一个实施方式中，所述蛋白质或多肽的序列选自(a) SEQ ID NO 3 -M(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 增强植物对重金属或盐胁迫的抗性的活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。在本发明的另一个实施方式中，所述AtNRTl. 8基因是编码本发明所述蛋白质或 多肽的序列。在本发明的另一个实施方式中，所述AtNRTl. 8基因选自(i)SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :5 ；或(ii)在严格条件下与(ii)限定的序列杂交且具有增强植物对重金属或盐胁迫的 抗性的活性的分子。在本发明的另一个实施方式中，所述增强植物对重金属的抗性表现为降低植物
中的重金属含量。在一个优选例中，所述增强植物对重金属的抗性表现为没有重金属污染、重金属 污染较相同条件下种植的非转基因植物降低。在本发明的另一个实施方式中，所述重金属、盐胁迫或干旱包括由以下物质或情 况引起的胁迫镉、铅、汞、砷、铜、铬、锑、锡、锌、钡、铋、镍、钴、锰、铁、钒、氯化钠、硫酸钠、碳 酸钠、碳酸氢钠或缺水。在一个优选例中，所述重金属胁迫或盐胁迫优选为镉胁迫、铅胁迫、汞胁迫、砷胁 迫、氯化钠胁迫、硫酸钠胁迫，碳酸钠胁迫，碳酸氢钠胁迫。在一个优选例中，所述降低植物重金属含量优选为降低镉、铅、汞、砷的含量。在本发明的第二方面中，提供了一种载体，所述载体含有AtNRTl. 8基因。在一个优选例中，所述载体中含有拟南芥AtNRTl. 8基因。在一个优选例中，所述AtNRTl. 8基因的序列选自(i) SEQ ID N0:1(对应于图1 中的序列)、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 5 ；或(ii)在严格条件下与(i)限定的序列杂交且具有增强植物对重金属或盐胁迫的 抗性的活性的分子。在一个优选例中，所述载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒，优选 pEGFP-l、pBI121、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA2301 或 pHB。在本发明的第三方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有 本发明所述的载体。在一个优选例中，所述宿主细胞选自原核细胞、低等真核细胞或高等真核细胞，优 选细菌细胞、酵母细胞或植物细胞，更优选大肠杆菌、链霉菌、农杆菌、酵母菌，最优选农杆 菌，所述农杆菌包括但不限于EHA105、SOUP 1301或C58。在本发明的第四方面中，提供一种制备转基因植物的方法，所述方法包括
(1)用含有AtNRTl. 8基因的构建物转化植物细胞细胞、组织或器官；(2)选择转入AtNRTl. 8基因的植物细胞、组织或器官；和(3)将步骤⑵中的植物细胞、组织或器官再生成植株，其中，所得的转基因植物对重金属或盐胁迫的抗性较未转化的植物有所增强。在一个优选例中，所述构建物为含有AtNRTl. 8基因的载体或宿主细胞。在另一个优选例中，步骤(2)的植物细胞、组织或器官中的染色体上整合了 AtNRTl. 8 基因。在另一个优选例中，所述方法包括以下具体步骤(a)提供含有AtNRTl. 8基因的载体；(b)提供携带步骤(a)中的载体的宿主细胞；(c)将植物细胞或组织与步骤(b)中的宿主细胞接触，从而使AtNRTl. 8基因转入 植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(d)选择转入AtNRTl. 8基因的植物细胞、组织或器官；和(e)将步骤(d)中的植物细胞、组织或器官再生成植株，其中所述转基因植物对重金属或盐胁迫的抗性较未转化的植物有所增强。在另一个优选例中，所述AtNRTl. 8基因为拟南芥AtNRTl. 8基因。在另一个优选例中，所述植物选自禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔 属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选拟南芥、棉花、油菜、水稻、小 麦、大麦、玉米或高粱，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、拟南芥或棉花，最优选为水稻、玉米、 小麦、拟南芥或棉花。在一个优选例中，所述制备转基因植物的方法，还包括将用本发明前述任一种方 法获得的转基因植物与非转基因植物或其它转基因植物杂交，从而获得包含AtNRTl. 8基 因的杂交后代，所述杂交后代对重金属或盐胁迫的抗性较未转化的植物有所增强。在一个优选例中，杂交用的植物在分类上属于同一科或不同科植物，优选为同一 科植物。所述植物优选为禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物、菊科植物、茄 科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大麦、玉米或高粱， 更优选水稻、玉米、小麦、大麦、拟南芥或棉花，最优选为水稻、玉米、小麦、拟南芥或棉花。在另一个优选例中，所述杂交后代具有稳定的遗传性状。在本发明的第五方面中，提供了用本发明所述方法制得的转基因植物的用途，所 述转基因植物用于生产没有重金属污染的农产品、重金属污染较相同条件下种植的非转 基因植物降低的农产品、耐重金属胁迫作物、耐盐胁迫作物或耐干旱胁迫作物。在一个优选例中，所述重金属、盐或干旱胁迫包括由以下物质或情况弓I起的胁迫 镉、铅、汞、砷、铜、铬、锑、锡、锌、钡、铋、镍、钴、锰、铁、钒、氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠 或缺水。在另一个优选例中，所述重金属胁迫或盐胁迫优选为镉胁迫、铅胁迫、汞胁迫、砷 胁迫、氯化钠胁迫、硫酸钠胁迫、碳酸钠胁迫或碳酸氢钠胁迫。在另一优选例中，所述作物为拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大麦、玉米或高粱， 更优选水稻、玉米、小麦、大麦、拟南芥或棉花。在本发明的第六方面中，提供了一种转基因植物，其包含AtNRTl. 8基因。
