专利名称：一种用甲醇酵母制备抑肽酶衍生物的新方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种用甲醇酵母表达制备抑肽酶衍生物的新 方法。
背景技术：
上世纪三十年代，人们从牛肺中分离了一种抑制激肽释放酶(kallikrein)的物 质，后来发现这是牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)。早在1959年德国首先以商品名为Trasylol 上市用于治疗胰腺炎。1987年外国科学家偶然发现了 Trasylol 具有非常显著的止血作 用。牛胰蛋白酶抑制剂是一种很强的广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂，它可以抑制胰蛋白酶、胰凝 乳蛋白酶、纤维蛋白溶酶和血浆激肽释放酶等，人们又称之为抑肽酶(aprotinin)。天然抑 肽酶是由58个氨基酸残基组成的单链多肽，有三对二硫键，其活性中心位于15位赖氨酸。抑肽酶具有抑制纤溶系统的激活、保护血小板的功能、止血和抑制炎性反应等多 种作用，是一种很有价值的药物。抑肽酶是国家基本医疗保险药品中之一，首次收载于中 国药典(90版)。抑肽酶在预防和治疗各种出血，如纤溶系统亢进引起的出血、外伤引起的 出血性休克和产后大出血等，尤其在心脏直视手术中，能使术中、术后出血量减少一半以上 (30%-100%)，缩短手术时间，减少术后并发症(感染等)发生率，减少可能由输血引起病 毒(爱滋病、肝炎)感染的危险性。此外，抑肽酶还可用于其他疾病的治疗，如急、慢性胰腺 炎、肺气肿、喘息性支气管哮喘的首选药物，也用于胸、腹膜粘连的预防；还有抑制胶原酶的 作用，治疗急性关节炎疗效极佳；近来，在抗病毒、抗癌症方面治疗作用的研究报道越来越 多，显示出非常广阔的应用前景。目前临床上使用的抑酶肽都从牛胰或牛肺中提取，价格昂贵，这使得它的应用受 到一定的限制。尽管如此，国内心胸外科和胰腺手术仍广泛使用抑肽酶，仅阜外医院每年进 口的抑肽酶用量就价值约400万人民币(参见中国专利0113609. 1)。近年来，疯牛病蔓延到许多国家，这使得抑肽酶的原料来源大大减少，况且从牛胰 或牛肺提取的抑肽酶成本高，质量不稳定，还有潜在疯牛病的危险。抑肽酶是由58个氨基酸残基组成的单链多肽，从理论上是可以用基因工程 重组的方法制备，国外也有文献和专利报道。(参见美国专利4, 894, 436,5, 258, 302, 5，164，482 ；5，591，603,5, 707，831 ；中国专利95106042. 2,96120494. χ,97115348. 5)。他 们企图用大肠杆菌表达系统或酵母表达系统来表达。但是大肠杆菌胞内表达容易形成包含 体，变复性也十分困难，收率很低，大肠杆菌分泌表达，表达量低。酵母表达存在严重的N端 不均一的问题。Vedvick等人曾报道抑肽酶发酵表达量可达0. 93克/升，其生物活性也和 天然的抑肽酶一样，很遗憾的是其表达产物N端不均一，有的N端会多2个额外的氨基酸， 有的多4个额外的氨基酸，有的多11个额外的氨基酸，这些产物在在理化性质上非常相似， 很难被分离开来，即使分离开，收率也很低。国内也有人从事这方面的研究，如甘肃大得利生化制药厂，他们用细菌表达系统 表达，表达量低；还有中国药科大学用包涵体表达，需要复性，收率低。
本专利描述了用甲醇酵母表达系统，以分泌的方式高效表达融合蛋白，然后在用 酶或者化学方法切开，从而得到N端均一的抑肽酶衍生物。
发明内容
本发明的目的提供一种基因工程方法生产、表达量高、高纯度的抑肽酶衍生物的 新方法。这种抑肽酶衍生物具有完全的天然抑肽酶的生理活性。本发明提供的抑肽酶衍生物的制备新方法包括以下步骤1.抑肽酶衍生物N端延伸融合蛋白的构建经过大量查阅文献资料，我们找到几种在甲醇毕赤酵母中高效表达的蛋白，例如， 凝胶蛋白(gelatins)、醇氧化酶、血清白蛋白和水蛭素等，我们将其中的一种蛋白放在抑肽 酶衍生物的N端之前，中间用连接肽相连。连接肽和抑肽酶之间加上切割位点。在融合蛋 白切割位点之前的任何位置，可以插入组氨酸，组氨酸可以是一个或多个，可以连在一起或 者分散插入。2.合成对应于抑肽酶衍生物N端延伸融合蛋白的cDNA按照甲醇酵母喜好的密码子设计并人工合成融合蛋白cDNA(APN fusionDNA)。3.