专利名称：一种与植物配子发育相关基因的cDNA序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种克隆获得的与植物配子发育相关BKAPa基因的cDNA序列及其编 码的蛋白质序列，同时还涉及该基因在植物基因工程雄性不育系育种中的应用，属于生物 技术领域。
背景技术：
杂种优势是植物界中普遍存在的一种生物学现象，指的是遗传组成不同的亲本杂 交产生的F1代在生活力、生长势、适应性、抗逆性和丰产性等方面明显优于双亲的现象。利 用杂种优势可以大幅度提高作物产量，是现代农业科学技术的突出成就之一。油菜(Brassica napus L.)作为一种重要的油料作物，是食用植物油和植物蛋白 的主要来源，也是潜在的仅次于豆粕的大宗饲用蛋白源。同时，油菜也是生物柴油的理想原 料。与其它大田作物相比，油菜杂种优势强，增产效果显著，在油菜杂种优势利用的各种途 径中，雄性不育是其主要途径之一。植物雄性不育的来源有很多途径理论上，任何影响雄配子发育的因素都会产生 雄性不育，然而对于特定的作物而言，真正可以大面积应用的雄性不育类型却非常有限，有 些作物甚至由于不育系来源匮乏而造成产量低、品种遗传单一，给农业生产带来潜在的风 险。因此，开辟新的不育源、培育新型不育系已成为杂种优势利用的重点和主要目标之一。植物花粉发育过程涉及大量的基因表达，很明显这些花粉特异基因和启动子可以 在雄性不育的基因工程中应用。Mariani等将Barnase (—种RNase)基因与TA29 (烟草绒毡层特异表达的启动 子)构成嵌合基因(TA29-Barnase-bar)，并把它导入油菜，从而得到TA29-Barnase转基 因不育系。1992年，将Barnase (—种RNase)的抑制基因(Barstar基因)引入，而得到 TA29-Barstar-bar 转基因恢复系。TA29_Bamase_b￡ir 核不育系与 TA29-Barstar-bar 恢复 系配制的杂交种F1，全部恢复雄性可育。这个转基因雄性不育材料还具有抗除草剂的特性， 苗期喷施除草剂，可杀死核不育系繁殖、制种时母本行约50%的可育株，解决了用人工拔除 可育株的困难和问题。比利时PGS公司育成的这种转基因核不育杂种，已有5个(1996年 2个，1997年3个)在加拿大注册推广，1999年推广面积已达80万-100万hm2。印度已将 这种基因转入芥菜型油菜中，配制的10个杂交组合，比对照增产9. 9% -34. 52%。但这类 不育系在应用上的最大缺点是不育系和恢复系都是转基因产品，不仅进行遗传转化比较耗 时，而且在实际应用上，因转基因产品在很多国家还未被广泛接受，限制了其进一步推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从植物油菜中克隆得到的与植物配子发育相关基因 的cDNA序列。本发明的目的还在于提供一种该序列编码的多肽氨基酸序列。进一步，本发明的目的提供一种含序列表中序列1或序列2或序列1部分序列所构建的植物表达载体和RNAi载体。更进一步地讲，本发明的目的还在于提供一种该基因的应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种与植物配子发育相关基因的cDNA序列，它具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。所编码的序列表中序列1为来源于油菜的与配子发育相关的BKAPa基因或BKAPa 等同基因的序列。同时，本发明的技术方案还采用了一种cDNA序列，它编码的蛋白质具有序列表中 序列2所示的多肽氨基酸序列。所编码的序列表中序列2所示的多肽氨基酸序列的第12-29位含有由18个氨基 酸残基(RKKIYKTGVDADEARRRR)组成的核定位信号肽(NLS)。所编码的序列表中序列2所示的氨基酸多肽序列的第104-450位含有1个IBB结 构域,8个ARM重复单元(ARM repeat)和2个HEAT重复单元(HEATr印eat)。本发明的技术方案还采用了一种含序列表中序列1或序列2或序列1部分序列所 构建的植物表达载体和RNAi载体。