专利名称：：一种串联表达小干扰rna重组慢病毒载体的构建方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学领域。更具体地涉及一种串联表达小干扰RNA重组慢病毒载体的构建方法。-
背景技术：
：RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指由双链RNA触发的序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)的过程。目前，RNA干扰的机制已基本阐明内源或外源的双链RNA在细胞质中被Dicer切割成带2个碱基突出3，末端的21~23nt的小干扰RNA(siRNA),后者与RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)结合。siRNA在RISC中被解链，其中反义链引导RISC靶向与之互补的mRNA，RISC则在互补序列中间切割mRNA,从而抑制靶基因的表达。尽管从RNAi现象发现至今仅11年时间，但RNAi作为一种基因沉默工具已广泛应用于生物学基础研究及应用领域。目前较为常用的5种制备siRNA的方法包括1)化学合成；2)体外转录；3)长片断dsRNAs经RNaseIII酶降解；4)PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达；5)siRNA表达载体在细胞中表达siRNA。以上方法都有各自的优缺点前4种方法制备的siRNAs或siRNA表达框经转染或电转导入细胞，可以实现瞬时基因沉默，对于半衰期较长的蛋白则不太适用。siRNA表达载体则可以利用载体上的抗生素标记建立相对稳定的长期基因沉默细胞抹，持续抑制靶基因的表达。多数的siRNA表达载体利用III型RNA聚合酶启动子操纵siRNA在哺乳动物细胞中表达，而通常采用的III型启动子包括人源和鼠源U6启动子和人源H1启动子。目前，很多生物公司已经研发出基于U6或H1启动子的siRNA表达载体，具代表性的产品包括Ambion公司的pSilencer系列；Promega7A司的siLentGene系列；lnvitrogen7>司的BLOCK-iT系列，等。siRNA表达载体可以分为质粒载体和病毒载体两类。对于某些难转染的细胞质粒载体存在转染效率低的缺点，于是近年来许多生物公司开始研发病毒载体表达siRNA，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的不便。目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体。其中慢病毒载体有诸如能感染分裂和非分裂期细胞,能整合于宿主基因组等优点而被越来越广泛的应用。具代表性的siRNA慢病毒载体如pLentiLox3.7,该载体含有一个由鼠源U6启动子来操纵siRNA表达。然而，目前已经研发出的基于III型启动子的siRNA慢病毒表达载体只适合于单一耙点的siRNA的表达，而越来越多的基础研究和应用研究需要同时沉默多个把基因，为了解决这一问题，本发明设计出了一种串联表达siRNA的慢病毒载体的构建方法，适用于长期沉默多个把基因的实验研究及应用研究。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种串联表达siRNA重组慢病毒载体的构建方法，克服了现有的siRNA表达载体只适用于表达单一靶点的siRNA的局限性，能同时表达针对多个靶基因的siRNA,且适合于稳定细胞系的建立，从而适用于长期沉默多个靶基因的实验研究及应用研究。该串联表达siRNA重组慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤1、慢病毒载体的启动子改造申请人改造的慢病毒载体是pLentiLox3.7(RubinsonandDillon,NatureGenetics,2003)。该载体含有一个鼠源U6启动子用来控制siRNA的表达。为了避免串联siRNA的启动子单一而引起同源重组导致siRNA表达框的丟失，申请人将该载体的鼠源U6启动子分别置换为人源U6启动子和人源H1启动子，改造后的慢病毒载体分别命名为pLLU6、pLLH1(￡sc/7er/c/7/'aco//Stbl3/pLLU6CCTCCM209135;￡sc/7eA7'c//aco〃Stbl3/pLLH1CCTCCM209136,保藏日期2009年6月25日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学)2、串联表达siRNA重组慢病毒载体的构建方法2.1单靶点的siRNA重组慢病毒载体的构建2.1.1化学合成寡核苷酸链，格式如下有义链5'-(