在一个优选例中，所述转基因植物对重金属、盐或干旱胁迫的抗性有所增强。在另一个优选例中，所述AtNRTl. 8基因的序列选自编码选自下组的蛋白质或多 肽的序列(a) SEQ ID NO 3 ；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个 或几个氨基酸且具有增强植物对重金属或盐胁迫的抗性的活性的由(a)衍生的蛋白质或 多肽。在一个优选例中，所述AtNRTl. 8基因选自(i) SEQ ID NO 1 (对应于图1中的序列)、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO :5 ；或(ii)在严格条件下与(i)限定的序 列杂交且具有增强植物对重金属或盐胁迫的抗性的活性的分子。在另一个优选例中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物，优选作物。在另一个优选例中，所述植物选自禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔 属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选拟南芥、棉花、油菜、水稻、小 麦、大麦、玉米或高粱，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、拟南芥或棉花，最优选为水稻、玉米、 小麦、拟南芥或棉花。应理解的是，本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言 是显而易见的。


图1 =AtNRTl. 8基因序列及其结构。其中，大写部分为基因的外显子，小写部分为 外显子之间的内含子。图2 =AtNRTl. 8基因在逆境(stresses)中的表达。其中，图2A 用不同浓度Cd对 根进行不同时间处理后的AtNRTl. 8表达水平；图2B、C和D为用各种胁迫处理6小时后， AtNRTl. 8的表达。其中，图2B中的“S”表示茎；“L”表示叶；“R”根。图2C中的“JA”表示 茉莉酸处理的样品；“SA”表示水杨酸；“Na”表示NaCl，；“Cu”表示用铜处理的样品；“Zn” 表示用锌处理的样品；“Ctl”表示对照。图2D中的“ACC”表示1-氨基环丙烷基羧酸，它是 乙烯生成的前体，用ACC来处理植物和用乙烯ETH来处理植物有类似的效果；“R”代表根， “L”代表叶。图3 爪蟾卵母细胞注射法研究AtNRTl. 8基因的体外转运活性的电生理分析结 果。其中，“noinj 〃表示未经注射的样品。图4 =AtNRTl. 8基因在拟南芥中的表达和定位。其中图4A-4E为通过⑶S染色直 接拍照或者切片获得；图4F-4M为通过基因枪转化洋葱表皮细胞和使用农杆菌介导的方法 转化拟南芥野生型WS，然后在共聚焦显微镜下拍照获得。图 5 =AtNRTl. 8 基因对植物 Cd 抗性的调控(50uM Cd+50mM NO3O。图 6 =AtNRTl. 8 基因对植物 NaCl 抗性的调控(50mM NaCl+50mM NO3O。图7 :Cd在AtNRTl. 8基因突变体(nrtl. 8、0E-1)和对应野生型(WS、Col 0)中莲 座叶和果荚中的积累。图8 =AtNRTl. 8基因调控硝酸盐在重金属镉胁迫条件下的再分配。图9 =AtNRTl. 8基因对植物抗旱的调控。
具体实施例方式本发明人对AtNRTl. 8基因的结构、定位和功能等进行了长期而深入的研究，通过逆境因子诱导表达分析、基因编码蛋白质或多肽的定位和功能分析、突变体表型研究等，证 明了 AtNRTl. 8基因与植物的重金属、盐或干旱抗性之间存在着密切的关系，该基因的高表 达可增强植物对重金属、盐或干旱胁迫的抗性。在此基础上，本发明人完成了本发明。具体而言，发明人的研究表明AtNRTl. 8基因编码NO3-(主要的氮肥形式)转运蛋白， 其表达能够受重金属、盐胁迫、干旱等逆境诱导，转基因植株对重金属、盐胁迫、干旱的抗性明 显提高。因此该基因在提高作物对重金属、盐等逆境胁迫能力方面具有较大的应用潜力。AtNRTl. 8基因及编码的蛋白质或多肽在本发明中，术语“AtNRTl.8蛋白或多肽”或“AtNRTl.8基因编码的蛋白质或多 肽”指由本发明的AtNRTl. 8基因编码的蛋白质或多肽，该定义中也包括具有提高植物的重 金属或盐胁迫抗性的上述蛋白质或多肽的变异形式。所述AtNRTl. 8基因编码的蛋白质或 多肽的序列可选自(a)SEQ ID NO 3 ；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或 添加一个或几个氨基酸且具有增强植物对重金属或盐胁迫的抗性的活性的由(a)衍生的 蛋白质或多肽。