专利名称：抗心绞痛药物疗效检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体抗心 绞痛药物疗效的试剂盒，通过检测抗心绞痛药物用药靶向位点ALDH2基因、CYP3A4基因、 CYP3A5基因、CYP2D6基因和CYP2C9基因多态性位点来评估个体抗心绞痛药物疗效。
背景技术：
心绞痛(angina pectoris)是冠状动脉供血不足，心肌急剧的、暂时缺血与缺氧所 引起的临床综合征。其特点为阵发性的前胸压榨性疼痛感觉，可伴有其他症状，疼痛主要位 于胸骨后部，可放射至心前区与左上肢，常发生于劳动或情绪激动时，持续数分钟，休息或 用硝酸酯制剂后消失。本病多见于男性，多数病人在40岁以上，劳累、情绪激动、饱食、受 寒、阴雨天气、急性循环衰竭等为常见的诱因。rs671是位于ALDH2基因上的G/A多态，导致ALDH2基因编码的蛋白第504个氨基 酸由Glu[E]变为Lys[K]。该位点多态在世界人群中的频率分布为G 0. 935，A 0. 065 ；在 中国人群中的频率分布为G 0. 844，A 0. 156。李一峰、李青松等人对ALDH2多态E504K对 硝酸甘油疗效和代谢的影响做了一系列的研究。说明了这个单核苷酸多态明显影响线粒体 乙醛脱氢酶催化硝酸甘油生物转化的效率，并且可以部分解释中国人群中心绞痛患者对硝 酸甘油的药物疗效差异的机制，但是对硝酸甘油清除性代谢的影响并不显著。CYP3A4，5是重要的I相代谢酶，主要通过C-或N-脱烃、C-羟化等反应来代谢药 物。参与约50%的药物代谢。心绞痛治疗常用药物钙通道阻滞剂(氨氯地平、地尔硫卓、硝 苯地平、维拉帕米)，CYP3A4，5参与了代谢过程，并且处于主要代谢途径，此时酶活性的高 低对药物药效及安全性的影响极大。因此，CYP3A4，5基因多态性导致的酶活性改变将在很 大程度上反映抗心绞痛药物的用药效果，CYP3A4，5基因的分型检测对于临床抗心绞痛药物 的用药指导具有的重要现实意义。CYP3A4*18是目前已确定的CYP3A4SNP中等位基因突变率最高的位点，为外显子 10上T878C突变，引起第293位亮氨酸(L)被脯氨酸(P)所取代。L293氨基酸残基被包裹 在CYP3A4蛋白质的里面。由于L293P非组成性突变，影响了 CYP3A4蛋白的构成，底物结合 能力和酶催化活性。Gotoh证明了哺乳动物CYP450存在6种底物识别位点。根据这一结 论，L293P就位于第4种底物识别位点，而这种位点在不同动物中是高度保守的，并与底物 特异性相关。有研究认为该等位基因可能会提高CYP3A4酶活性，比如CYP3A4*18增加了对 睾酮、氯螨硫磷的催化活性；因此有必要研究该位点对特定药物的影响。CYP3A5的表达在人群中呈多态分布，它的功能仅在10 20%的白人，33%的东方 人和55 %的美国黑人中存在，这主要是因为CYP3A5*3突变导致了不适当的mRNA剪接，使终 止密码子提前，导致CYP3A5缺乏。CYP3A5*3等位基因的发生频率的变化范围由50% (美 国黑人)到90% (白人)。CYP3A5*3/*3纯合子的肝微粒体表达CYP3A5的水平很低，表现 为咪达唑伦的代谢活性降低。CYP3A5*3/*3纯合子个体CYP3A5活性低于CYP3A5*3/*1杂 合子，而CYP3A5*1/*1纯合子活性最高，表现出明显的基因剂量效应。CYP3A5*5、CYP3A5*6、CYP3A5*7也可形成可变剪切，从而导致编码的提前结束或外显子的丢失。CYP2D6是重要的I相代谢酶，参与约25%临床常用药物的代谢，包括β受体阻滞 剂、抗抑郁药物、抗精神病药物及化疗药物等。由于CYP2D6基因存在遗传多态性导致个体 之间CYP2D6酶活性有差异，出现药物代谢能力的多态性，导致病人用药时很难获得最佳血 药浓度，如血药浓度过低无法有效发挥药物疗效或浓度过高出现毒副作用。心绞痛治疗常 用药物钙通道阻滞剂(维拉帕米、哌克昔林)β受体阻滞剂(烯丙洛尔、普萘洛尔、美托洛 尔、噻吗洛尔)，CYP2D6都参与了代谢过程，并且对于某些药物2D6是主要代谢酶，此时酶活 性的高低对药物药效及安全性的影响极大。因此，CYP2D6基因多态性导致的酶活性改变将 在很大程度上反映抗心绞痛药物的用药效果，CYP2D6基因的分型检测对于临床抗心绞痛药 物的用药指导具有的重要现实意义。CYP2D6基因呈现高度多态性，目前已知有63种主要的等位基因，导致酶活性增 加、降低或缺失。CYP2D6等位基因活性的改变是由于基因突变造成表达产物酶分子的改变， 从而产生代谢缺陷。基因突变的主要方式是碱基缺失或替换引起读码框架移位，或者大片 段基因的丢失。心绞痛治疗常用药物钙通道阻滞剂(地尔硫卓)，CYP2C9都参与代谢过程，此酶活 性的高低对地尔硫卓药效及安全性的影响较大。因此，CYP2C9基因多态性导致的酶活性改 变将在很大程度上反映抗心绞痛药物的用药效果，CYP2C9基因的分型检测对于临床抗心绞 痛药物的用药指导具有的重要现实意义。心绞痛治疗常用药物β受体阻滞剂(普萘洛尔)，CYP2C19参与代谢过程，该酶 活性的高低对普萘洛尔的药效及安全性的影响极大。因此，CYP2C19基因多态性导致的酶 活性改变将在很大程度上反映抗心绞痛药物的用药效果，CYP2C19基因的分型检测对于临 床抗心绞痛药物的用药指导具有的重要现实意义。对CYP2C19催化代谢的药物，在人群中 可表现为2种代谢型，一种为强代谢型(extensive metabolizer, EM)，另一种为弱代谢型 (poor metabolize^PM)。多数人一般表现为强代谢，弱代谢则主要是由于2个等位基因的 突变和(或)缺失引起的。PM发生率存在着明显种族差异，白种人和非洲黑人中PM发生率 为2% 4%，东方人高达13% 23%。在一个大样本量的研究中，中国人CYP2C19的PM 所占的比例为14%，也就是有1.8亿人为PM。
