专利名称：与小麦抗白粉病基因PmLK906和Pm4连锁的STS标记及其用法的制作方法
技术领域：
本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及一种与小麦抗白粉病基因PmLK906 和Pm4连锁的PCR标记及其用法。
背景技术：
小麦是世界上第二大粮食作物，是我国最重要的农作物，仅河南省每年播种面积 就达7000万亩以上。病害是造成小麦减产的主要原因之一，小麦锈病、纹枯病、赤霉病、黑 穗病、黄矮病等在黄淮麦区均有发生，而白粉病则是发病最早、持续时间最长、危害最严重 的病害，其发病范围广、危害严重，呈上升趋势。1990年白粉病发病面积达1800万ha2，约 占我国小麦面积的1/2，为1981年的3. 6倍。白粉病一般可造成13% 34%的产量损失， 严重年份减产高达30% 50%，并严重影响小麦的品质。从2009年4月初开始，白粉病在 河南省大面积流行，严重程度为近年罕见。而大面积推广品种均感白粉病，无法控制白粉病 流行。虽然药物对小麦白粉病有一定的防治作用，但药物治疗主要存在以下不足首先 是药物防治不能杜绝病害流行；第二是白粉病发病周期短，仅5 7天，在小麦白粉病流行 期间要控制发病程度需要喷洒药物3 4次；第三是药物防治增加成本，按3次施药，每亩 要增加人力、药物投入约50元；第四是药物防治影响小麦品质；第五是药物残留不利于环 境保护和小麦的绿色生产。2009年在豫北麦区调查结果表明，药物防治白粉病效果下降。目前，国际上已经正式命名了 39个小麦抗白粉病基因，但大多已丧失抗性，因 此，寻找有效抗病基因，培育抗病小麦新品种是小麦育种家的重要任务之一。小麦“兰 考90(6)，，是沈天民研究员选育的抗白粉病品系(王祖华，牛吉山，郭天财，张丽娜，沈天 民.2004.小麦主栽品种中的IRS分布和兰考90(6)系列白粉病新抗源.西北植物学 报，24:1216-1220)。我们的研究表明，“兰考90 (6) ”携带1对隐性抗白粉病基因，命名 为PmLK906，是目前我国少数有效的抗白粉病基因之一(牛吉山，王映红，周益林，段霞 瑜，沈天民.2006.普通小麦“兰考90(6)”品系白粉病抗性遗传.植物病理学报，36 (6) 528-533)。Pm4是1个显性复等位抗白粉病基因位点，包括Pm4a和Pm4b，在我国的一些地 区仍具有抗性。抗白粉病基因PmLK906和Pm4均位于小麦的2AL染色体臂上，紧密连锁。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与小麦抗白粉病基因PmLK906和Pm4连锁的STS标记
及其用法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下一种与小麦抗白粉病基因PmLK906和Pm4连锁的STS标记，命名为 XTaAetra5-467，是由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组 成的一对引物扩增。
与小麦抗白粉病基因PmLK906和Pm4连锁的STS标记的用法以待测小麦基因组 DNA作为模板，以SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列作为引物1，以SEQID No. 2所示的核苷酸 序列作为引物2进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有467bp片段特异带，能扩增出467bp 片段特异带的单株携带抗病基因PmLK906，不能扩增出467bp片段特异带的单株不携带抗 病基因PmLK906。所述PCR扩增反应体系PCR试剂组成为H2O13. 64 μ L10 X buffer (含 Mg2+) 2. 0 μ LdNTP(25mmol/L)1. 6μ L引物 l(10ymol/L)0. 8 μ L引物 2(10ymol/L)0. 8 μ LTaq 酶(20u/yL)0. 16 μ L模板DNA (50ng/ μ L) l.OyL总体积20.0yL，PCR扩增程序为先在94°C预变性4分钟；接35个循环的94°C变性30秒，52°C复 性45秒，72°C延伸1分钟；最后在72°C延伸10分钟。扩增结束后将样品取出置于4°C保存 待检测。所述检测扩增产物方法为扩增产物在的琼脂糖凝胶电泳上进行分离，然后用 EB进行显色。本专利通过抗病品系“兰考90 (6) ”与感病品种“中国春”杂交建立了 F3代分离群 体，用分池法建立抗、感cDNA池，通过小麦基因芯片杂交、cDNA-PCR扩增获得了 1个与抗病 基因PmLK906和Pm4连锁的基因全长cDNA克隆，在此基础上发展出能在不同小麦遗传背景 下跟踪检测PmLK906和Pm4的STS分子标记辅助选择技术。本发明与现有技术相比较的优点及有益效果如下本发明提供了小麦抗白粉病基因PmLK906和Pm4连锁的STS标记XTaAetra5_467， 该标记与PmLK906基因和Pm4基因紧密连锁，PmLK906基因是目前我国少数有效的抗白粉 病基因之一，Pm4是1个显性复等位抗白粉病基因位点，可以对抗病基因PmLK906和Pm4进 行分子标记辅助选择，从而实现与其它有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。利用这种 方法，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，有目标地将抗病基因快速转入感 病品种，而且可有目的地聚合多个有效抗白粉病基因，培育出具有稳定、持久抗性的小麦新 品种。
图 1 是用引物 AtPR5-F 和 AtPR5-R 在“中国春” (CS)和“兰考 90 (6) 21-12” (906) cDNA中的扩增结果。结果表明TaAetPR5基因仅存在于抗病小麦“兰考90 (6) 21-12”中。图2是引物对P9-7pl、P9_7p2在抗、感亲本，抗、感DNA池及F3分离群体中的扩增 结果。其中，1 中国春；2 兰考90 (6) 21-12 ；3 感病DNA池；4 抗病DNA池；S 感病植株； R 抗病植株。R/S 杂合植株。图3标记XTaAetPR5_467 (TaAetPR5)与抗病基因的连锁图；其中a :TaAetPR5和