本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重 组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本 发明中AtNRTl. 8蛋白或多肽优选由拟南芥AtNRTl. 8基因或其同源基因或家族基因编码。本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50 个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨 基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个 以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或 相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的AtNRTl. 8 蛋白质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有增强植物重金属或盐胁迫 抗性的活性。可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知 的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质或多肽。可利用编码所述蛋白质或多肽的编 码序列来构建转基因植物，并观察该转基因植物的性状是否有所改良来筛选和鉴别所得蛋 白质或多肽。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以 是非糖基化的。该术语还包括AtNRTl. 8蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导 突变体、在高或低的严紧度条件下能与AtNRTl. 8蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、 以及利用抗AtNRTl. 8蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含 AtNRTl. 8蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 AtNRTl. 8蛋 白的可溶性片段。通常，该片段具有AtNRTl. 8蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至 少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最 佳地至少约100个连续氨基酸。
如本文所用，术语“AtNRTl. 8基因”或“植物AtNRTl. 8基因”可互换使用，均是指 一种编码本发明所述的AtNRTl. 8蛋白或多肽的序列，其与拟南芥AtNRTl. 8基因序列(参 见SEQ ID NO 1)可高度同源或在严格条件下与所述基因序列杂交的分子或与上述分子高 度同源的家族基因分子，所述基因的表达对植物的重金属或盐胁迫抗性具有一定的改善作用。 现有技术中已公开了 AtNRT 1. 8及其同源基因的序列，包括但不限于AGI编号At4g2l680，见 Tsay YF 的综述(FEBS Letters, 2007, 581 2290-2300) ；GenBank Accession :NM_118288、GenBank Accession :AK118142。这些本领域已知的基因均包括在 本发明中。本发明的AtNRTl. 8 基因可选自(i)SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ IDNO 4 禾口 SEQ ID NO :5(其分别对应于 MATDB AGI code :At4g21680 (http//mips, gsf. de/proi/ plant/isf/athal/index. isp)、At4g21680 编码区、GenBank Accession :NM_118288 禾口 GenBank Accession =AK 118142)；或(ii)在严格条件下与⑴限定的序列杂交且具有改良 作物种子性状的活性的分子。如本文所用，术语“严格条件”是指⑴在较低离子强度和较高温度下的杂交和 洗脱，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵杂交时加有变性剂，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优 选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。本发明的AtNRTl. 8基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法 或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是 开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所 制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR 扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。应理解，本发明的AtNRTl. 8基因优选获自拟南芥，获自其它植物的与拟南芥 AtNRTl. 