进一步，本发明的技术方案为一种与植物配子发育相关的BKAPa基因的应用，将 含有所述基因正反向互补序列的RNAi载体转化油菜，培育出转基因的不育系；将转基因不 育系与其它能恢复其育性的正常可育系杂交，产生杂交种子。更进一步，本发明的技术方案为根据所述的基因序列及突变位点设计特异的 PCR引物，产生特异性的分子标记，用此标记鉴定核不育育性分离群体，进行分子标记辅助 选择，可以获得全不育群体用于杂种生产。本发明提供的基因BKAPa是从含有BKAPa等位基因的不育和可育系油菜中通过 RT-PCR方法分离获得的，其具有以下特征1、具有序列表中序列1的核苷酸序列，其中包括起始密码子ATG和终止密码子TGA 在内的共计1629个碱基的完整开放读码框(0RF)。不育系中克隆到的序列与序列表中序 列1的核苷酸序列有2个位点的突变差异，即在第175个碱基处，缺失了 2次简单重复序列 (CAG)共计6个碱基；在第693个碱基处，A碱基转换为T碱基。2、编码序列表中序列2所示的多肽氨基酸序列，该序列由542个氨基酸组成，具有 1个与KAPb蛋白结合的N-末端结构域(IBB)、8个ARM重复单位(ARM repeat)和2个HEAT 重复单位(HEAT repeat)组成的功能结构域，其生物学功能为植物配子发育所必需的元件。 不育系中的氨基酸序列与序列表中序列2的氨基酸序列有1个位点的突变差异，即在第59 个氨基酸处缺少了 2个谷氨酰胺(QQ)。根据本发明提供的BKAPa基因序列信息(序列1，序列2)，本领域技术人员可以 通过以下方法容易地获得与BKAPa等同的基因(1)通过数据库检索获得；(2)用BKAPa基 因片段为探针筛选油菜或其它植物的基因组或cDNA文库获得；(3)根据BKAPa基因序列信 息设计寡核苷酸引物(含兼并性引物)，用PCR扩增方法从油菜或其它植物的基因组获取； (4)在BKAPa基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得。本发明所述的术语BKAPa等同基因，是定义为与BKAPa基因的核苷酸序列或氨基 酸残基序列相比有一个或若干个核苷酸或氨基酸的差异，包括碱基或氨基酸残基的改变、 缺失、插入，或与BKAPa基因序列中的连续210碱基以上的区段有85%以上的相似性，且其表达产物的功能与BKAPa表达产物的功能相同的基因。因此，本发明提供的BKAPa基因还包括BKAPa等同基因，它们为下列核苷酸序列之一，或编码下列核苷酸多肽序列之一的核苷酸序列(1)将序列1的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加，且编码与 序列2同等功能蛋白质的衍生核苷酸序列；(2)与序列1中连续210碱基以上的区段有85%以上的相似性，且其表达产物的 功能与BKAPa表达产物的功能相同的核苷酸序列；(3)将序列2的氨基酸多肽序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加， 且编码与序列2同等功能蛋白质的衍生氨基酸多肽序列，或其保守性变异多肽，或其活性 片段。本发明所述的BKAPa基因或其等同基因，还包括含有这些基因全部序列或部分序 列的载体。本发明的BKAPa基因属于KAPa基因家族成员。KAPa基因对动物的配子发育具有 重要的作用，该家族基因部分成员的突变会引起果蝇、线虫等动物雄配子或雌配子不育，通 过转基因互补实验，又可使其育性恢复。本发明提供的BKAPa基因具有重要的应用价值。应用之一是将所述的BKAPa基因 用任何一种方法使其在油菜或其它植物中突变或沉默，可获得转基因雄性不育系，用转基 因雄性不育系与可使其育性恢复的植物杂交，可产生杂交种子用于生产。本发明提供的BKAPa基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的 分子标记，包括但不限于SNP (单核苷酸多态)、SSR(简单序列重复多态)、RFLP (限制性酶 切片段长度多态性)、CAP (切割扩增片段多态性)、SCAR(序列特征性区域扩增多态性)。