融合蛋白基因工程菌的构建将APN fusion DNA重组到甲醇酵母分泌表达载体，用单酶切方法线性化，然后转 化甲醇酵母宿主菌，外源基因整合到宿主菌的染色体上，用适当的抗性筛选阳性克隆，然后 进行增殖和表达筛选，从而得到高表达的基因工程菌(APNfusion)。4.基因工程菌(APN fusion)高密度发酵按照Invitrogen公司发酵操作手册中的方法对筛选出的APN fusion工程菌上罐 发酵。甲醇诱导48小时后，经过总蛋白测定，SDS-PAGE电泳和扫描分析，培养基上清融合 蛋白的表达量不低于1.5克/升。5.融合蛋白的纯化和裂解，以及抑肽酶衍生物的获得发酵液上清过金属螯合层析柱，经洗涤后，洗脱，收集洗脱峰。洗脱液透析后，用酶 或者化学物质裂解反应。(如用有毒物质裂解，要进行脱毒处理)反应液稀释后过金属螯合 层析柱，洗涤，收集流出液，流出液经透析后，过SP-Sepharose柱，经洗脱后，取样分析，得 到抑肽酶衍生物，经SDS-PAGE和RP-HPLC检测，其纯度大于98%。 本专业的技术人员在不违背本专利的精神的情况下，所作出的变动仍在本专利的 保护范围内。图1是本发明制备方法的流程图。本发明方法构建的抑肽酶衍生物基因工程菌表达量高，产生的抑肽酶衍生物纯度 高，完全具有天然抑肽酶的生理活性。
图1.本发明制备方法的流程 2. APN fusion 的构建图 3. pPICZaA-APN fusion 表达载体的构建图4.发酵诱导表达Met- fusion还原型SDS-PAGE电泳图谱
A.未经甲醇诱导时的发酵上清液，上样22. 5 μ L ；B、C、D、Ε、F、G、H分别为甲醇诱 导8、16、24、32、40、48小时后的发酵上清液，上样22.蛋白质中分子量标准(LMW Marker Kit, Amersham Pharmacia Biotech)。图5. Pro-APN fusion酸裂解还原型SDS-PAGE电泳图谱A、B为酸裂解的产物，C为融合蛋白，D为aprotinin标准品图6.抑肽酶衍生物(SEQ ID NO 1)的质谱图7.本发明实例中提到的抑肽酶衍生物的氨基酸序列同抑肽酶的氨基酸序列比 较
具体实施例方式实施例1 抑肽酶衍生物N端延伸融合蛋白APN fusion的构建及相应的核酸序列的设计和 合成实施例1. 1 Met-APN fusion (SEQ ID NO 4)的构建及相应核苷酸序列的获得我们设计如图1的序列。该序列的特点如下1)该序列将凝胶蛋白片段(SEQ ID NO 2)通过连接肽和抑肽酶衍生物(SEQID NO 1)相连，连接肽和抑肽酶衍生物之间有一个甲硫氨酸，为溴化氰裂解位点。这里的抑肽 酶衍生物为52Leu抑肽酶。2)为了便于分离纯化，在凝胶蛋白片段N端第8个氨基酸后插入6个His(SEQ ID NO 3)。3)在凝胶蛋白片段之前的EAEA序列作为Ste 13的切割识别位点，在EAEA序列之 前加LEKR作为Kex2酶切识别位点。4)为了便于克隆，将Kex2酶切识别位点的LE设计为CTCGAG，它可被XhoI识别； 在抑肽酶衍生物序列之后加终止密码子TGA，紧接着是NotI的酶切位点GCGGCCGC。5)上述DNA序列(Met-APN fusion DNA)是用甲醇酵母偏好密码子设计。Met-APN fusion DNA (SEQ ID NO 5)委托上海生宏生物公司合成。该序列克隆到载体PUC18，经DNA 测序分析，与设计完全一致。实施例1. 2 =Pro-APN fusion (SEQ ID NO 7)和 Gly-APN fusion (SEQ ID NO 10) 的构建及相应核苷酸序列的获得用酸裂解位点Asp-Pro和Asp-Gly分别替换Met-APNfusion溴化氰裂解位点Met， 同时将52Leu替换为Met，就得到Pro-APN fusion和Gly-APN fusion。通过酸裂解分别可 得到 Pro-aprotinin(SEQ ID NO 6)或 Gly-aprotinin (SEQ IDNO 9)。按照《分子克隆》的方法以Met-APN fusion DNA为最初的模板，分别用PCR的方 法实现上述替换，得到 Pro-APN fusion DNA (SEQ ID NO 8)和 Gly-APNfusion DNA (SEQ ID NO 11)。实施例1. 