19N)-(TTCAAGAGA)-(N91)-TTTTTTC-3'反义链与有义链互补，且在5，端添加上TCGA以产生;(77o1粘性突出末端注19N表示siRNA靶点的19个碱基序列，N19表示19N的反向互补序列；2.1.2有义链、反义链退火,形成带X/o1粘性末端和平末端的片4殳；2.1.3将以上片段连接至载体pLLU6或pLLH1(载体由KspA1和Xho1双酶切)；2.1.4转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞；2.1.5筛选阳性克隆，并测序鉴定；2.2双耙点的siRNA重組慢病毒载体的构建2.2.1利用PCR从单靶点的siRNA重组慢病毒载体中扩增"U6/H1-siRNA"表达框，并用Sa/1、X/o1双酶切使其带有Xho1粘性末端对于"U6-siRNA"表达框，PCR引物序列如下上游引物U6-siR-1(5'-TAACGCGTCGACCCCCAGTGGAAAGACGCGCA-3，)Sa/1下游引物U6-siR-2(5'-ATACCGCTCGAGCTCGTGAAGCGAGCTTATCGATACC隱3')1对于"H1-siRNA"表达框，PCR引物序列如下上游引物H1-siR-1(5'-TAACGCGTCGACAATTCATATTTGCATGTCGC-3')Sa/1下游引物H1-siR-2(5'-ATACCGCTCGAGCTCGTGAAGCGAGCTTATCGATACC-3，)12.2.2将"U6/H1-siRNA"表达框连接至经乂/7ol酶切的单靶点的siRNA重组慢病毒载体，并转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆；2.2.3酶切鉴定筛选"片段正向插入"的克隆由于"U6/H1-siRNA"表达框片段的插入存在正反两个方向的可能，为了适合串联siRNA重组慢病毒载体的构建及筛选鉴定，该步骤只挑选正向插入的克隆。具体鉴定方法是用Xiba1、X/o1双酶切待测克隆，设未插入片段的载体为对照，如果酶切片段大小大于对照，则为"正向插入"；如果酶切片段大小与对照相同，则为"反向插入"；2.2.4测序鉴定2.3多乾点的串联siRNA重组慢病毒载体的构建将"U6/H1-siRNA"表达框插入至双靶点的siRNA重组慢病毒载体，即构建出三靶点的siRNA重组慢病毒载体，以此构建策略，可获得多靶点串联的siRNA重组慢病毒载体。在一组干扰艾滋病毒的应用实例中，申请人构建了针对3个耙点的串联siRNA重组慢病毒载体，实验结果证实该慢病毒载体能正常工作，且串联的siRNA表达框是独立工作的(参见实施例3)。本发明的有益效果是(1)本发明所提供的串联表达siRNA的慢病毒载体适用于同时沉默多个靶基因，适合于有如此需求的基础研究和应用研究，比如在艾滋病治疗领域，用siRNA同时靶向多个病毒基因或靶向同一病毒基因的不同把点，可以有效防止或延緩病毒逃逸；(2)本发明适合于稳定细胞系的建立，^v而可以长期稳定地沉默靶基因；(3)易于实现siRNA表达框定向插入；(4)本发明提供的串联表达siRNA的慢病毒载体提供U6、H1两种启动子供选择，在一定程度上能避免了因同一种启动子的多次重复而引起的同源重组导致siRNA表达框的丢失。图1是慢病毒载体的启动子改造示意图。用来自pSilencer质粒的人源U6和人源H1启动子分别取代pLentiLox3.7上的鼠源U6启动子，获得pLLU6、pLLH1载体。图2是串联表达小干扰RNA重组慢病毒载体的构建流程图。首先，通过KspA1和Xho1酶切位点将化学合成的编码siRNA的寡核脊酸片段连接至pLLU6、pLLH1载体，获得单靶点的siRNA重组慢病毒载体；然后，PCR扩增"U6/H1-siRNA"表达框，连接至Xho1酶切的单把点的siRNA重组慢病毒载体，从而获得双靶点的siRNA重组慢病毒载体；最后，依此策略构建出串联表达siRNA的重组慢病毒载体。图3是串联表达小干扰RNA的慢病毒载体应用实例。该实例选取艾滋病毒基因rev、pol、tat以及病毒侵染细胞所需的宿主细胞膜蛋白CCR5作为乾点，构建出单輩巴点、双靶点、三靶点的siRNA重组慢病毒载体。该实例结果表明本发明提供的串联表达小千扰RNA的慢病毒载体能正常工作，且串联的siRNA表达框是独立工作的。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。实施例1:慢病毒载体的启动子改造申请人改造的慢病毒载体是pLentiLox3.7(RubinsonandDillon,NatureGenetics,2003)。该载体含有一个鼠源U6启动子用来控制siRNA的表达,同时还含有报告基因EGFP便于流式细胞仪分选。