一种真菌抗肿瘤多肽核苷酸序列及制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种真菌抗肿瘤多肽核苷酸序列及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，本发明涉及真菌杨树菇 (Agrocybeaegerita)小类泛素修饰因子基因序列。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多 肽的其制备方法，同时还涉及多肽在医药、抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
杨树菇(Agrocybe aegerita)隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田蘑 属。又名柱状田头菇、杨树菇、茶薪菇、柳松茸等。富含人体必需的八种氨基酸，其中赖氨酸 高达1. 75%，其营养价值超过香菇、金针菇等其他食用菌，同时又具有独特的药用价值，民 间常用于抗癌、降压，治疗胃冷、肾炎、水肿等有独特疗效，有"中华神菇"之美誉，但其中 的药理成分并不明确，本发明中涉及的杨树菇小类泛素修饰因子是我们首次发现的重要药 理成分。泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)是细胞内蛋白质选 择性降解的重要途径，UPP通路包括泛素、泛素激活酶(Ub-activating enzyme, El)、泛素 结合酶(Ub-conjugating enzymes, E2)、泛素连接酶(Ub-proteinligases, E3)、蛋白酶体 (proteasome)复合体等。2004年诺贝尔化学奖授予了在“泛素介导的蛋白质降解过程研 究”中做出开创性贡献的三位科学家。小类泛素修饰因子(small ubiquitin like modifie，SUMO)是继泛素之后具有这 种修饰功能的又一种小多肽。SUMO是在动物中首次发现的。Matimis等(1996)分析动物 细胞中核孔复合体组分之一 RanGAP进行氨基酸序列时，发现其具有2个N末端和1个C末 端，这表明RanGAP含有一个通过异肽键相互作用的肽链，这个肽链因其与泛素的大小、空 间结构及其与蛋白质的连接方式相似，因此命名为小类泛素修饰因子。SUMO是约100个氨 基酸残基组成的多肽，与泛素的序列只有8%-15%的相似性，但它们的三级结构却非常相 似(Bayer等1998)，它可逆地结合到靶蛋白上，结合过程称为SUMO化(Sumoylation)，逆过 程称为脱SUMO化(desumoylation)。与泛素明显不同的是泛素化过程是不可逆的，且常常 是多泛素化，泛素化和多泛素化的结果是靶蛋白进入蛋白酶体(proteasomes)后被分解， 而SUMO化则不能造成靶蛋白的分解，主要是改变靶蛋白的活性性、定位或抵抗泛素介导的 蛋白质降解的能力。可见SUMO和泛素的作用有质的不同。动物中的资料表明，底物的SUMO 化和脱SUMO化参与调节多种关键的生命过程，诸如自身免疫、染色体分离和细胞分裂、DNA 的修复、细胞核与细胞质间的物质运输、转录的调节、泛素介导的蛋白质降解等(Hay2005)。SUMO化修饰绝大多数发生在核内。其作用的底物没有泛素化广泛，但都是一些重 要的细胞调节蛋白。除RanGAPl外，SUMO作用的靶蛋白大多位于核内。其底物有核内运 输功能因子RanGAPl，SUMO化后可介导与RanBP2的相互作用；肿瘤抑制物PML，SUMO化后 形成核体并募集DaXX/p53等蛋白进入核体；肿瘤抑制物p53，SUMO化后p53活性被激活并 导致凋亡；转录激活因子c-Jun，SUMO化后c-Jun的转录活性被下调；转录因子NF-κ B的 抑制物I κ B α，SUMO化后抑制I κ B α的泛素化从而阻止NF- κ B的活化；ρ53泛素连接酶
3E3 (Mdm2)，SUMO化后抑制Mdm2的泛素化，激活Mdm2的E3活性。本发明中提供一种真菌来源的小类泛素修饰因子，具有诱导肿瘤细胞凋亡的活 性。

发明内容
本发明的目的是在于提供了一种真菌抗肿瘤多肽核苷酸序列，该序列能编码上述 杨树菇小类泛素修饰因子多肽序列。本发明的另一个目的是在于提供了一种真菌小类泛素修饰因子活性的多肽(SEQ ID NO. 2)所示的氨基酸序列，该多肽具有多种抗肿瘤活性，在医药上具有广泛的应用价值。 该小类泛素修饰因子是报道的杨树菇中第一个具有抗肿瘤活性的小类泛素修饰因子。本发明的再一个目的是在于提供了一种真菌抗肿瘤多肽核苷酸序列的制备方法， 该方法是构建原核表达载体，利用亲和层析方法纯化杨树菇小类泛素修饰因子，该方法简 便，成本低廉。本发明还涉及一种真菌小类泛素修饰因子活性的多肽(SEQ ID NO. 2)的氨基酸序 列在作为制备治疗或预防宫颈癌、胃癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤疾病药 物中的应用。它可以抑制多种肿瘤细胞的生长，杀死肿瘤细胞，对肿瘤细胞的抑制作用优于 或类似于临床应用的化疗药物阿霉素效果，该小类泛素修饰因子有开发成抗肿瘤药物的潜 力。为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施本发明的一个目的是提供一种新的核苷酸序列，该序列编码一种新的杨树菇小类 泛素修饰因子。在本发明中，真菌杨树菇小类泛素修饰因子的cDNA核苷酸序列是以杨树菇 总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR方法得到的。具体方法如下杨树菇菌种为福建省三 明真菌研究所提供的栽培种Ag21(食用菌学报，1999，6 (3) 1_7，取杨树菇的新鲜菌丝或子 实体，提取总RNA或mRNA为模板(市售的提取RNA和mRNA试剂盒，如Clontech，Promega， Stratagene等公司产品，按照说明书操作)，合成逆转录引物5’gac cac gcg tat cga tgt cga ctl6(a/c/g)3，，进行逆转录得到cDNA第一链。