8基因高度同源(如具有50%以上，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、 75%以上、80%以上，更优选85%以上如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它 基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知 的，如 BLAST。植物及其对重金属、盐或干旱胁迫的抗性如本文所用，所述的“植物”没有特别的限制，包括(但不限于)禾本科植物、锦葵 科棉属植物、十字花科芸苔属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物等。优选 所述植物为作物。如本文所用，术语“作物”是指在粮、棉、油等农业和工业中具有经济价值的植物， 其经济价值可体现在该植物的种子、果实、根、茎、叶等有用部位上。作物包括但不限于双 子叶植物或单子叶植物。优选的单子叶植物为禾本科植物，更优选水稻、小麦、大麦、玉米、 高粱等。优选的双子叶植物包括但不限于锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物等，更优 选棉花、油菜等。如本文所用，术语“重金属胁迫”是指指植物在含有高浓度重金属的土壤或者水体中生长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。造成重金属胁迫的重金属包括(但不 限于)镉、铅、汞、砷、铜、铬、锑、锡、锌、钡、铋、镍、钴、锰、铁或钒。本发明的AtNRTl. 8基因 或其编码的蛋白质或多肽可增强植物对重金属的抗性，该抗性的提高可表现为与未经所述 基因、蛋白质或多肽处理的对照植物相比所述植物中(优选地上部分)的重金属含量降 低、没有重金属污染、在重金属存在下的生长发育未受影响或受影响程度降低。如本文所用，术语“盐胁迫”是指指植物在含有高浓度盐分的土壤或者水体中生长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。造成盐属胁迫的盐类包括(但不限于)氯 化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。本发明的AtNRTl. 8基因或其编码的蛋白质或多肽可增 强植物对盐胁迫的抗性，该抗性的提高可表现为与未经所述基因、蛋白质或多肽处理的对 照植物相比所述植物在高浓度盐分存在下的生长发育未受影响或受影响程度降低、或可 在更高的盐浓度下存活。如本文所用，术语“干旱胁迫”是指植物在缺水的土壤或者其它干旱环境中生长 时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。本发明的AtNRTl. 8基因或其编码的蛋白质或 多肽可增强植物对干旱胁迫的抗性，该抗性的提高可表现为与未经所述基因、蛋白质或多 肽处理的对照植物相比所述植物在缺水条件下的生长发育未受影响或受影响程度降低、 或可在更干旱的条件下存活。载体、宿主及转基因棺物本发明还涉及包含AtNRTl. 8基因的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主 细胞，以及通过转基因获得高表达AtNRTl. 8的转基因植物。通过常规的重组DNA技术(Science，1984 ；224 1431)，可利用本发明的编码序列 可用来表达或生产重组的AtNRTl. 8蛋白。一般来说有以下步骤(1)用本发明的编码AtNRTl.8蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷 酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；和(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内 复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启 动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含AtNRTl. 8编码序列和合适的转录/ 翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术 等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体 还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中优选使用pEGFP-l、pBI121、 PCAMBIA1300、pCAMBIA130UpCAMBIA2301 或 pHB。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋 白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌， 链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。在本发明中，优选采用农杆菌作为宿主 细胞。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将 会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用 于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增 强子和宿主细胞。 