为了避免串联siRNA的启动子单一而引起同源重组导致siRNA表达框的丢失，申请人将该载体的鼠源U6启动子分别置换为人源U6启动子和人源H1启动子(人源U6启动子和人源H1启动子从Ambion公司产品pSilencer2.0JJ6和pSilencer3.0—H1经PCR获得)，改造后的慢病毒载体分别命名为pLLU6、pLLH1(Esc/er/c/7/aco//Stbl3/pLLU6CCTCCM209135;Esc/7eAVc/7/aco〃Stbl3/pLLH1CCTCCM209136)。启动子改造示意图见图1所示。具体改造过程如下1.1PCR扩增U6及H1启动子片段；对于U6启动子，PCR引物如下上游引物U6-1(5'-ACATCTAGACCCCAGTGGAAAGACGCGCAG-3'、幼a1下游引物U6-2(5'-ACGGTTAACGATCCCGCGTCCTTTCCACAA誦3')对于H1启动子，PCR引物如下上游引物H1-1(5'-CGGTCTAGAAATTCATATTTGCATGTCGCTA-3，)1下游引物H1-2(5'-AGCGTTAACCGAGTGGTCTCATACAGAACTT-3')1.2用T-A克隆策略将以上启动子片段克隆到pEGM-T载体(购自Promega公司)；1.3用；0ba1和KspA1双酶切以上重组pEGM-T载体，分离出带粘性末端的U6/H1启动子片段；1.4用Xba1和KspA1双酶切pLentiLox3.7,获得带相应粘性末端的载体；1.5将U6/H1启动子片段连接到以上载体，获得启动子改造的慢病毒载体，分别命名为pLLU6、pLLH1(Escher/cWaco//Stbl3/pLLU6CCTCCM209135;Esc/e〃'c//aco//Stbl3/pLLH1CCTCCM209136)。实施例2:串联表达siRNA重组慢病毒栽体的构建方法2.1单靶点的siRNA重組慢病毒载体的构建(参见图2步骤I)2.1.1化学合成寡核脊酸链，格式如下有义链5'-(19N)-(TTCAAGAGA)-(N91)-TTTTTTC-3'反义链与有义链互补，且在5，端添加上TCGA以产生X/7o1粘性突出末端注1)19N表示siRNA靶点的19个碱基序列，N19表示19N的反向互补序列；2)(TCAAGAGA)指导生成siRNA前体shRNA(小发夹RNA)的"环"区域，该序歹'J选自(Brummelkampef3/.,Science,2002)2.1.2有义链、反义链退火,形成带X/k)1粘性末端和平末端的片段；2.1.3将以上片段连接至载体pLLU6或pLLH1(载体由KspA1和乂/o1双酶切)；2.1.4转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞(Stbl3菌抹购自lnvitrogen公司)；2.1.5筛选阳性克隆，并测序鉴定；2.2双扭点的siRNA重組慢病毒载体的构建(参见图2步骤n)2.2.1利用PCR从单靶点的siRNA重组慢病毒载体中扩增"U6/H1-siRNA"表达框，并用Sa/1、X/o1双酶切使其带有;0o1粘性末端对于"U6-siRNA"表达框，PCR引物序列如下上游引物U6-siR-1(5'-TAACGCGTCGACCCCCAGTGGAAAGACGCGCA隱3')Sa/1下游引物U6-siR-2(5'-ATACCGCTCGAGCTCGTGAAGCGAGCTTATCGATACC-3，)对于"H1-siRNA"表达框，PCR引物序列如下上游引物H1-siR-1(5'-TAACGCGTCGACAATTCATATTTGCATGTCGC-3')Sa/1下游引物H1-siR-2(5'陽ATACCGCTCGAGCTCGTGAAGCGAGCTTATCGATACC-3，)馬12.2.2将"U6/H1-siRNA"表达框连接至经X/70l酶切的单靶点的siRNA重组慢病毒载体，并转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆；2.2.3酶切鉴定筛选"片段正向插入"的克隆由于"U6/H1-siRNA"表达框片段的插入存在正反两个方向的可能(以图2步骤II所示连接方向为正向)，为了适合串联siRNA重组慢病毒载体的构建及筛选鉴定，该步骤只挑选正向插入的克隆。具体鉴定方法是用Xfoa1、X/jo1双酵切待测克隆，设未插入片段的载体为对照，如果酶切片段大小大于对照，则为"正向插入"；如果酶切片段大小与对照相同，则为"反向插入"；2.2.4测序鉴定顶'J序引物5'-CAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGAC-3'(RubinsonandD卩lon，NatureGenetics,2003);2.3多靶点的串联siRNA重组慢病毒载体的构建(参见图2步骤III)将"U6/H1-siRNA"表达框插入至双革巴点的siRNA重组慢病毒载体，即构建出三把点的siRNA重组慢病毒载体，以此构建策略，可获得多乾点串联的siRNA重组慢病毒载体。