用 此标记可鉴定油菜或其它植物的雄性不育系或非不育系植株的基因型。本发明采用了一种新的与配子发育密切相关的基因，为植物特别是油菜选育新型 不育系以及杂交育种提供有用的基因和分子标记。本发明的基因在油菜花蕾中高度表达， 并且该基因的cDNA序列和氨基酸序列在甘蓝型油菜正常野生型和细胞核雄性不育系之间 存在明显的突变差异，该基因的突变可能是导致雄性不育的根本原因，因此，该基因在创造 基因工程不育系方面具有极大的应用潜力。利用本发明克隆的基因可进行分子水平的育 种，与常规的杂交和回交育种方法相比，用转基因方法培育不育系可缩短育种时间，育成的 不育系不育性稳定彻底，无微粉产生。还可以同时导入其它有用基因，如抗病抗虫基因、优 良品质基因等，培育出优质抗病虫害的不育系。而且还可以通过转基因的方法培育相应的 恢复系用于杂种生产。另外，与常规的系谱选择育种方法相比，分子标记辅助选择育种可提 高育种选择效率。
图1为油菜BKAPa基因cDNA 5，端PCR扩增结果；其中，M为 DL2000(100、250、500、750、1000、2000bp)DNA 分子量标准；1 泳道是以
H2O模板的PCR扩增；2泳道是以等位可育油菜cDNA为模板的PCR扩增；3泳道是以不育油 菜cDNA为模板的PCR扩增。图2为油菜BKAPa基因cDNA 3，端PCR扩增结果；
其中，M为 DL2000(100、250、500、750、1000、2000bp)DNA 分子量标准；1 泳道是以
H2O模板的PCR扩增；2泳道是以等位可育油菜cDNA为模板的PCR扩增；3泳道是以不育油 菜cDNA为模板的PCR扩增；图3为BKAPa基因RNA干扰载体RNAi-BKAPa的构建；图 4 为 BKAPa 基因反义 RNA 载体 Antisense RNA-BKAPa 的构建；图5为转基因油菜植株灌浆期表型；CK为未转基因的正常可与油菜，角果发育正常；RANi和Anti-RNA为转 RNAi-BKAPa载体和Antisense RNA-BKAPa载体的油菜，转化单株的结实性很差或几乎不结实。图6为转基因油菜成熟期植株农艺性状比较；Mg23 (CK)和MDGMS (CK)分别为未经转化的正常可育油菜和MDGMS不育油菜对照 株，各自发育正常，在自然授粉情况下可以正常结实；MD1、MD3为正常可育油菜Mg23的转化 植株，在自然授粉情况下基本不结实；Pl、P2、P3为不育油菜MDGMS转化植株，在自然授粉情 况下不结实，而且植株发育矮小。图7为转基因油菜分枝及角果对比；A图为转基因植株灌浆期分枝；B图为转基因植株成熟期分枝；C图为转基因植株 灌浆期角果；D图为转基因植株成熟期角果；1为未经转化的正常可育油菜，结实性正常；2 为正常可育油菜Mg23转化植株，不能结实；3为未经转化的不育油菜，结实性基本正常；4 为不育油菜转化植株，不能结实。图8为BKAPa基因特异的SCAR标记。1-5是不育单株，无扩增带；6-10是正常可育单株，可扩增特异的1500bp的单一条 带；M :DL2000(100、250、500、750、1000、2000bp)DNA 分子量标准。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施方式
对本发明提供的BKAPa基因的克隆过程、基因功能 分析以及用途作具体说明。1、油菜BKAPa基因cDNA的克隆及序列分析本发明以油菜刚抽苔的幼嫩主花序总花蕾为材料，利用Trizol法提取总RNAj^ 检测RNA合格后，以0lig0(dT)18为引物进行反转录反应合成cDNA。以反转录的cDNA为模 板，利用引物 Fl (5，> ATGTCGCTGAGGCCGAGCAC)和 R15(5，> CCTGCAGAATCTGTTCTTCCTC)弓丨 物组合在可育和不育系中均扩增到约1. 5Kb的单一片段(见图1)，利用引物F12(5' > CTG TGG TTG GCG CTGGTATTG)禾口 AR (5 ‘ > TCAGGC AAATTT GAATCC ACC)引物组合在可育和不 育系中均扩增到约500bp的单一片段(见图2)。将上述片段克隆测序后，二者分别包括了 起始密码子ATG和终止密码子TGA，并且有约200bp的重叠区，可以拼接在一起形成油菜的 BKAPa基因开放读码框(ORF)。可育系序列拼接后从起始密码子到终止密码子共计1629b， 而不育系为1623bp，碱基总数比等位可育系少6个。拼接后的序列在不育和可育系之间有 2个位点存在突变差异，即在第175个碱基处，缺失了 2次简单重复序列(CAG)共计6个碱 基；在第693个碱基处，A碱基转换为T碱基。2、油菜BKAPa蛋白结构分析