根据杨树菇小类泛素修饰因子cDNA序 列，设计弓I物5，atgtctgacaccgagcaaaaccag 3，为正向弓|物，以 5，gac cac gcg tat cgatgt cga c3’为反向引物，以上述cDNA第一链为模板，进行PCR，获得500bp的目的片段，将此片 段克隆测序，一种分离的编码真菌小类泛素修饰因子的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO. 1 所示核苷酸序列。该序列与SEQ ID NO. 1中1_309位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述 的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO. 1中1-309位的核苷酸序列杂交。70%的 同源基因可以通过突变试剂盒进行突变，或者通过插入，缺失等基因操作获得。较佳地至少 80%，更佳地至少90%的核苷酸序列，最佳地，该序列具有SEQ ID NO. 1中1-309位核苷酸 序列编码具有SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列。该序列是首次克隆，根据该序列可以设计 引物，通过PCR或RT-PCR的方法大量扩增该核苷酸序列，连接于表达载体，生产杨树菇小类 泛素修饰因子。本发明所要求保护的与上述cDNA序列至少有70%的同源性的基因可以通 过插入，缺失、突变等基因操作获得。如可以在设计PCR引物时，在SEQ ID NO. 1提供的序 列基础上，可以任意进行插入，缺失和突变的引物合成，用该引物进行PCR，则可以得到至少有70%同源性的基因。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO. 2所示的氨 基酸序列。较佳地至少80 %，更佳地至少90 %的核苷酸序列，最佳地，该序列具有SEQ ID NO. 1中1-309位的核苷酸序列。根据SEQ ID NO. 1 1_309位的核苷酸序列，设计引物，引物 通常为包含1-20位核苷酸序列，和与289-309位互补的核苷酸序列，通过PCR或RT-PCR的 方法大量扩增该核苷酸序列。本发明的杨树菇小类泛素修饰因子活性的多肽可用如下方法制备。该方法包括 以下具体的操作按照常规实验条件，如《分子克隆实验手册》(第三版)J.萨姆布鲁克等 编著，2003，北京科学出版社中所述的条件进行。一种杨树菇小类泛素修饰因子多肽的制备方法，它包括下列步骤1)提取杨树菇的总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA第一链，以此链为 PCR模板，扩增得到一种分离的编码真菌小类泛素修饰因子的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列。2)酶切步骤1得到的序列和原核表达载体，构建重组表达载体，获得与cDNA至少 有70%同源性的基因序列在SEQ ID NO. 1的1-309序列基础上，根据需要，以其中的任意 一段序列(一般为20-40bp，也可以长达IOObp)为PCR引物，有目的的在引物合成时引入碱 基的插入，缺失和突变，用该引物与SEQ ID NO. 1中设计酶切位点的两端序列(1-20序列， 或289-309互补序列)为一对引物，进行PCR扩增可以在原序列中有目的的引入碱基的插 入，缺失和突变，得到与cDNA至少有70 %同源性的基因序列，获得重组表达载体转化大肠 杆菌宿主细胞。3)将步骤2中得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，形成表达杨树菇小类 泛素修饰因子的重组细胞，酶切原核表达载体pET28b(市售，Novagen公司，也可以用市售 的其他的各种原核、或真核表达载体)，连接酶切后的cDNA序列和表达载体pET28b，构建重 组表达载体PET28-杨树菇小类泛素修饰因子；4)将步骤3中得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞BL21 (市售，Novagen 公司，可以根据所用的表达载体选择匹配的宿主细胞)，形成表达杨树菇小类泛素修饰因子 的重组细胞；5)将步骤4中得到的重组细胞在37°C培养过夜获得饱和培养物；将50μ L饱和培 养物接种于5mL含氨苄青霉素100 μ g/mL的培养基中，于37°C培养2小时。取ImL培养物 转移至微量离心管中。加异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度为lmmol/L，对培养物进行诱 导，诱导10小时。利用Ni2+亲和层析法纯化蛋白，分离，纯化步骤5中在重组细胞中诱导表达具有所 示的氨基酸序列的多肽。一种分离的多肽，其序列为SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。Blast的结果发现lO-l-d-12与海藻类Bigelowiella natans的小类泛素修饰因 子 small ubiquitin-like modifier 有着 52% 的相似性。(见实施例 1)纯度检测可以用SDS-PAGE方法检测。一种分离的多肽，其序列为SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列，其基本应用过程是 基本纯的该小类泛素修饰因子多肽或其变异形式可以单独、或以不同的比例加入其他抗肿 瘤药物形成口服的、静脉注射或瘤内注射的抗肿瘤药物。本发明要求保护的杨树菇小类泛 素修饰因子活性的多肽可以抑制宫颈癌、胃癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌肿瘤细胞的