实施例3:串联表达siRNA的慢病毒载体应用实例为了验证串联表达siRNA的慢病毒载体是否能正常工作，申请人以干扰艾滋病毒的应用实例加以i兑明在此实施例中，申请人选取艾滋病毒基因rev、pol、tat以及病毒侵染细胞所需的宿主细胞膜蛋白CCR5作为輩巴点，利用本发明所提供的串联表达siRNA的慢病毒载体构建出单耙点、双靶点、三靶点的siRNA重组慢病毒载体。siRNA表达框组合方式如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>申请人将以上siRNA重组慢病毒载体分别与pNL4-3丄uc.R-E-(LandauNRViology，1995)共转染HEK-293T细胞，24小时后检测相对荧光素酶活性，结果如图3(A)所示(注pNL4-3丄uc.R-E-是带荧光素酶报告基因的HIV复制子,其复制水平可以由荧光素酶活性代表)。结果表明各siRNA重组慢病毒载体对HIV的复制都有不同程度的抑制作用，其中rev-pol、rev-tat、pol-tatsiRNA的组合的效果高于其各自单独发挥的作用，说明rev、pol、tatsJRNA表达框能独立工作，且当两两组合后作用效果具有叠加效应。具体结果分析数据如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(注CCR5siRNA表达框在上述实验中不发挥作用，因为所用的HEK-293T细胞不表达CCR5膜蛋白，且pNL4-3丄uc.R-E-为脂质体转染进入细胞，无需膜受体CCR5介导)为了验证CCR5siRNA表达框的能否独立工作，申请人利用所构建的siRNA重组慢病毒载体pLLH1CCR5及pLLH1CCR5—U6rev_U6tat建立了基于GhostCD4/CCR5的稳定细胞系(KewalRamaniVandLittmanDR，JViral,1999)(该细胞系可以稳定表达膜蛋白CCR5)。然后用PE标记的CCR5抗体(购自eBioscience公司)对以上建立的稳定细胞系进行了流式检测(结果如图3(B)所示，灰色区域为样品，空心区域为阴性对照)。结果显示由pLLH1CCR5和pLLH1CCR5—U6rev—U6tat表达的CCR5siRNA均能有效下调CCR5表达水平，且二者无明显差异(分别下调77.5%和79.9%)，从而说明串联表达的siRNA重组慢病毒载体中的CCR5siRNA表达框的能独立工作。综上所述，本实施例涉及的应用实例说明本发明提供的串联表达siRNA的慢病毒载体能正常工作，且串联的siRNA表达框是独立工作的。实施例4:串联表达siRNA的慢病毒的包装。4.1转染前24小时铺HEK-293T细胞(购自CCTCC)于一个直径7.5cm的细胞培养皿中；4.2转染时细胞汇合度以40-60。/。为宜，以标准的磷酸钙转染操作将以下质粒共转染细胞4mgsiRNA重组慢病毒载体2ygpLP22pgpVSVG(注pLP1、pLP2、pVSVG是慢病毒辅助包装质粒，购自lnvitrogen公司)；4.3转染后24小时、48小时、72小时分别收集病毒上清(即细胞培养基)，并补足培养基；之后混合3次收集的病毒上清；4.4病毒滴度检测将病毒上清以10倍梯度稀释，分别感染HEK-293T细胞(培养基中加polybrene(购自SIGMA公司)，终浓度为8jLig/ml),48小时之后流式检测GFP阳性细胞比率，并以比率在0.1-10%之间的稀释度计算出病毒滴度。实施例5:利用串联表达siRNA的慢病毒建立稳定细胞系。5.1用实施例4中所包装的慢病毒以梯度m.o丄感染GhostCD4/CCR5细胞，感染48小时后流式检测GFP阳性细胞比率，择其比率10%以下者进行无菌流式分选(注之所以选择比率10%以下者，是为了避免细胞被慢病毒复感染而影响后续实验的准确性)；5.2传代培养分选的细胞至细胞^t量适宜；5.3再次流式检测GFP阳性细胞比率，以确定稳定细胞系的纯度。