本发明中术语“转基因植物”、“转化子”或“转化植物”可互换使用，均指通过常规 转基因的方法获得的转入本发明AtNRTl. 8基因并稳定高表达AtNRTl. 8蛋白或多肽的细 胞、器官、组织或植株。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物 细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗病性提高的植物。获得的转化子 可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用 的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生 长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细 胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果 需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些 方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用 蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、 吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
I=I O本发明的主要优点本发明的主要优点在于(1)提供了 AtNRTl. 8基因及其编码的蛋白质或多肽的新用途，其可用于有效提高 植物对重金属、盐或干旱胁迫的抗性；(2)提供了具有改良重金属、盐或干旱胁迫抗性的转基因植物，为粮、棉、油等生产 和加工提供了优良原料和产品；(3)提供了改善植物重金属、盐或干旱胁迫抗性的新途径，因而具有巨大的应用前景实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常 规条件(例如可参照如Sambrook等人的《分子克隆实验指南》，英文名称为《Molecular Cloning :A Laboratory Manual》，第三版，2001, Cold Spring Harbor Laboratory press) 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1. M^MM^^m^ (Stress)因子对AtNRTl. 8某因的调控作用发明人通过基因芯片分析，发现AtNRTl. 8在53个POT基因家族成员里受镉诱导最为强烈(数据未出示)。本实施例中所用的AtNRTl. 8基因的序列如图1所示。为了确证该基因受镉诱导是否如基因芯片所示，并进一步揭示其是否受其它逆境 因子诱导，进行了 Northern杂交试验(试验方法经典的植物分子生物学中的Northern杂 交，参考《分子克隆实验指南》第532-552页)。上述试验结果表明=AtNRTl. 8基因受镉的诱导表达具有时间和浓度依赖效应(见 图2A)，而且基本不受镉胁迫的次生效应渗透胁迫和氧化胁迫调控(如图2B所示，PEG是一 种高渗透剂，可以对植物造成渗透胁迫，AtNRTl. 8基因高表达植株不表现抗渗透的功能)。 除了镉以外，AtNRTl. 8基因还受重金属铜(Cu)和锌(Zn)的诱导表达(图2C)。此外，AtNRTl. 8基因受逆境信号分子乙烯(ACC，1-氨基环丙烷羧酸，其为乙 烯合成前体物质；乙烯是多种逆境的信号分子，很多逆境下，植物乙烯会高表达)强烈诱导 表达，也受JA (茉莉酸)诱导。实施#![ 2. AtNRTl. 8某因编码内向型低,亲和力硝酸盐转运蛋白(Nitrate transporter)AtNRTl. 8基因属于PTR基因家族，同时也叫做NRTl家族或者POT家族。由于该家 族基因已经被发现既编码硝酸盐转运蛋白，也编码寡肽转运蛋白，因此为了检测AtNRTl. 8 基因编码蛋白的转运底物，发明人通过爪蟾卵母细胞注射的方式研究了 AtNRTl. 8基因的 体外转运活性。试验方法将AtNRTl. 8基因的编码序列及两端的UTR序列亚克隆到pGEMHE载体， 通过体外转录成cRNA，注射到爪蟾卵母细胞(获自首都师范大学)，进行电生理分析(电压 钳购自Dagan公司，型号为TEV-200A V0LTAGECLAMP)。试验结果如图3所示。结果表明=AtNRTl. 8基因编码蛋白特异性转运N03_，而且是一个内向型低亲和力 转运蛋白。术语“内向型低亲和力转运蛋白”是指该基因编码的蛋白可以从细胞质外向细 胞质内转运NO”而且只对高浓度的NO3-有活力，在低浓度NO3-条件下转运能力很差。实施例3. AtNRTl. 8基因在拟南芥中的表达及定位确定基因的组织表达特征和亚细胞定位情况，对于明确基因的作用机理具有重要 的提示作用。为此，发明人进一步研究了 AtNRTl. 8基因在拟南芥中的表达及定位情况。参照Dawar Hussain 等，The Plant Cell《植物细胞》，第 16 卷，1327-1339 所记 载的方法，将基因的启动子区域与报告基因GUS融合，或者基因的编码框与报告基因GFP融 合，用于转化拟南芥或者洋葱表皮细胞。原位杂交分别用AtNRTl. 8的正向序列和反向序列 与组织本生的mRNA杂交。试验结果如图4所示。结果显示⑶S组化分析显示，AtNRTl. 8基因的表达主要在植物的维管系统表达， 而且位于中柱内，原位杂交得到相同的结论(图4A-E)，印证了 AtNRTl. 8的中柱特异表达 模式。进一步的切片分析表明该基因的表达位于木质部薄壁细胞(图4B-C)，提示该基因 可能参与NO3-的长途转运。进一步利用GFP与AtNRTl. 8基因的融合蛋白定位分析表明无 论是洋葱细胞瞬时表达还是在拟南芥体内的稳定表达都将AtNRTl. 8定位于细胞质膜(图 4F-M)，结合该基因编码内向型NO3-转运蛋白的事实，推测AtNRTl. 8可能起着从木质部卸载 NO3-的作用。