3 =TEV-APN fusion (SEQ ID NO 12)的构建及相应核苷酸序列的获得用TEV 酶裂解位点 GluAsnLeuTyrPheGlnGlyGly 替换 Met-APN fusion 溴化氰裂 解位点Met，同时将52Leu替换为Met，就得到TEV-APNfusion。通过TEV裂解分别可得到GlyGly-aprotinin(SEQ ID NO: 13)。按照《分子克隆》的方法以Met-APN fusion DNA为最初的模板，分别用PCR的方 法实现上述替换，得到 TEV-APN fusion DNA (SEQ ID NO: 12)。实施例2 APN fusion表达菌株的构建1)选用pPICZaA为表达载体。该载体作为穿梭质粒，其特点为，有一个强的启动 子(A0X1)，可分泌表达，Zeocirf为其抗性筛选标记，容易筛选到高考贝的菌株，可在XhoI 和NotI之间插入外源基因。2)用XhoI-NotI双切PUC18质粒得到DNA片段，克隆到pPICZ α A的XhoI-NotI位 点，构建重组质粒PPICZaA-APN fusion。3)重组质粒经测序分析正确后，用SacI酶切线性化处理后，电转化宿主菌X33感 受态细胞，并涂布分别含有100、200、300、400μ g/mL Zeocin的四块YPD平板，大量挑取单 菌落，接种YPD液体培养基，用摇瓶筛选，SDS-PAGE电泳检测，挑出表达量最高的一株作为 工程菌株记为 pPICZ a A-APN fusion/x33。实施例3 APN fusion基因工程菌的高密度发酵采用分批补料发酵的方式。1)种子液的制备取甘油保存管，按1 100的比例接人装20mL种子培养基的250mL三角瓶中， 30°C，250r/min，培养16-24小时。然后按1 10的比例接人装500mL种子培养基的IOOOmL 三角瓶中，30°C，250r/min，培养12小时。镜检无杂菌。2) 9L分批补料高密度发酵按1 10的接种比例，将种子液接入已预先灭菌装有4. 5L分批发酵培养的9L发 酵中进行分批补料培养(温度控制在30°C，用氨水将pH调为至5. O左右)，当碳源耗尽后 (Do陡然上升，Imin内)，流加补料生长培养基(流加速率维持溶氧大于20% )。当菌体湿重 为200克/L左右停止补料，甘油耗尽后，补入甲醇诱导表达(pH用25%氨控制为3. 0，温度 控制在20°C )，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速率使溶氧大于20%，并且停止 补加甲醇后，溶氧在Imin内可升高10 %。在发酵的过程中，空气流量保持在5-20L/min，罐 压保持在0.5-0.8bar。每八小时取样一次。离心的上清液，用上清液做SDS-PAGE电泳，每 孔加入20 μ L上清液，用靠马斯亮蓝染色。图4.发酵液中APN fusion的还原型SDS-PAGE 电泳图谱。实施例3:APN fusion分离纯化、裂解和抑肽酶衍生物的获得APN fusion 分离纯化发酵上清液过含有20mM磷酸钠盐缓冲液(pH 7. 8)预平衡的Ni (II)-Chelating Sepharose FF柱，以含20mM磷酸钠盐缓冲液(pH7. 8)洗涤10个柱体积后，以20mM柠檬酸 钠盐缓冲液(PH 3.0)洗脱，收集洗脱峰。融合蛋白的裂解Met-APN fusion是按下述方式裂解的用旋转蒸发仪将上述洗脱峰真空浓缩到0. 3克/mL，再加入甲酸为浓缩液体积的二倍，混勻后，按10mg/334mg(融合蛋白)的比例加入溴化氰，在22°C、保温16-18小时。然 后用旋转蒸发仪真空浓缩到原来的体积。Pro-APN fusion 和 Gly-APN fusion 是按下述方式裂解的将Pro-APN fusion或Gly-APN fusion过金属鳌合层析的洗脱液，加入浓盐酸到 终浓度0.01N，80°C，保温2-4小时。取样电泳直到完全裂解。调pH到中性。抑肽酶衍生物 的获得稀释后过预先用缓冲液(20mM PB，pH 7. 8)平衡附(II)-Sepharose FF，经洗脱后， 收集洗脱液。洗脱液过预先用缓冲液平衡SP Sepharose FF柱，再用缓冲液(0. 6M NaCl, 20mM PB，pH 6.0)洗脱，收集流出液，取样分析，得到抑肽酶衍生物。经SDS-PAGE和RP-HPLC 检测，其纯度均大于98%。