5生长，杀死肿瘤细胞。在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA指，该DNA或片段已从天然状 态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分 分开，而且已经与细胞中伴随的蛋白质分开。在本发明中，术语“杨树菇小类泛素修饰因子(或多肽)编码序列”指编码具有杨 树菇小类泛素修饰因子活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中1-309位核苷酸序列 及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 1序列的编码框1-309位核苷酸中，有一 个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简 并性，所以与SEQ ID NO. 1中1-309位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码 出SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳地在高度严 谨条件下能与SEQ IDN0. 1中核苷酸1-309位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术 语还包括与SEQ ID NO. 1中从核苷酸1-309位核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少 80 %，更佳地至少90 %的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有杨树菇小类泛素修饰因子功能蛋白的SEQ ID NO. 1所示 的氨基酸序列中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个 (通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和 /或取代，以及在5 ’和/或3 ’端添加数个(通常以120个以内，较佳地为30个以内，更佳 地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。如实施例3中，构建的表达载体转录的核苷 酸序列在SEQ ID NO. 1核苷酸5’端缺失90个核苷酸，3’端缺失63个核苷酸，表达产物保 持原蛋白的85%抗肿瘤活性。在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20%，较佳地 至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90% (按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适 的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC方法测量多肽的纯度。在本发明中，术语“杨树菇小类泛素修饰因子多肽”指具有杨树菇小类泛素修饰因 子活性的SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列，该术语还包括具有与杨树菇小类泛素修饰因子 相同功能的、SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限 于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的 缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为40个以内，较 佳地为20个以内，更佳地为10个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的 氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个 或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括杨树菇小类泛素修饰因子的活 性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或 低的严谨度条件下能与杨树菇小类泛素修饰因子DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用 抗杨树菇小类泛素修饰因子多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽， 如包含杨树菇小类泛素修饰因子多肽的可溶性片段。通常，该片段具有杨树菇小类泛素修 饰因子多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50 个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。本发明还提供杨树菇小类泛素修饰因子或多肽的类似物。这些类似物与天然杨树菇小类泛素修饰因子多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰 形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以 通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法 或其他分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基 酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应 理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化，如那些在多肽的合成和加工中和进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生 的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖 基化酶)而完成。