发明内容
基于抗心绞痛药物用药靶向位点ALDH2基因、CYP3A4基因、CYP3A5基因、CYP2D6 基因和CYP2C9基因多态性可用来评估个体抗心绞痛药物疗效的基础上，本发明提供一种 检测个体抗心绞痛药物疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测抗心绞痛药物用药靶向位点ALDH2基因、CYP3A4基因、CYP3A5基因、CYP2D6 基因和CYP2C9基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对；荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离 子水等)。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对 可用常规的探针合成技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括IOX荧光定量PCR反应缓冲液5 μ 1，25mM dNTP 混合液 0. 5 μ 1，25mM MgC12 溶液 3μ 1，5units/y 1 Taq DNA 聚合酶 0· 125 μ 1，20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水 26. 625 μ I0本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2 荧光定量PCR反应使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行5次独立的荧光定量PCR反应，每次 反应的体系为总体积10 μ 1，包含浓度为20ng/μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX荧光定量PCR 反应缓冲液、0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA聚合酶、20 μ M的有义引物和反义引物各0. 225 μ 1、10 μ M的带VIC荧光探针和带 FAM荧光探针各0. 25 μ 1，去离子水5. 325 μ 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环 的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤4 基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示 的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因 型。
权利要求
一种检测个体抗心绞痛药物疗效的试剂盒，其特征在于包括检测抗心绞痛药物用药靶向位点ALDH2基因、CYP3A4基因、CYP3A5基因、CYP2D6基因和CYP2C9基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括 IOX荧光定量PCR反应缓冲液5 μ 1，·25mM dNTP 混合液 0. 5 μ 1，·25mM MgCl2 溶液 3 μ 1，·5units/y 1 Taq DNA 聚合酶 0. 125 μ 1，·20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，·10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水26. 625 μ 1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明公开了一种检测个体抗心绞痛药物疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测抗心绞痛药物用药靶向位点ALDH2基因、CYP3A4基因、CYP3A5基因、CYP2D6基因和CYP2C9基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过检测抗心绞痛药物用药靶向位点ALDH2基因、CYP3A4基因、CYP3A5基因、CYP2D6基因和CYP2C9基因多态性位点来评估个体抗心绞痛药物疗效。
文档编号C12Q1/68GK101928760SQ20091005395
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司