实施例4 抑肽酶衍生物的生物活性按照中国药典上的方法，利用抑肽酶衍生物对胰蛋白酶的抑制实验和滴定分析来 测定。就是抑制胰酶催化的N-苯甲酰基-L-精氨酸乙脂(BAEE)的水解，通过酸碱滴定测 定反应中释放的羧基基团。胰蛋白酶的残留活性是活性化合物抑制活性的度量标准。实验时，我们用天然抑肽酶(珠海丽珠集团的赫泰林)作对照，结果表明用这种基 因工程方法制备的抑肽酶衍生物的比活与天然的抑肽酶一样。序列表(1) 一般资料(i).申请人肖建国(ii).发明题目一种甲醇酵母制备抑肽酶衍生物的新方法(iii).序列数目11(2) SEQ ID NO 1 的资料⑴.序列特征a.长度58个氨基酸b.类型氨基酸c.链型单链d.拓扑学未知(ii).分子类型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO 11 RPDFCLEPPY TGPCKARIIR YFYNAKAGLC QTFVYGGCRA KRNNFKSAED 5051 CLRTCGGA58(3) SEQ ID NO 2 的资料(1).序列特征a.长度17个氨基酸b.类型氨基酸c.拓扑学未知(2).分子类型多肽(3).序列描述0096]
0097]
0098]
0099]
0100] 0101] 0102]
0103]
0104]
0105]
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0119]
0120] 0121] 0122]
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0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
1 GPPGEPGNGS PGNQGQP17
(4)SEQ ID NO 3序列的资料
(1).序列特征
a.长度23个氨基酸
b.类型氨基酸
c.拓扑学未知
(2).分子类型多肽
(3).序列描述=SEQID NO 3
1 GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQP23
(5)SEQ ID NO 4序列的资料
(1).序列特征
a.长度88个氨基酸
b.类型氨基酸
c.拓扑学未知
(2).分子类型多肽
(3).序列描述=SEQID NO 4
1 GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQPGGSGGGM RPDFCLEPPY TGPCKARIIR 50 51 YFYNAKAGLC QTFVYGGCRA KRNNFKSAED CLRTCGGA88
(6)SEQ ID NO 5序列的资料
(1).序列特征
a.长度:299bp
b.类型核苷酸
c.拓扑学线性
(2).分子类型人工合成DNA
(3).序列描述=SEQID NO 5 1 CTCGAGAA 51 TCATCATC
GAGAGGCTGAAGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCA50CATCATGGATC TCCTGGTAACCAAGGACAGCCCGGTGGTT100TATGAGACCTGACTTCTGTTTAGAGCCACCATACACTGGA150CCCGTATTATTAGATACTTTTACAACGCTAAGGCCGGACT200TTCGTTTACGGTGGATGTAGAGCTAAGAGAAACAACTTCA250GGACTGTTTAAGAACCTGTGGTGGTGCTTGAGCGGCCGC299的资料
(i).序列特征
a.长度59个氨基酸
b.类型氨基酸
c.链型单链
d.拓扑学未知 ( ).分子类型多肽 (iii).序列描述=SEQ ID NO0135]
0136]
0137]
0138]
0139]
0140]
0141]
0142]
0143]
0144]
0145]
0146]
0147]
0148]
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
0155]
0156]
0157]
0158]
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0160] 0161] 0162]