SEQUENCELISTING〈110>武汉大学<120〉一种串联表达小干扰RNA重组慢病毒载体的构建方法<130>—种串联表达小干扰RNA重组慢病毒载体的构建方法<140>2009100628503<141〉2009-06-26<160>9〈170>Patentlnversion3.1<210>1〈211>32〈212〉腿<213>化学合成<400>1taacg'cgtcgacccccagtggaaagacgcgca32<210>2<211>37<212>DNA<213>化学合成<400>2ataccg'ctcgagctcgtgaagcgagcttatcgatacc37<210〉3<211>32<212>DNA〈213>化学合成<400>3taacgcgtcgacaattcatatttgcatgtcgc32〈210>4〈211>37<212>DNA<213>化学合成<400>4ataccg'ctcgagctcgtgaagcgagcttatcgatacc37<210〉5<211>30<212〉DNA〈213>化学合成〈400>5acatctagaccccagtggaaagacgcgcag30<210>6〈211〉30<212>DNA〈213>化学合成<400>6acg'gttaacgatcccgcgtcctttccacaa30<210>7<211>31<212>■<213>化学合成〈400>7cggtctagaaattcatatttgcatgtcgcta31<210>8〈211>31<212>腿〈213>化学合成<400〉8agcgttaaccgagtggtctcatacagaactt31<210>9〈211>25<212>DNA<213>化学合成〈400>9cag'tgcag'gggaaagaatagtagac2权利要求1、一种改造的慢病毒载体pLLU6，其特征在于EscherichiacoliStbl3/pLLU6CCTCCM209135。2、一种改造的慢病毒载体pLLH1，其特征在于Esc/er/c//'aco//Stbl3/pLLH1CCTCCM209136。3、一种串联表达siRNA重组慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤(1)单耙点的siRNA重组慢病毒载体的构建a、化学合成寡核香酸链，格式如下有义链5'-(19NHTTCAAGAGAHN91)-TTTTTTC-3'反义链与有义链互补，在5，端添加上TCGA以产生X/o1粘性突出末端；b、有义链、反义链退火，形成带;(77o1粘性末端和平末端的片段；c、将以上片段连接至载体pLLU6或pLLH1;d、转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞；e、筛选阳性克隆，并测序鉴定；(2)双把点的siRNA重组慢病毒载体的构建a、利用PCR从单耙点的siRNA重组慢病毒载体中扩增U6/H1-siRNA表达框，并用Sa/1、X/o1双酶切使其带有X/701粘性末端对于U6-siRNA表达框，PCR引物序列如下上游引物U6-siR-1(5'-TAACGCGTCGACCCCCAGTGGAAAGACGCGCA-3')Sa/1下游引物U6-siR-2(5'陽ATACCGCTCGAGCTCGTGAAGCGAGCTTATCGATACC-3，)对于H1-siRNA表达框，PCR引物序列如下上游引物H1-siR-1(5'-TAACGCGTCGACAATTCATATTTGCATGTCGC-3')Sa/1下游引物H1-SiR-2(5'-ATACCGCTCGAGCTCGTGAAGCGAGCTTATCGATACC陽3')1b、将U6/H1-siRNA表达框连接至经Xhol酶切的单靶点的siRNA重组慢病毒载体，并转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆；c、酶切鉴定筛选片段正向插入的克隆，该步骤只挑选正向插入的克隆，具体鉴定方法是用Xba1、X/o1双酶切待测克隆，设未插入片段的载体为对照，酶切片段大小大于对照，为正向插入，酶切片段大小与对照相同，为反向插入；d、测序鉴定；(3)多靶点的串联siRNA重组慢病毒载体的构建将U6/H1-siRNA表达框插入至双乾点的siRNA重组慢病毒载体，即构建出三草巴点的siRNA重组慢病毒载体，以此构建策略，可获得多輩巴点串联的siRNA重组慢病毒载体。全文摘要本发明公开了一种串联表达siRNA重组慢病毒载体的构建方法，主要步骤如下(1)单靶点的siRNA重组慢病毒载体的构建a.化学合成寡核苷酸链；b.有义链、反义链退火；c.退火片段连接至载体(2)双靶点的siRNA重组慢病毒载体的构建a.利用PCR从单靶点的siRNA重组慢病毒载体中扩增U6/H1-siRNA表达框；b.将表达框连接至经XhoI酶切的单靶点的siRNA重组慢病毒载体；c.酶切鉴定筛选表达框正向插入的克隆；(3)多靶点的串联siRNA重组慢病毒载体的构建将U6/H1-siRNA表达框插入至双靶点的siRNA重组慢病毒载体，构建出三靶点的siRNA重组慢病毒载体，同法可获得多靶点串联的siRNA重组慢病毒载体。本发明适用于同时表达针对多个靶基因的siRNA，适用于长期沉默多个靶基因的研究。文档编号C12N15/867GK101684478SQ200910062850公开日2010年3月31日申请日期2009年6月26日优先权日2009年6月26日发明者叶柳,申彦森,郭德银,宇陈申请人:武汉大学