专利名称：：Mthfr基因snp指导叶酸及相关营养元素摄入的用途、检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及MTHFR(亚甲基四氢叶酸还原酶)基因的SNP(多态性位点)基因型用于指导叶酸及相关营养元素摄入的用途，一种MTHFR基因的SNP基因型的检测方法和试剂盒，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：人类的遗传基因与营养代谢的关系是息息相关的，遗传基因在人的一生中几乎不会改变，这就意味着我们的生理过程特性大部分都是从受精卵形成之初就决定的，例如我们的长相，身高和性格等。相对基因，健康状况却是不断在变化的，通过对遗传基因的分析可以帮助我们来预计健康发展的方向，提供个性化的健康咨询，提高生活质量。人类从外界摄取各种食物，经过消化、吸收和新陈代谢以维持机体的生长、发育和各种生理功能，这一连续过程就叫营养。一个人生命的整个过程都离不开营养。营养成分在体内的代谢过程离不开基因和基因的产物，每个人的基因都不完全相同，对营养代谢的方式也各有不同，如果能知道自己的遗传基因状况就能更好的吸收营养，更好的健康生活。最近，美国医学专家指出，人类基因组图谱成功绘制之后，一项以基因组为基础的营养学研究将给疾病治疗带来一场变革。将来，食疗师和医生也许就会根据个人基因图谱，来给患者制定食谱，以此有针对性的防病。随着人类基因组序列的绘制完成，生命科学领域的研究热点正迅速转向如何解读如此大量的基因组序列；如何从已知的序列中了解各个基因的功能、表达调控、多个基因及其产物之间的相互作用以及基因组和环境的相互作用等。其中对基因组序列的单个核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)形成的多态性研究是该阶段的重要研究内容。单核苷酸多态性(SNP)全称SingleNucleotidePolymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为21。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，原因是CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指变异频率大于的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3X106个。因此，SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。1998年，美国能源部和NIH人类基因组计划工作组共同决定将鉴定SNP和绘制SNP图谱作为人类基因组计划最后五年计划的一部分即人类基因组计划中SNP计划。具体目标是发展可快速、大规模鉴定和评价SNP及其它DNA序列变异的技术；对大部分已知基因编码区SNP进行鉴定；产生至少包括100000个标记物的SNP图谱；发展用于序列变异研究的学术基金；建立公共DNA样本和细胞株资源。正如我们现在所知的人类所有疾病或病理状态都直接或间接与基因的结构和功能相关，而疾病过程正是这些致病或相关基因与人体内外环境各因素相互作用的结果。SNP作为人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上，不仅可以作为遗传标记，通过连锁分析定位疾病基因，而且有些SNP本身就可直接导致疾病的发生，因此，SNP在疾病的早期风险性评估，早期诊断，预防和治疗等各方面具有重要功能和应用价值，在最近几年里受到异乎寻常的关注。MTHFR为亚甲基四氢叶酸还原酶，是叶酸代谢中最重要的酶，它以NAD⑵H为还原剂催化5，10一亚甲基四氢叶酸(5，10-methylenetetrahydrofolate,5,10-CH2THF)还原为5-甲基四氢叶酸(5-methyl-tetrahydrofo]ate，5-CH3THF)，而5-CH3THF是进一步提供甲基给甲硫氨酸，最后转移到SAM上，SAM是DNA等生物大分子甲基化的直接供体。MTHFR催化的还原反应不可逆，是甲基化的限速步骤，同时MTHFR受产物SAM的反馈调节。同时MTHFR的活性强弱直接影响底物5，10CH2THF的量，而这个正是用来进行胸腺嘧啶和嘌呤合成的原料。所以MTHFR处于连接DNA甲基化和DNA池的战略地位，它的缺陷可直接导致血浆中HcyQiomosysteine)的水平升高。由于MTHFR在叶酸代谢过程的独特地位，关于该酶的生化特点，蛋白质结构，基因的遗传多态性，分子流行病学以及与疾病的易感性和预后的关系等问题都有大量的研究报道。叶酸(Folicacid)是维生素B复合体之一，相当于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamicacid,PGA)，有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，如果缺少叶酸可招致红血球的异常未成熟细胞的增加和贫血以及白血球减少。叶酸的生物利用需要经过很多物理和化学的步骤，包括小肠吸收，血液中转运，细胞膜受体结合以及酶的作用转化为活性可利用的形式等。食物叶酸经小肠粘膜细胞内特异叶酰多谷氨酸水解酶(GCPIT)的作用，水解为喋酰单谷氨酸(或称单谷氨酸叶酸)后，依赖小肠细胞表面的特异性叶酸结合蛋白(即叶酸受体)主动摄取进入肝门静脉循环，随后单谷氮酸叶酸被还原并甲基化为5-甲基四氢叶酸(5-CH3THF)进入血液循环，5-CH3THF是血液和细胞中存在的主要叶酸形式[ChevrierC，PerretC，BahuauM,etal.FetalandmaternalMTHFRC677Tgenotype,maternalfolateintakeandtheriskofnonsyndromicoralclefts.AmericanJournalofMedicalGeneticsPartA2007；143A=248-57.]0细胞也可通过胞饮的形式吸收后单谷氨酸叶酸并通过FPGS转变为多谷氨酸叶酸，在肝脏、红细胞及其他组织细胞内贮存，其余部分则以单谷氨酸叶酸的形式分布于血浆、组织液、胆汁及尿液中。肝脏的叶酸浓度是血浆的几百倍，但其单谷氨酸叶酸浓度与血浆相近。