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0167]
0168]
0169]
0170]
0171]
0172]
0173]
1 PRPDFCLEPP YTGPCKARII RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE 50 51 DCMRTCGGA59
(8)SEQ ID NO 7序列的资料
(1).序列特征
a.长度89个氨基酸
b.类型氨基酸
c.拓扑学未知
(2).分子类型多肽
(3).序列描述=SEQID NO 7
1 GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQPGGSGGGD PRPDFCLEPP YTGPCKARII 50
51RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE DCMRTCGGA89
(9)SEQ ID NO 8序列的资料
(1).序列特征
a.长度:302bp
b.类型核苷酸
c.拓扑学线性
(2).分子类型人工合成DNA
(3).序列描述=SEQID NO 8 1 CTCGAGAA
52TCATCATC
301 GC (IO)SEQ ID NO 9 的资料 (i).序列特征
a.长度59个氨基酸
b.类型氨基酸
c.链型单链
d.拓扑学未知 ( ).分子类型多肽 (iii).序列描述=SEQ ID NO
GAGAGGCTGAAGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCA50CATCATGGATCTCCTGGTAACCAAGGACAGCCCGGTGGTT100TGATCCTAGACCTGACTTCTGTTTAGAGCCACCATACACT150AGGCCCGTATTATTAGATACTTTTACAACGCTAAGGCCGG200ACTTTCGTTTACGGTGGATGTAGAGCTAAGAGAAACAACT250TGAGGACTGTATGAGAACCTGTGGTGGTGCTTGAGCGGCC300 3029
1 GRPDFCLEPP YTGPCKARII RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE 51 DCMRTCGGA
(Il)SEQ ID N0:10序列的资料 (1).序列特征
a.长度89个氨基酸
b.类型氨基酸
50 59
90174]C.拓扑学未知0175](2)分子类型多肽0176](3)序列描述:SEQ ID NO 100177]1GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQPGGSGGGD GRPDFCLEPP YTGPCKARII500178]51RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE DCMRTCGGA890179](12)SEQ ID NO 11序列的资料0180](1)序列特征0181]a.长度:302bp0182]b.类型核苷酸0183]C.拓扑学线性0184](2)分子类型人工合成DNA0185](3)序列描述:SEQ ID NO 110186]1CTCGAGAAAAGAGAGGCTGA AGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCA500187]53TCATCATCATCATCATGGAT CTCCTGGTAACCAAGGACAGCCCGGTGGTT1000188]101CCGGTGGTGGTGATGGTAGA CCTGACTTCTGTTTAGAGCCACCATACACT1500189]151GGACCATGCAAGGCCCGTAT TATTAGATACTTTTACAACGCTAAGGCCGG2000190]201ACTGTGTCAAACTTTCGTTT ACGGTGGATGTAGAGCTAAGAGAAACAACT2500191]251TCAAGTCTGCTGAGGACTGT ATGAGAACCTGTGGTGGTGCTTGAGCGGCC3000192]301GC3020193](12)SEQ ID NO 12序列的资料0194](1)序列特征0195]a.