修饰形式还包括磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏 氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。本发明还包括杨树菇小类泛素修饰因子多肽编码序列的反义序列。这种反义序列 可以用于抑制细胞内杨树菇小类泛素修饰因子的表达。本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有杨树菇小类泛素修饰 因子多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是 否存在编码杨树菇小类泛素修饰因子的核酸分子。本发明还包括检测杨树菇小类泛素修饰因子核苷酸序列的方法，它包括用上述的 探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳地，该样品是PCR扩增后的产 物，其中PCR扩增引物对应于杨树菇小类泛素修饰因子多肽的编码序列，并可位于该编码 序列的两侧或中间，弓丨物长度一般为20-50个核苷酸。另一方面，本发明还包括对杨树菇小类泛素修饰因子或是其片段编码的多肽具有 特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于 杨树菇小类泛素修饰因子基因产物或片段。较佳地，指那些能与杨树菇小类泛素修饰因子 基因产物或片段结合但不识别和结合与其他非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那 些能够结合并抑制杨树菇小类泛素修饰因子的分子，也包括那些并不影响杨树菇小类泛素 修饰因子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的杨树菇小类泛素修饰因子 基因产物结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片 段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传过程改造的单链Fv分子；或嵌合抗 体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化 的杨树菇小类泛素修饰因子基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多 克隆抗体的产生。与之相似的，表达杨树菇小类泛素修饰因子或其具有抗原性的片段的细 胞可用来免疫动物生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利 用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断杨树菇小类泛素修饰因子功能的抗体以及 不影响杨树菇小类泛素修饰因子功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用杨树菇小类泛素 修饰因子基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用 重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与杨树菇小类泛素修饰因子基因产物的未修饰形式 结合的抗体可以用原核细胞(如E.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆 虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。本发明的优点和效果本发明中提供的杨树菇小类泛素修饰因子核苷酸序列和蛋白质序列是一种新的 小类泛素修饰因子的基因和蛋白质序列，未见报道，尤其第一个从药用真菌中报道的小类 泛素修饰因子。到目前为止，已发现的小类泛素修饰因子都仅报道了在SUMO通路中的作用 等，没有报道抗肿瘤活性。因此，本发明的优点是“新”——本发明是一种新的，第一个报道 具有抗肿瘤活性的小类泛素修饰因子，可以应用在医药领域。本发明中涉及的杨树菇小类泛素修饰因子蛋白具有很强的抗肿瘤活性。在相同的 浓度下，对PC-3 (前列腺癌细胞)，Colo320 (直肠癌细胞)和H印G2 (肝癌细胞)细胞的抑 制效果优于临床使用的化疗药物阿霉素，在MCF-7(乳腺癌细胞)，SGC-7901(胃癌细胞)肿 瘤细胞中表现出与化疗药物阿霉素具有相似的抑制率，对HeLa (宫颈癌细胞)肿瘤细胞的 抑制率比化疗药物阿霉素的抑制率稍弱。对荷S180骨肉瘤的小鼠进行治疗，可以延长小鼠 的生存时间，对肿瘤生长的抑制率为35.6%。因此，该蛋白及其基因在开发抗肿瘤药物方面 将有很大的应用价值。


图1为一种pET28-杨树菇小类泛素修饰因子的构建示意图。图中SUMO为杨树菇 小类泛素修饰因子的基因，pGEM-SUMO为SUMO的保存质粒。首先设计含有Nco I和Xho I 酶切位点的上下游引物，以质粒pGEM-SUMO为模板，进行PCR，得到两端含有Nco I和Xho I 酶切位点的PCR产物，用Nco I和XhoI酶分别消化PCR产物和pET28b质粒，根据回收的量 进行连接反应，使SUMO插入pET28b的多克隆位点，完成pET28-杨树菇小类泛素修饰因子 (pET28b-SUM0)表达载体的构建。图2为一种SEQ ID NO. 2与海藻类Bigelowiella natans的小类泛素修饰因子 (small ubiquitin-like modifier)的氨基酸序列比对结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实 验条件，《分子克隆实验手册》(第三版)J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京科学出版社