在叶酸代谢的庞大网络中涉及多种合成酶，转移酶以及氧化和还原酶，已经证明这些酶的遗传多态性会导致的整个代谢网络的失衡。遗传流行病学已经验证出MTHFR，MS，TS，SHMT等与各种癌症相关。这些酶相互作用，同时与叶酸，B族维生素的相互作用影响叶酸代谢的方向和速度。叶酸代谢是近年来医学、遗传学和营养学研究的热点之一，主要是因为人们发现叶酸与神经管畸形、肿瘤和心血管疾病有关。已知MTHFR是同型半胱氨酸代谢中的关键酶之一，这种酶的活性和热稳定性都较低。现已证实，这种热不稳定性是由MTHFR基因等677位的碱基由C—TU298A—C型等的突变所造成的。MTHFR基因的遗传变异体在叶酸水平较低时易造成中度的高半胱氨酸血症，这种遗传与营养的交互作用，增加了心血管疾病的神经管缺陷的危险性。而实验和临床资料表明，大剂量叶酸补充可以增加体内5-甲基四氢叶酸生成，从而降低血浆同型半胱氨酸水平，减少心血管疾病的发病和神经管畸形儿童的出生率。由此推断，就MTHFR基因突变的个体而言，他们对叶酸的需求要高于普通人群。很多研究关注基于人群的MTHFRC677T和A1298c突变型与肿瘤的关系，但是结果有不一致的现象。大多数学者认为MTHFR突变型引起的酶活性降低可以引起叶酸代谢紊乱，表现叶酸紊乱后产生的一系列结果，当叶酸摄入较高时，这种缺陷就被缓解，所看到的不一致结果可能与研究者研究的角度和时间点不一样有关。流行病学研究揭示出MTHFRC677T遗传多态位点与结直肠癌，急性淋巴癌，子宫内膜癌以及食管癌的发生风险有关，提示是一个易感性因素[MooreLE,HungR,KaramiS,etal.Folatemetabolismgenes,vegetableintakeandrenalcancerriskincentralEurope.InternationalJournalofCancer2008；122:1710-5.]。神经管畸形(neuraltubedefects，NTDs)是指在胚胎发育早期，由于遗传倾向与一些致畸因素的影响，导致神经管闭合不全而产生的一组出生缺陷，主要包括无脑儿、脊柱裂、脑或脑脊膜膨出等。NTDs可引起孕妇流产、婴儿死亡和终生残疾，严重威胁着妇女儿童的身心健康和人口素质的提高，给社会的发展带来沉重负担。叶酸缺乏与NTDs的关系是近年来研究最多的。多数研究显示，妇女在妊娠前后服用叶酸可降低胎儿发生NTDs的危险性，使其发生率降低50%—70%。这一发现使得NTDs的研究取得了突破性进展，各国的NTDs发生率也随着叶酸的强化明显下降。21世纪初，NTDs在英国的发生率为3.3%;美国的发生率为0.5%。因此，妇女妊娠期定量补充叶酸已经成为预防NTDs发生非常有效的措施之一。但是，叶酸影响NTDs的发生可能是通过遗传代谢途径而不仅仅是摄入不足，所以仍有30%-45%的病例不能通过实施该措施阻止发生。
发明内容为解决上述技术问题，本发明提供一种MTHFR基因SNP指导叶酸及相关营养元素摄入的用途，一种指导叶酸及相关营养元素摄入的MTHFR基因的SNP的检测方法和试剂盒，利用PCR方法提取DNA，分析MTHFR的C677T和A1289C多态位点，阐明叶酸代谢相关遗传背景，从而指导其摄入叶酸及相关营养的多少。本发明是通过以下的技术方案实现的一种MTHFR基因SNP指导叶酸及相关营养元素摄入的用途。所述用途的MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型包含C677T和A1289C的多态位点的基因型，还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无意义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。所述叶酸摄入指导是根据SNP多态性位点基因型的不同，叶酸的日摄入量，相关营养元素摄入指导是维生素B12、B6、胆碱以及甜菜碱的摄入指导。所述用途其中(1)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298AA时，叶酸的摄入量为0.40.6mg/day,维生素B12摄入量为23μg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(2)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298AC时，叶酸的摄入量为0.40.6mg/day,维生素B12摄入量为23μg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(3)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298CC时，叶酸的摄入量为0.61.5mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(4)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298AA时，叶酸的摄入量为0.61.5mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(5)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298AC时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(6)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298CC时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(7)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298AA时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(8)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298AC时，叶酸的摄入量为2.54mg/day，维生素B12摄入量为510yg/day,维生素B6的摄入量为4lOmg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为10001500mg/day。