实施例4. AtNRTl. 8某因转某因棺株对重金属胁泊、盐胁泊的杭件为了明确AtNRTl. 8在植物体内的具体生理作用，发明人分别研究了该基因的基 因敲除突变体和过量表达突变体在重金属和盐胁迫逆境条件下的表型。突变体的抗性表型观察和统计根系的发育情况的方法如下将WS和nrtl. 8，以及 Col O和OE-I (其中，nrtl. 8突变体为AtNRTl. 8功能缺失的突变体、WS为野生型、Col O为 另一种常用野生型，OE-I为AtNRTl. 8过量表达突变体(35S :POT1/Col 0)种子灭菌后， 播种于在1/4PNS培养基(按照如下文献中的配方配制Richard N. Arteca和Jeannette M. Arteca,A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically, 水培种植拟南芥的新方法，PHYSI0L0GIA PLANTARUM 108 188-193. 2000)上，在4°C冰箱春 化2天，然后置于人工气候室(16h/8h光周期，22°C )中培养5天。挑取生长状态较为相近的幼苗，转移至分别含有50uM Cd、Pb、Hg或As的重金属和 50mM NO3-的4种1/4PNS培养基上，每个株系选取8颗苗，并标记好它们此时在培养基上的 位置。转移后的植株在平板上继续生长10天后，观察它们的生长情况，并统计它们在10天 内主根长度的增加值，并拍照记录。盐胁迫处理中的表型变化研究采用上述类似实验方法进行。与上述方法不同的是胁迫试验所用的培养基为含有50mM NO3-和50mM NaCl或Na2CO3的1/4PNS培养基。结果显示=AtNRTl. 8功能缺失的nrtl. 8突变体相对于野生型WS对镉胁迫更加敏 感(图5)，而相对应的是，过量表达突变体(35S :P0Tl/Col 0)相对于野生型对照(Col 0)对于镉的抗性明显提高，对应的根长增加值见图5。采用Pb、Hg或As重金属进行的试验 也获得了相似的结果。上述结果表明=AtNRTl. 8基因调控植物对重金属的抗性能力，该基 因的过量表达可提高植物对重金属的抗性。同时，在盐胁迫处理中也观察到类似的表型，对应的根长增加值见(图6)。这表明 AtNRTl. 8可能在更广泛意义上对植物对于多种逆境的抗性起着调节作用。实施例5.重金属胁迫下，AtNRTl. 8对植物重金属分布的影响前述实施例的研究结果表明，AtNRTl. 8基因影响植物对重金属的抗性，发明人进 一步研究了 AtNRTl. 8基因是否也会影响重金属在植物体内的分布，这对提高该基因的应 用价值非常重要。采用了电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)来测定突变体中Cd的含量，具体方法 如下1)使 AtNRTl. 8 基因突变体(nrtl. 8、OE-1)和对应野生型(WS、Col 0)在 1/2MS 平板上生长5天后，转移至1/4PNS液体培养基上，培养4周；2)把它们转移至含有20uM Cd的1/4PNS液体培养基上处理3天，准备取材；3)材料先使用超纯水洗一次，5分钟，然后使用25mM的CaCl2 (pH值为5. O左右) 清洗材料2次，每次4分钟，最后再使用超纯水洗一次，5分钟；4)将取好的材料置于80°C的烘箱中，烘干24h ；待彻底干燥后，称取干重，每个突 变体和野生型都重复称重3次；5)把称重后的材料置于ICP测量管中，记录干重，然后往管中加入超纯级别的 70%浓硝酸1ml，过夜消解；6)第二天，在95°C水浴锅中消煮30分钟左右，直至看不到可见的沉淀；
7)往ICP测量管中加入13ml的超纯水，使彻底消解后的溶液总体积达到14ml，即 稀释14倍。中加超纯水稀释至14ml，即稀释14倍，然后使用ICP-MS (购自perkinelmer公 司型号为ELAN DRC-e测量所含Cd的量。ICP-MS的测定结果显示AtNRTl. 8的确影响植物Cd胁迫下Cd在植物体内的分 布，在WS和nrtl. 8中，在莲座叶和果荚中，WS中Cd的含量都低于nrtl. 8。而在过表达株 系中，AtNRTl. 8的这种影响更为明显，在过表达株系OE-I中，其在地上部分果荚和莲座叶 中的含量都显著低于对照Col 0(图7)。在其它过表达株系中也观察到类似的ICP表型。采用同样的方法，以Pb、Hg或As重金属进行的试验也获得了相似的结果。AtNRTl. 8基因的这种功能对提高农作物的食品安全性有很大的帮助。实施例6. AtNRTl. 8某因对NO,=在重金属镉胁泊条件下再分配的调控为了解AtNRTl. 8到底是如何调控植物对逆境的抗性能力，发明人分析了镉胁迫 条件下植物体内NO3-在植物体内的再分配情况。采用HPLC法测量植物组织中的NO3-含量，具体方法如下(I)AtNRTl. 8突变体nrtl. 8和OE-I以及对应的野生型WS、Col O材料使用1/4PNS 液体培养基或者含有20 μ M Cd的1/4PNS液体培养基处理3d后，分地上部分和地下部分取 材；(2)每份材料使用超纯水清洗4次，每次2分钟；(3)使用吸水纸吸干残留在组织上的水份，然后于天平上称重，记录各个样品的鲜 重值，置于1. 