将克隆到的油菜BKAPa基因cDNA序列翻译成相应的氨基酸序列(序列2)。将序列 2与不育系中克隆到的序列的相应氨基酸序列比较发现，虽然二者在cDNA水平上有2个位 点的突变差异，但在氨基酸序列组成上只有1个突变位点差异，即由于cDNA第一个突变位 点简单重复序列的缺失突变，导致不育系肽链在第59个氨基酸处缺失2个谷氨酰胺(QQ)， cDNA第二个突变位点的A-T碱基转换并未引起氨基酸组成的变化。油菜BKAPa蛋白由542 个氨基酸组成，而突变不育系只有540个氨基酸。 对本发明的序列2氨基酸序列分析表明，油菜BKAPa多肽序列的第12_29个氨基 酸为核定位信号肽(NLS)序列(RKKIYKTGVDADEARRRR)。对本发明的序列2氨基酸序列进行结构域分析，该序列包括1个与KAPb结合 的N-末端结构域(IBB)、8个ARM重复单位(ARM repeat)和2个HEAT重复单位(HEAT repeat)。3、油菜BKAPa基因RNAi及Antisense RNA载体的构建RNAi (RNA干扰)是近年来发展起来的一项能有效抑制转录后RNA功能的技术，在 线虫中被广泛应用来研究基因的功能，目前也广泛应用于其他生物的基因功能研究。本发 明通过构建intron-spliced hpRNA载体系统，并转化油菜来抑制BKAPa基因在油菜中的表 达，从而验证其在油菜个体发育中的功能。为了提高准确性和效率，同时构建了 2个RNAi 载体和1个Antisense RNA载体。具体构建过程如图3、图4所示。4、BKAPa基因RNAi及Antisense RNA载体对油菜的转化本发明采用真空渗透转化方法，对油菜转化构建的2个RNAi载体和1个 Antisense-RNA载体Anti_BKAP。通过抑制BKAPa基因的表达，转基因植株表现明显的突变 现象转化植株能够进行正常的营养生长，但在自然授粉状况下不能结实(见图5、图6)，突 变株只有个别子房膨大，其内着生1-2个膨大的胚珠，但不能发育完全，多为空瘪的珠被壳 (见图7)，在培养基上不能萌发或萌发后不能继续发育而早期夭折。表明BKAPa基因是油 菜配子发育所必需的。5、BKAPa基因序列在分子标记付诸选择育种中的应用根据不育系突变位点所对应的可育正常位点序列设计如下一对引物SCP 1(5，> CTCCAGCAGCAGCAGCAGCCT)禾口SCP2(5，> GCAGGAATGAGAACCGTAGG).用 SCP 1/SCP2 这对引物在等位可育系中扩 增到约1. 5kb的单一特异片段，而在不育系中未扩增到任何带(见图8)，因而可以作为稳定 可靠的SCAR标记用于辅助选择育种。一种与植物配子发育相关基因的cDNA序列及其应用.ST25. txtSEQUENCE LISTING<110>河南大学<120> 一种与植物配子发育相关基因的cDNA序列及其应用<130>BKAPa<140>CN<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1
<211>1629<212>DNA<213>甘蓝型油菜