(9)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298CC时，叶酸的摄入量为2.54mg/day，维生素B12摄入量为510yg/day,维生素B6的摄入量为4lOmg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为10001500mg/day。一种指导叶酸及相关营养元素摄入的MTHFR基因的SNP基因型的检测方法和试剂盒，所述检测方法包括基因组DNA样品的提取，PCR扩增反应，纯化反应，限制性内切酶酶切和DNA凝胶电泳分析。所述基因组DNA样品的提取选自血液、体液、组织样品和培养细胞中的一种，优选的选自血液。所述检测方法和试剂盒的MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型包含C677T和A1289C多态位点，还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无意义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。所述叶酸摄入指导是根据SNP多态性位点基因型的不同，叶酸的日摄入量，相关营养元素摄入指导是维生素B12、B6、胆碱以及甜菜碱的摄入指导。所述检测方法和试剂盒其中(1)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298AA时，叶酸的摄入量为0.40.6mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(2)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298AC时，叶酸的摄入量为0.40.6mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(3)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298CC时，叶酸8的摄入量为0.61.5mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(4)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298AA时，叶酸的摄入量为0.61.5mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(5)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298AC时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(6)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298CC时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(7)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298AA时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(8)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298AC时，叶酸的摄入量为2.54mg/day，维生素B12摄入量为510yg/day,维生素B6的摄入量为4lOmg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为10001500mg/day。(9)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298CC时，叶酸的摄入量为2.54mg/day，维生素B12摄入量为510yg/day,维生素B6的摄入量为4lOmg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为10001500mg/day。所述的试剂盒，其特征在于包括引物1，MTHFR-677-5，5，-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'；引物2，MTHFR-677-3，5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3‘；引物3，MTHFR-1298-5，5'-CTTGGGGAGCTGAAGGACTAC-3‘；引物4，MTHFR-1298-3，5'-CACTTGTGACCATCCGGTTG-3‘；10XBuffer；dNTP；ddH20；TaqPlusDNAPolymerase；10XHinfl酶切缓冲液；Hinfl内切酶；10XMB0I酶切缓冲液和MB0I内切酶。所述试剂盒还可以表现为微芯片、微检测系统或者依赖于各种载体的检测系统，以及包括前述检测系统的统一包装形式，如微孔板系统纸质载体、玻璃载体、尼龙膜载体、塑料载体、硅胶载体、凝胶载体和膜质载体中的一种。本发明的有益效果为通过上述的检测方法，可以根据分子生物学技术简单准确的检测MTHFR的C677T和A1298C的SNP多态位点基因型，从而应用于叶酸及相关营养元素摄入的指导，为叶酸代谢能力低者提供及时准确的营养摄入指导，防止因叶酸代谢能力低而产生的身体缺陷，为生活中个人尤其是孕前或孕期妇女服用叶酸及相关营养元素提供指导。本发明还提供了上述检测方法的试剂盒，从而降低了医疗成本。图1是叶酸及相关营养元素摄入的MTHFR基因的SNP基因型的检测方法的流程图。具体实施例方式下面对指导叶酸及相关营养元素摄入的MTHFR基因的SNP基因型的检测方法做进一步的说明。