中所述的条件进行，或按照制造厂商所建议的条件。编码杨树菇小类泛素修饰因子核苷酸序列的制备方法，杨树菇小类泛素修饰因子 多肽制备方法，杨树菇小类泛素修饰因子多肽截短体制备方法及活性实施例，抗体制备实 施例，抗肿瘤实施例。实施例1 杨树菇小类泛素修饰因子的cDNA克隆和测序本实施例中得到一新的cDNA序列， 是前人未报道过的。1.引物扩增以杨树菇总RNA为模板，用寡核苷酸A :5’ gac cac gcg tat cga tgt
8cga ctl6(a/c/g)3'为逆转录引物进行逆转录，得到cDNA的第一链，以寡核苷酸B 5' atgtctgacaccgagcaaaaccag 3' IE[n]iJIiItl ^M^Mi^tW. C 5' gac cac gcg tat cgatgt cgac3，为反向引物，进行PCR，PCR条件为95°C起始lOmin，进入三步循环(95°C lmin, 53°C lmin,72°C 2min共 30 个循环)，最后 72°C延伸 IOmin。20 μ L 反应体系包含1 μ g cDNA, 0. 2mM (1^ ，2(^]\1正向引物和反向引物，2口1^0\1311打61·，1 μ L Taq 酶禾口 1. 5mM MgCl20 PCR 产物为一 500bp目的片段。2、克隆测序根据该pGEM-T easy载体(Promega公司产品)的操作手册，将该扩增片段克隆到 pGEM-T easy载体上，构建质粒pGEM-杨树菇小类泛素修饰因子(pGEM_SUM0)，进行测序，共 500bp，一种分离的编码真菌小类泛素修饰因子的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO. 1所示 核苷酸序列。其中1-309为编码氨基酸序列的开放阅读框序列。根据得到的cDNA序列翻译出杨树菇小类泛素修饰因子的氨基酸序列，共103个氨 基酸残基，一种分离的多肽，其序列为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。3、序列比对如图2所示，Blast的结果发现SEQ ID NO. 2与海藻类Bigelowiella natans的小 类泛素修饰因子(small ubiquitin-like modifier)有着52%的相似性。申请人认为SEQ ID N0. 2多肽序列是一小类泛素修饰因子。实施例2 杨树菇小类泛素修饰因子在大肠杆菌中的表达、纯化本实施例中可以得到大量 表达、纯化的蛋白质样品。首先设计含有Nco I和Xho I酶切位点的上下游引物，以质粒pGEM-杨树菇小类 泛素修饰因子为模板，进行PCR，得到两端含有Nco I和Xho I酶切位点的PCR产物，用Nco I和Xho I酶分别消化PCR产物和pET28b质粒，回收杨树菇小类泛素修饰因子片段和目的 质粒，根据回收的量进行连接反应，构建原核表达载体pET28b-杨树菇小类泛素修饰因子 (pET28b-SUM0)，如图 1 所示。按照前述的原核表达方法，根据不同时间诱导表达重组杨树菇小类泛素修饰因子 的结果，选择优化时间，大量表达。利用Ni柱纯化重组杨树菇小类泛素修饰因子，表达量约 为 7mg/L。实施例3 杨树菇小类泛素修饰因子抗体的制备该实施例可以获得杨树菇小类泛素修饰因 子的多克隆抗体，用于检测杨树菇小类泛素修饰因子。将天然蛋白和实施例2中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如 下。重组蛋白用层析法进行分离后备用，也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条 带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’ s佐剂乳化。用50_100ug/0. 2mL乳化过的 蛋白，对小鼠进行皮下注射。14天后，用非完全Freund’ s佐剂乳化同样抗原，对小鼠以 50-100ug/0. 2mL的剂量进行皮下注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行 3次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外结合杨树菇小类泛素修饰因子基因翻译产 物的能力加以评估(Western方法)。实施例4
杨树菇小类泛素修饰因子对肿瘤细胞和荷瘤小鼠肿瘤组织的抑制作用本实施例 中杨树菇小类泛素修饰因子抑制检测的7种肿瘤细胞株，证实杨树菇小类泛素修饰因子具 有广普抗肿瘤作用；抑制荷S-180肉瘤小鼠的肿瘤组织生长，延长荷瘤小鼠的生存时间，证 实杨树菇小类泛素修饰因子对荷瘤动物的肿瘤组织有抑制生长作用。1.杨树菇小类泛素修饰因子在体外对肿瘤细胞株的抑制作用本实施例检测了杨 树菇小类泛素修饰因子对7种肿瘤细胞株(SW480，HeLa, SGC-7901, MGC80-3, BGC-823, HL-60and S-180)生长的抑制活性。所有的肿瘤细胞株在RPMI1640培养基(其中包含10% (V/V)的胎牛血清，lOOmg/mL链霉素和100U/mL的青霉素)中培养。将不同浓度的杨树菇小 类泛素修饰因子(以培养基配制成5，10，50，100ug/mL)加入肿瘤细胞中，温育24小时后， 用MTT方法检测杨树菇小类泛素修饰因子对肿瘤细胞生长的抑制作用。检测结果如表2中 所示。杨树菇小类泛素修饰因子对所检测的肿瘤细胞株有很好的抑制作用，在相同浓度下， 对PC-3，Colo320和H印G2细胞的抑制效果优于化疗药物阿霉素，对MCF-7，SGC-7901肿瘤 细胞中表现出与化疗药物阿霉素具有相似的抑制率，对HeLa肿瘤细胞的抑制率比化疗药 物阿霉素的抑制率稍弱。表2杨树菇小类泛素修饰因子(SUMO)在体外对肿瘤细胞的抑制作用 2.杨树菇小类泛素修饰因子对荷瘤小鼠肿瘤组织生长的抑制作用在本实施例中，采用BALB/c小鼠(7周，20克)，在腋窝皮下接种0. ImL小鼠骨肉 瘤细胞S-180(l. 18X108cellS/mL)，接种3天后，瘤内注射杨树菇小类泛素修饰因子(以 生理盐水溶解1. 67mg/mL,注射0. 06mL) 0. Img/只小鼠，对照注射生理盐水。此后，隔天注 射。在接种肿瘤20天后处死小鼠。切下肿瘤称重，计算抑制率。抑制率(％) = [(C-T)/ C] X 100% (C是对照组平均肿瘤重量，T为治疗组肿瘤的平均重量)。结果如表3所示。杨 树菇小类泛素修饰因子对处理的小鼠的肿瘤的抑制率可达35.6%，并且延长了荷瘤小鼠的 寿命ο表3杨树菇小类泛素修饰因子对荷S-180瘤小鼠肿瘤的抑制作用