长度320bp0196]b.类型核苷酸0197]C.拓扑学线性0198](2)分子类型人工合成DNA0199](3)序列描述:SEQ ID NO 120200]1CTCGAGAAAAGAGAGGCTGA AGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCA500201]54TCATCATCATCATCATGGAT CTCCTGGTAACCAAGGACAGCCCGGTGGTT1000202]101CCGGTGGTGGTGAGAACCTG TACTTTCAAGGTGGTAGACCTGACTTCTGT1500203]151TTAGAGCCACCATACACTGG ACCATGCAAGGCCCGTATTATTAGATACTT2000204]201TTACAACGCTAAGGCCGGAC TGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGATGTA2500205]251GAGCTAAGAGAAACAACTTC AAGTCTGCTGAGGACTGTATGAGAACCTGT3000206]301GGTGGTGCTTGAGCGGCCGC3200207](IO)SEQ ID NO 13的资料0208]⑴序列特征0209]a.长度60个氨基酸0210]b.类型氨基酸0211]C.链型单链0212]d.拓扑学未知
(ii).分子类型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO 131 GGRPDFCLEP PYTGPCKARI IRYFYNAKAG LCQTFVYGGC RAKRNNFKSA 50DCMRTCGGA
权利要求
一种用甲醇酵母制备抑肽酶衍生物等的新方法，其特征在于包括以下步骤1)合成抑肽酶衍生物融合蛋白的cDNA；2)将所述cDNA在甲醇酵母中的分泌表达；3)分离纯化抑肽酶衍生物融合蛋白；4)用酶或化学物质裂解融合蛋白及抑肽酶衍生物的纯化。
2.根据权利要求1涉及的抑肽酶衍生物可以是人源的，也可以是牛源的。第52位氨 基酸可为其它任何氨基酸(包括lie、Leu和Glu等)或仍为Met。第15位氨基酸也可以 被其他任何氨基酸替换。也可以在N多出一个氨基酸如，Pro-aprotinin(SEQ ID NO 6)或 Gly-aprotinin(SEQ ID NO 9)等。
3.根据权利要求1涉及的抑肽酶衍生物等，不局限于抑肽酶衍生物，也可以是其它蛋 白，如表皮生长因子等。
4.根据权利要求1涉及的抑肽酶衍生物融合蛋白，是指抑肽酶衍生物N端融合一段多 肽和蛋白质。
5.根据权利要求4涉及的融合蛋白可在甲醇酵母表达系统高效表达，也包括其他表达 系统例如原核表达系统、真核表达系统、昆虫表达系统、植物表达系统和其他的酵母表达系 统。
6.根据权利要求4涉及的多肽或蛋白质可以是凝胶蛋白、水蛭素或血清白蛋白等可在 相应的系统高效表达的蛋白或它们的片段等。
7.根据权利要求4涉及的多肽或蛋白质的内部或两端可插入6XHis。
8.根据权利要求1获得的融合蛋白可用金属螯合层析的方法纯化。
9.根据权利要求4涉及的融合蛋白，在N端多肽或蛋白质和抑肽酶或其衍生物之间有 酶或化学物质的切割位点，切开后制备的抑肽酶或其衍生物的N端不会有新的氨基酸，与 天然抑肽酶的N端完全一致，如有新的氨基酸，但不影响其生物活性。
10.根据权利要求9涉及的切割方法可以是酶包括TEV酶、凝血酶和肠激酶等，也可以 是化学物质包括酸水解、溴化氰和Hydroxylamine等。
11.根据权利要求1制备的抑肽酶衍生物在多方面的药物中应用，如在外科用于止血、 抑制炎症，治疗休克；治疗胰腺炎、肺气肿和喘息性支气管哮喘，治疗急性关节炎，抗病毒和 恶性肿瘤等。
全文摘要
本发明涉及一种用甲醇酵母基因工程重组制备抑肽酶衍生物的新方法。运用此方法制备的抑肽酶衍生物纯度高、N端均一、具有天然抑肽酶的生物活性；运用此方法构建的甲醇酵母工程菌菌株上罐发酵时，抑肽酶衍生物以分泌的方式高效表达。
文档编号C12R1/645GK101880701SQ200910057189
公开日2010年11月10日 申请日期2009年5月6日 优先权日2009年5月6日
发明者曹之舫, 林斌辉, 潘长工, 肖建国, 阮振兴, 陈长华, 黄秀东 申请人:肖建国