1试剂、材料及仪器1.1主要试剂和酶类ACD抗凝剂，蛋白酶K，TaqDNA聚合酶，分装dNTPs，PCRMarker,引物1，MTHFR-677-5，5，-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3‘引物2，MTHFR-677-3，5‘-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3‘引物3，MTHFR-1298-5，5'-CTTGGGGAGCTGAAGGACTAC-3‘引物4，MTHFR-1298-3，5'-CACTTGTGACCATCCGGTTG-3‘凝胶纯化试剂盒，其它试剂琼脂糖、EB、澳酚兰、二甲苯氰、平衡酚、氯仿、异戊醇、冰醋酸、无水乙醇、Tris、EDTANa2、SDS等1.2主要仪器设备GeneAmp9600PCR仪EPPEND0RF5415C台式高速离心机HITACHIHimacCR21型高速冷冻离心机GeneQuantll型紫外分光光度计微量进样器(多头)，0.5-10u1,10-100U1,200-1000ii1，300型电子天平Milli-QAcademic超纯水仪SH-650型微波炉DY-501型电泳仪FR-180A型电泳槽FR-200型紫外与可见分析装置PRUV-100B手提式紫外灯2实验步骤与结果分析2.1外周血DNA的抽提A.材料的预处理1)lml新鲜血液加入180u1A⑶抗凝剂抗凝，混勻后-70°C长期保存。2)0.5ml冻藏血加0.5mlPBS,用枪打勻，5000rpm5min,弃上清3)反复用PBS(0.5-0.8ml)吹打洗涤、离心弃上清，至上清无明显红色为止，弃上清。B.DNA的抽提和纯化4)消化沉淀中加入500iilTE，25iil20%SDS,4u110mg/ml蛋白酶K，混勻；55°C水浴2-3小时，至溶液透明为止。5)抽提冷却至室温，加700u1平衡酚，缓慢来回颠倒印pendorf管至混勻(约10分钟)；12k离心lOmin，上清转移至1.5ml印pendorf管，加700yl酚-氯仿-异戊醇(25241)，混勻(约来回颠倒lOmin)，12kl0min,上清转移至1.5mlepp管，加700u1氯仿-异戊醇(241)，混勻，12kl0min，上清转移至1.5ml印pendorf管。C.乙醇沉淀DNA6)上清中加入1/10体积3MNaAc和2-2.5体积_20°C预冷的无水乙醇，立即摇勻，-20°C1小时。7)取出后12000rpml5min，倒去乙醇，吸干，-20V预冷，70%乙醇洗涤(约500ill)；12000rpml5min，弃上清，吸干，空气中干燥。8)加50u1TE溶解，_20°C保存。D.DNA的电泳检测2u1样品加2iil6x上样液加8iUTAEbuffer室温，0.8%琼脂糖凝胶，恒压80V,电泳30min。电泳结束后，EB染色约15分钟，紫外观察。E.DNA的浓度测定及纯度判定取DNA溶液用TE液做适量稀释，以TE液作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。按下面公式计算浓度DNA浓度(ug/ul)=A260*50*稀释倍数/1000。DNA纯度的判定A260/A280比值应介于1.7-2.0之间。2.2SNP位点分型A.MTHFR的667C->T多态位点分型1)以人血中提取的基因组DNA为模板，根据已知的MTHFR基因的序列设计引物，引物序列如下引物1，MTHFR-677-5，5，-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3‘引物2，MTHFR-677-3，5‘-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3‘反应总体系50iiL。模板4iiL，引物1(引物3)和引物2(引物4)各liiL，10XBuffer5uL,dNTPluL,ddH2037.5uL,TaqPlusDNAPolymeraseO.5iiPCR条件为94°C预变性5min；循环条件为94°C变性30sec，68°C退火30sec，72°C延伸0.5min，共32个循环；最后72°C延伸5min。扩增到MTHFR基因含667C->T多态位点o2)琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR扩增产物取5ulPCR扩增产物与lul6X上样缓冲液(0.25%滨酚蓝，40%(W/V)蔗糖水溶液)混勻，在含0.5%滨化乙锭(EB)的2.0%琼脂糖凝胶中上样、电泳，电压为50V，时间为30min,以marker为参照，在紫外灯下观察，判断扩增产物是否为所需片段。3)限制性内切酶反应取PCR扩增产物10ul，用0.8ulHinfl内切酶于37摄氏度酶解消化。酶解体系包括10X酶切缓冲液2.OulHinfl内切酶0.8ulPCR扩增产物10.Oul无菌去离子水7.2ul总体积20ul酶切反应体系在37°C恒温箱中放置3h.4)琼脂糖凝胶电泳鉴别基因型型别11配制2.0%琼脂糖凝胶，内含0.5%EB。取8ulPCR酶切产物与1.7ul6X上样缓冲液混勻后，上样，电泳，电压为50V，以marker为参照，在紫外灯下观察，判断酶切产物的MTHFR基因667C->T多态位点型别。若片段为仅246bp，判定为野生型；有246bpl74bp和72bp三个片段，判定为杂合突变型，有174bp和72bp两个片段，判定为纯合突变型。B.MTHFR的1298A->C多态位点分型1)以人血中提取的基因组DNA为模板，根据已知的MTHFR基因的序列设计引物，引物序列如下引物3，MTHFR-1298-5，5'-CTTGGGGAGCTGAAGGACTAC-3‘引物4，MTHFR-1298-3，5'-CACTTGTGACCATCCGGTTG-3‘PCR反应总体系50iiL。模板4iiL，引物1(引物3)和引物2(引物4)各liiL，10XBuffer5uL,dNTPluL,ddH2037.5uL,TaqPlusDNAPolymeraseO.5iiPCR条件为94°C预变性5min；循环条件为94°C变性30sec，68°C退火30sec，72°C延伸0.5min，共32个循环；最后72°C延伸5min。扩增到MTHFR基因含1298A->C多态位点o2)琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR扩增产物取5ulPCR扩增产物与lul6X上样缓冲液(0.25%滨酚蓝，40%(W/V)蔗糖水溶液)混勻，在含0.5%滨化乙锭(EB)的2.0%琼脂糖凝胶中上样、电泳，电压为50V，时间为30min,以markr为参照，在紫外灯下观察，判断扩增产物是否为所需片段。