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明分上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120> 一种真菌抗肿瘤多肽核苷酸序列及制备方法和应用<130> 一种真菌抗肿瘤多肽核苷酸序列及制备方法和应用<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>309<212>DNA<213>杨树菇小类泛素修饰因子cDNA序列<400>PreSequenceString atgtctgaca ccgagcaaaa ccagagccat gttgagccaaaccattaaca tcaaggtggt gagctcaact ggcgatgaagagtacgaagc tcagcaagct gcagggggcg tacgcgagcaagcattcgat ttttgtacga tgggacacgg ataagcgacggacatggacg acaacgatac tattgatgtc atggtagaacgtccc 309<210>2<211>103<212>DNA<213>杨树菇小类泛素修饰因子氨基酸序列<400>PreSequenceString msdteqnqsh vepkaedana tinikvvsst gdevffkikrsirflydgtr isdddtpqsl dmddndtidv mveqvgghlh
aggctgaggacgccaatgcc60ttttcttcaaaatcaagaga120aagtagggaaggacgttggg180atgacaccccacaatcgctc240aggttggagg : Cccatcttcat a300 t
stklsklqga yaskvgkdvg 60 vph10权利要求
一种分离的多肽，其序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.一种制备权利要求1所述的真菌抗肿瘤多肽核苷酸序列的方法，它包括下列步骤A、提取杨树菇的总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA第一链，以此链为PCR 模板，扩增得到序列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；B、酶切步骤A得到的序列和原核表达载体，构建重组表达载体；C、将步骤B中得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，形成表达杨树菇小类泛素 修饰因子的重组细胞；D、将步骤C中得到的重组细胞在37°C培养过夜获得饱和培养物，将50μ L饱和培养物 接种于5mL含氨苄青霉素100 μ g/mL的培养基中，于37°C培养2小时，取ImL培养物转移至 微量离心管中，加异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度为lmmol/L，对培养物进行诱导，诱导 10小时；E、利用Ni2+亲和层析法纯化蛋白，分离，纯化步骤D中在重组细胞中表达的多肽。
3.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防宫颈癌药物中的应用。
4.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防胃癌药物中的应用。
5.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防乳腺癌药物中的应用。
6.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防直肠癌药物中的应用。
7.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防前列腺癌药物中的应用。
8.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种真菌抗肿瘤多肽核苷酸序列的制备方法和应用。该分离多肽的编码序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步骤是，首先是提取杨树菇的总RNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA第一链为模板，通过PCR扩增，得到PCR产物；其次是酶切得到PCR产物和原核表达载体，构建重组表达载体；第三是将得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，得到表达杨树菇小类泛素修饰因子的重组细胞；第四是将得到的重组细胞诱导培养过夜获得饱和培养物；等五是利用Ni2+亲和层析法纯化蛋白，分离，纯化在重组细胞中表达的多肽。多肽作为制备治疗或预防肿瘤疾病药中的应用。涉及的蛋白质具有抗肿瘤活性。在开发抗肿瘤药物方面有很大的应用价值。
文档编号C12N15/70GK101928335SQ200910062859
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者刘洪洪, 姜帅, 孙慧, 栾荣, 梁一, 车涛, 陈义杰 申请人:武汉大学