5ml的印pendorf管中；(4)按照30ul/mg比例，往其中加入超纯水；(5)使用沸水煮20分钟，然后置于液氮中速冻，-80°C冰箱中过夜；(6) 20800g离心材料5分钟；收集上清至干净的印pendorf管中；(7)使用0. 45um的滤膜过滤上清，然后将每个样品稀释20倍，使用HPLC(Agilent， 1200series,色谱柱为 PARTISIL 10SAX(strong anion exchange)column(Whatman, Clifton，NJ)，测量样品；HPLC 的测定条件为流动相45mM-50mM KH2PO4-H3PO4(pH2. 9-3. 0)；流速lmL/ min ；柱温:30°C ；检测波长:210nm ；检测范围:50pmol-200pmol (5 μ L-500 μ L)；出峰时间 Smin左右；每针的设置时间是13分钟。试验结果如图7所示在没有镉胁迫的情况下，nrtl. 8与野生型对照WS之间 的NO3-含量无论在叶中还是根中，都没有显著差别；而在镉胁迫条件下，二者地上部位的 NO3-含量都有所下降，但相互间没有明显差别，在地下部位的根中，野生型中的N03_明显高 于突变体nrtl. 8，这主要是由于野生型根中NO3-含量上升所致。结合前面的试验结果，可以推断由于在镉胁迫条件下，AtNRTl. 8基因在根中被诱导表达，使得木质部导管中较高浓度的NO3-释放出来，回到周围的根细胞内，从而有效减 轻由于镉胁迫导致的根NO3-浓度下降。实施例7. AtNRTl. 8基因转基因植株对干旱的抗性取Ws、nrtl. 8、Col 0、0E-1 (AtNRTl. 8 过量表达突变体(35S :P0T1/Col 0))、 0E-18 (AtNRTl. 8过量表达突变体另一株系)的成熟种子，春化3天，播至1/2MS平板培养6 天，再移至三合土、蛭石，分别浇等量的水、含6mM NH4NO3的培养液。18天之后将NH4NO3处理的植株分两部分，一部分浇NH4NO3 (浓度为6mM)，另一部分改浇(NH4) 2S04 (浓度为6mM)。 10天后选取离体叶片称量，计算失水量。每种植株取长势大体相同的叶片6片，在0、30min、 60min、120min、180min称量叶片鲜重，3个平行。失水量(％ ) = (W-Wi)/Wi* 100%。初步 实验证明Ws的失水量比nrtl. 8低，即Ws比nrtl. 8更抗旱。0E-18、OE-I的失水量比Col O 低，即 0E-18、OE-I 比 Col O 抗旱。 取Ws、nrtl. 8、Col 0、0Ε_1、0Ε_18五种植株的成熟种子，春化3天，播至V2MS平 板培养6天，再移至三合土，每组设置6个平行样品。在正常灌溉21天后进行干旱处理，并 观察植株是否有抗旱表型。观察表型发现OE-I、0Ε-18比Col O抗旱，且OE-I抗旱能力更 强一点(参见图9)。
_3] 实施例8. AtNRTl. 8转某因水稻对重金属胁泊、盐胁泊及干旱的杭件将AtNRTl. 8亚克隆到水稻表达质粒中，进行水稻转基因，从而获得抗性水稻转基 因植株。对转基因植株进行生理分析(方法同实施例4和实施例7)，以观察转入AtNRTl. 8 的植株是否能提高水稻对重金属、盐或干旱胁迫的抗性。根癌农杆菌转化水稻成熟胚操作程序一、转化菌液准备(1)第一天上午从-80°C保存的菌种中挑取少许于5mlYEP(Rif+Kan)液体培养 基，28 °C 培养，1 OOrpm。(2)第二天上午从含有农杆菌的YEP培养液中吸取1 2ml，转入25 50mlAB (Rif+Kan50)液体培养基，28°C，lOOrpm，4 小时后至 0D600 = 0. 5 左右。二、共培养第二天下午测0D600值，菌液离心5000rpm，15min,菌体沉淀悬浮于AAM(ASIOO) 至菌液0D600 = 0. 4 0. 6将菌液倒入装有水稻愈伤的三角瓶中，使愈伤浸泡其中20分钟， 并不时摇晃；用无菌纸吸干菌液，把已浸泡过的愈伤组织转移到垫有一层无菌滤纸的含有 2. 5% Phytagel的NBD(ASIOO)培养基上共培养2 3天。每个培养皿再加ImlAAM(ASlOO) 培养液充分湿润无菌滤纸。三、筛选将愈伤组织用无菌滤纸吸干(换一次滤纸)，转至筛选培养基上筛选抗性愈伤(45 天左右，中间换一次筛选培养基)(暗培养)。筛选所用培养基第一次筛选NBD+Cef700ul+Hyg25mg/L ；第二次筛选 NBD+Cef500ul+Hyg50mg/L。四、预分化将筛选生长的水稻愈伤转至预分化培养基(含有0. 45% Phytagel的NB(pH = 5. 7，无 2，4-D) +Car250+BAP2mg/L+NAAlmg/L+ABA5mg/L)，培养 10 天。五、分化将经过预分化的水稻愈伤转至分化培养基(含有0. 45% Phytagel的l/2MS(pH = 5. 7 5. 8) +蔗糖20g/L)上分化成苗(光照，15-30天)。六、生根将绿色小苗转至生根培养基(含有0. 45% Phytagel的l/2MS(pH = 5. 7 5. 8) + 蔗糖20g/L)上生根。
水稻愈伤组织培养(1)剥去种皮；(2) 75%酒精消毒1 2分钟；(3)无菌水冲洗2 3次；
(4)次氯酸钠消毒20 30分钟(无菌水次氯酸钠=3 1 4 1)(5)无菌水冲洗4 5次；(6)无菌滤纸吸干；⑵接入NBD培养基；(8)7 10天后切取愈伤组织转入相同培养基，1 2周后继代一次，即可进行转 化。对转基因植株进行生理分析的结果显示转入AtNRTl. 8的水稻植株对于重金属 胁迫(尤其是镉、铅、汞或砷)、盐胁迫(尤其是NaCl或Na2CO3)以及干旱的抗性均有所提