3)限制性内切酶反应取PCR扩增产物10ul，用0.8ulMB0I内切酶于37摄氏度酶解消化。酶解体系包括10X酶切缓冲液2.OulMB0I内切酶0.8ulPCR扩增产物10.Oul无菌去离子水7.2ul总体积20ul酶切反应体系在37°C恒温箱中放置3h。4)琼脂糖凝胶电泳鉴别基因型型别配制2.0%琼脂糖凝胶，内含0.5%EB。取8ulPCR酶切产物与1.7ul6X上样缓冲液混勻后，上样，电泳，电压为50V，以marker为参照，在紫外灯下观察，判断酶切产物的MTHFR基因1298A->(多态位点型别。若片段为仅大片段，判定为野生型；有大中小三个片段，判定为杂合突变型，有中和小两个片段，判定为纯合突变型。2.3基于SNP位点分型的叶酸及相关营养元素摄入指导根据基因分型结果，叶酸等营养摄入指导请参考下表667C->T1298A->C叶酸摄入维生素维生素胆碱/甜菜位点基位点基因指导B12摄B6摄入碱摄入指因型型(mg/day)入指导指导导(μg/(mg/day)(mg/day)_day)_CCAA0.4-0.62-31.5-2500-800CCAC0.4-0.62-31.5-2500-800CCCC0.6-1.52-31.5-2500-800CTAA0.6-1.52-31.5-2500-800CTAC1.5-2.53-52-4800-1000CTCC1.5-2.53-52-4800-1000TTAA1.5-2.53-52-4800-1000TTAC2.5-45-104-101000-1500_TT_CC2.5-45-104-101000-15003试剂盒所含内容A.PCR反应体系10XBuffer,dNTP,ddH20,TaqPlusDNAPolymerase,引物1，MTHFR-677-5，5，-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'，引物2，MTHFR-677-3，5‘-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3‘引物3，MTHFR-1298-5，5'-CTTGGGGAGCTGAAGGACTAC-3‘，引物4，MTHFR-1298-3，5'-CACTTGTGACCATCCGGTTG-3‘。B.酶切反应体系IOXHinfI酶切缓冲液，HinfI内切酶，IOXMBOI酶切缓冲液，MBOI内切酶。权利要求一种MTHFR基因SNP指导叶酸及相关营养元素摄入的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述用途的MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型包含C677T和A1289C的多态位点的基因型，还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无意义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述叶酸摄入指导是根据SNP多态性位点基因型的不同，叶酸的日摄入量，相关营养元素摄入指导是维生素B12、B6、胆碱以及甜菜碱的摄入指导。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述用途其中(1)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298AA时，叶酸的摄入量为0.40.6mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(2)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298AC时，叶酸的摄入量为0.40.6mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(3)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298CC时，叶酸的摄入量为0.61.5mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(4)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298AA时，叶酸的摄入量为0.61.5mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(5)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298AC时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(6)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298CC时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(7)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298AA时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(8)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298AC时，叶酸的摄入量为2.54mg/day，维生素B12摄入量为510yg/day,维生素B6的摄入量为410mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为10001500mg/day。(9)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298CC时，叶酸的摄入量为2.54mg/day，维生素B12摄入量为510yg/day,维生素B6的摄入量为410mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为10001500mg/day。