<400>1atgtcgctga ggccgagcac acgcgtggag ctgaggaaga agatatacaa gacaggtgtt60gacgccgatg aagctaggcg gaggagagag gacaacctcg tggagatcagcgcgaggaca gtctcctcaa gaaacgccgc gaggggatga tgctccagca gcagcagcag180cctctcggag cagctggtct cgacgccctc cagagcgctg ccgccgttga gaaacgacta240gaaggtatcc caatgatggt acaaggtgtt tattatgatg atccccaagc tcagctagaa300gccactactc aatttagaaa gttattatct atagagcgca gtcctccgat agatgaagtg360atcaaagctg gtgttatccc acgttttgtt gagtttcttg gaaggcaaga ccacccacaa420cttcagtttg aggctgcatg ggctttgacc aacgttgcgt caggaacatc agatcatact480cgggttgtga ttgaacatgg ggcggtgcct atcttcgttg agcttctcag ctctgctagt540gatggcgttc gagagcaggc cgtgtgggct ttggggaatg ttgctggaga ctcgccaaac600tgcaggaacc ttgttctcag ctgtggtgct cttgcaccct tgctgtctca gttaaacgaa660aattcaaagt tatccatgct aaggaacgct acatggacct tgtccaactt ttgtcgtggg720
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一种与植物配子发育相关基因的cDNA序列，它具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于所编码的序列表中序列1为来源于 油菜的与配子发育相关的BKAPa基因的序列。
3.根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于所编码的序列表中序列1为来源于 油菜的与配子发育相关的BKAPa等同基因的序列。
4.一种如权利要求1所述的cDNA序列，它编码的蛋白质具有序列表中序列2所示的多 肽氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的cDNA序列，其特征在于所编码的序列表中序列2所示的多 肽氨基酸序列的第12-29位含有由18个氨基酸残基(RKKIYKTGVDADEARRRR)组成的核定位 信号肽(NLS)。
6.根据权利要求4所述的cDNA序列，其特征在于所编码的序列表中序列2所示的氨 基酸多肽序列的第104-450位含有1个IBB结构域，8个ARM重复单元(ARM repeat)和2 个 HEAT 重复单元(HEAT repeat)。
7.—种重组载体，它含有权利要求1所述的cDNA序列。
8.—种重组载体，它含有权利要求4所述的cDNA序列。
9.一种与植物配子发育相关的BKAPa基因的应用，其特征在于将含有所述基因正反 向互补序列的RNAi载体转化油菜，培育出转基因的不育系；将转基因不育系与其它能恢复 其育性的正常可育系杂交，产生杂交种子。
10.一种与植物配子发育相关的BKAPa基因的应用，其特征在于根据所述的基因序列 及突变位点设计特异的PCR引物，产生特异性的分子标记，用此标记鉴定核不育育性分离 群体，进行分子标记辅助选择，可以获得全不育群体用于杂种生产。
全文摘要
本发明公开了一种来源于甘蓝型油菜的与配子发育相关的基因BKAPa的核苷酸序列及其编码的多肽氨基酸序列及其在转化油菜及其它植物选育雄性不育系以及根据该基因序列产生的分子标记在育种方面的应用。本发明的基因在油菜花蕾中高度表达，并且该基因的cDNA序列和氨基酸序列在甘蓝型油菜正常野生型和细胞核雄性不育系之间存在明显的突变差异，该基因的突变可能是导致雄性不育的根本原因，因此，该基因在创造基因工程不育系方面具有极大的应用潜力。
文档编号C12N15/63GK101812461SQ200910064498
公开日2010年8月25日 申请日期2009年3月27日 优先权日2009年3月27日
发明者安国勇, 宋纯鹏, 张骁, 杨翠玲, 王道杰, 苗琛, 郭霭光 申请人:河南大学