尚ο在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>AtNRTl. 8基因增强农作物对重金属或盐胁迫的抗性的应用<130)090797<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2037<212>DNA<213>人工序列<400>1atggatcaaa aagttagaca gtttgaggtt tgcactcaag acggtagcgt tgatcgtcac 60ggcaatccag ctatccgagc taataccggc aaatggctca ctgctattct cattctaggt 120aatgattctc tctctctttc tctctatata taccactgtt ctttgtctta aagtgttgtg 180ttttggattc taaagaaatg ggtttttggt tgatatagtg aatcaaggac tagctacgct 240tgcgttcttc ggtgtaggag tgaatttggt tctgtttctg actcgagtga tgggacaaga 300caatgcagaa gcggctaata atgttagtaa atggacagga actgtctata tcttctcttt 360gcttggtgct ttcctcagtg actcttattg gggacgttac aagacttgtg ctatctttca 420agcaagtttc gttgcagtaa gtgtcttcaa cactgctctg tctttttcta gggtttgttt 480ctttaacaat aagttaacat gttttaatgg attatagggg ttgatgatgt tatctttatc 540tactggtgcg ttattgcttg aaccaagtgg ttgtggagtt gaagattcgc cgtgtaagcc 600tcattcgacg tttaagacgg ttctgtttta tctgtcggtg tatctaatcg cgttagggta 660
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AtNRT1.8基因或其编码的蛋白质或多肽在增强植物对重金属的抗性、对盐胁迫的抗性或对干旱的抗性中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白质或多肽的序列选自(a)SEQ ID NO 3 ；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有增强 植物对重金属或盐胁迫的抗性的活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述AtNRTl.8基因是编码权利要求2所述 蛋白质或多肽的序列。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述AtNRTl.8基因选自(i)SEQID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :5 ；或(ii)在严格条件下与(ii)限定的序列杂交且具有增强植物对重金属或盐胁迫的抗性 的活性的分子。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述增强植物对重金属的抗性表现为降低 植物中的重金属含量。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述重金属、盐胁迫或干旱包括由以下物质 或情况引起的胁迫镉、铅、汞、砷、铜、铬、锑、锡、锌、钡、铋、镍、钴、锰、铁、钒、氯化钠、硫酸 钠、碳酸钠、碳酸氢钠或缺水。
7.一种载体，所述载体含有AtNRTl. 8基因。
8.一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求7所述的载体。
9.一种制备转基因植物的方法，所述方法包括(1)用含有AtNRTl.8基因的构建物转化植物细胞细胞、组织或器官；(2)选择转入AtNRTl.8基因的植物细胞、组织或器官；和(3)将步骤(2)中的植物细胞、组织或器官再生成植株，其中，所得的转基因植物对重金属或盐胁迫的抗性较未转化的植物有所增强。
10.用权利要求9所述方法制得的转基因植物的用途，所述转基因植物用于生产没有 重金属污染的农产品、重金属污染较相同条件下种植的非转基因植物降低的农产品、耐重 金属胁迫作物、耐盐胁迫作物或耐干旱胁迫作物。
全文摘要
本发明涉及AtNRT1.8基因增强农作物对重金属、盐胁迫或干旱胁迫的抗性的应用。具体涉及AtNRT1.8基因或其编码的蛋白质或多肽在增强植物对重金属、盐或干旱胁迫的抗性中的用途。本发明还提供了利用AtNRT1.8基因增强植物对重金属、盐或干旱胁迫抗性的基因工程方法，含有AtNRT1.8基因的载体和宿主细胞，制备转基因植物的方法和转基因植物。本发明的方法可使得植物对于重金属、盐、干旱胁迫的抗性提高，对于提高农作物产量和性状具有积极作用，具有广泛的应用前景。
文档编号C12N1/21GK101818168SQ200910046650
公开日2010年9月1日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者龚继明 申请人:中国科学院上海生命科学研究院