5.一种指导叶酸及相关营养元素摄入的MTHFR基因的SNP基因型的检测方法和试剂盒，其特征在于检测方法包括基因组DNA样品的提取，PCR扩增反应，纯化反应，限制性内切酶酶切和DNA凝胶电泳分析。6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述基因组DNA样品的提取选自血液、体液、组织样品和培养细胞中的一种，优选的选自血液。7.如权利要求5所述的检测方法和试剂盒，其特征在于所述检测方法和试剂盒的MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型包含C677T和A1289C多态位点，还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无意义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。8.如权利要求5所述的检测方法和试剂盒，其特征在于所述叶酸摄入指导是根据SNP多态性位点基因型的不同，叶酸的日摄入量，相关营养元素摄入指导是维生素B12、B6、胆碱以及甜菜碱的摄入指导。9.如权利要求5所述的检测方法和试剂盒，其特征在于所述检测方法和试剂盒其中(1)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298AA时，叶酸的摄入量为0.40.6mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(2)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298AC时，叶酸的摄入量为0.40.6mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(3)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CC和1298CC时，叶酸的摄入量为0.61.5mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(4)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298AA时，叶酸的摄入量为0.61.5mg/day,维生素B12摄入量为23yg/day,维生素B6的摄入量为1.52mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为500800mg/day。(5)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298AC时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(6)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677CT和1298CC时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(7)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298AA时，叶酸的摄入量为1.52.5mg/day,维生素B12摄入量为35yg/day,维生素B6的摄入量为24mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为800lOOOmg/day。(8)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298AC时，叶酸的摄入量为2.54mg/day，维生素B12摄入量为510yg/day,维生素B6的摄入量为410mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为10001500mg/day。(9)当所述MTHFR基因的SNP多态性位点的基因型为677TT和1298CC时，叶酸的摄入量为2.54mg/day，维生素B12摄入量为510yg/day,维生素B6的摄入量为410mg/day，胆碱以及甜菜碱的摄入量为10001500mg/day。10.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于包括引物1，MTHFR-677-5，5，-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3‘；引物2，MTHFR-677-3’5‘-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3‘；引物3，MTHFR-1298-5’5'-CTTGGGGAGCTGAAGGACTAC-3‘；引物4，MTHFR-1298-3’5'-CACTTGTGACCATCCGGTTG-3‘；.10XBuffer；dNTP；ddH20；TaqPlusDNAPolymerase；10XHinfI酶切缓冲液；Hinfl内切酶；10XMB0I酶切缓冲液和MB0I内切酶。11.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还可以表现为微芯片、微检测系统或者依赖于各种载体的检测系统，以及包括前述检测系统的统一包装形式，如微孔板系统纸质载体、玻璃载体、尼龙膜载体、塑料载体、硅胶载体、凝胶载体和膜质载体中的一种。全文摘要本发明公开了一种MTHFR基因SNP指导叶酸及相关营养元素摄入的用途，一种指导叶酸及相关营养元素摄入的MTHFR基因的SNP的检测方法和试剂盒，由于提供与叶酸代谢能力及相关营养摄入的SNP基因型的阳性位点不同，从而发现可能由此产生身体缺陷的原因，为生活中个人尤其是孕前或孕期妇女服用叶酸及相关营养的摄入提供指导。文档编号C12Q1/68GK101864479SQ200910049499公开日2010年10月20日申请日期2009年4月17日优先权日2009年4月17日发明者吴奇涵,窦同海,钟鸣申请人:吴奇涵;钟鸣;窦同海