4PmLK906在2AL染色体上的连锁图；b :TaAetPR5和Pm4a在2AL染色体上的连锁图。图4标记XTaAetra5-467检测回交转育抗病品系后代；其中，1 白硬冬2号；2 “兰考90(6)21-12” ；3-10、12、13 抗病植株；11 感病植株。
具体实施例方式1.标记筛选过程(1)植物材料感病亲本“中国春”，抗病亲本“兰考90(6)21-12”。配置杂交组合 “中国春” / “兰考90 (6) 21-12”，获得F1代、F2代分离群体和139个F2:3家系分离群体。同 时还配置了“兰考90 (6)” X “豫麦21”、“兰考90 (6)” X “濮麦9号”、“兰考90 (6) ” X “白 硬冬2号”等抗、感小麦杂交组合，获得了不同组合的F1代、F2代、F2:3家系，用于标记验证。(2)白粉病抗性鉴定采用离体叶段培养法接种小麦白粉病菌鉴定亲本及杂交后 代材料的抗病性。选用合适的培养皿，放置一层中性滤纸，用40mg/L的6-苄氨基腺嘌呤 (6-Benzylaminopurine 6-BA)充分湿润滤纸。待幼苗第一片叶完全展开后，截取3 4cm 叶段，按编号放在滤纸上。接种小麦白粉病菌，用本实验室通过连续单孢子堆分离纯化的 2个白粉病菌株，采用轻拂法人工接种，24小时后再重复接种1次。在光照培养箱内培养， 18°C，每天光照12小时，在感病对照充分发病的情况下(7 10天)按照0 4级反应型 记录白粉病发病情况，48小时后再重复观察一次。(3)抗、感病cDNA池构建和基因芯片杂交通过抗性鉴定选择10个F3纯合抗病家 系和10个纯合感病家系建立抗、感池。用TRIzol 试剂(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA) 提取总RNA。本试验所用基因芯片为Affymetrix 公司(SantaClara，CA，USA)推出的小麦 基因芯片。该芯片包含普通小麦、一粒小麦(Triticummonococcum)、二粒小麦(Triticum turgidum)和粗山羊草(Aegilops tauschii)的探针共61127个，代表55052个转录子。基 因芯片杂交和数据处理在上海国家基因芯片工程中心完成。(4)基因克隆根据基因芯片杂交结果提示的序列信息设计了一对引物，引物 AtPR5-F的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，引物Atra5-R的核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示。该引物用来在兰考90(6)21-12中克隆基因。RNA提取、cDNA合成、扩增等按以前报 告的方法进行(牛吉山，王映红，周益林，段霞瑜，沈天民.2006.普通小麦“兰考90(6)”品 系白粉病抗性遗传.植物病理学报，36(6) :528-533)。扩增程序为95°C 3min ;5个循环的 940C 30s, 500C lmin，72°C 3min ；27 个循环的 94°C 30s, 47°C lmin，72°C 3min ；最后在 72°C 延伸7min。扩增产物回收后插入PMD19-T，测序(TaKaRa公司，大连)。获得了 1个新基因 并命名为TaAetra5。基因克隆同时在感病品种“中国春”中进行，结果表明该基因仅存在于 抗病小麦“兰考90 (6) 21-12”中，而不存在于感病小麦“中国春”(图1)。(5) STS标记引物设计及与PmLK906基因的连锁分析根据克隆的TaAetPR5基 因cDNA序列设计了一对引物P9-7pl 核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，P9_7p2核苷酸 序列如SEQ ID No. 2所示。用该引物在139个株系组成的F3分离群体中进行扩增(图2， 表 1)。扩增程序为 95°C 3min ；35 个循环的 94°C 30s, 50°C lmin，72°C Imin ；最后在 72°C 延伸7min。扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳检测。特异性扩增片段长度是467bp。用 JoinMap Version 3. 0进行连锁分析。获得了与PmLK906抗白粉病基因连锁的STS分子标 记，命名为 XTaAetPR5-467 (图 3a)。
(6)分子标记XTaAetPR5-467与Pm4a的连锁分析用引物对P9_7p 1、P9_7p2 在“Chancellor”/ “Cl 14124” 杂交构建的 Pm4a 分离群体(Ma Z Q, Wei J B, ChengS H.PCR-based markers for the powdery mildew resistance gene Pm4a in wheat. Theoretical and Applied Genetics，2004，109，140-145)中进行扩增和连锁分析，证明标 记 XTaAetPR5-467 与 Pm4a 共分离(图 3b)。(7)通过研究获得1个显性STS标记XTaAetfR5-467，与小麦抗白粉病基因 PmLK906和Pm4连锁，可以在不同小麦遗传背景下检测这2个抗白粉病基因位点。表IF3分离群体的白粉病反应型和P9-7pl、P9_7p2引物扩增结果
权利要求
一种与小麦抗白粉病基因PmLK906和Pm4连锁的STS标记，命名为XTaAetPR5 467，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的一对引物扩增。
2.权利要求1所述的与小麦抗白粉病基因PmLK906和Pm4连锁的STS标记的用法，其 特征在于以待测小麦基因组DNA作为模板，以SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列作为引物1， 以SEQ ID No.2所示的核苷酸序列作为引物2进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有467bp 片段特异带，能扩增出467bp片段特异带的单株携带抗病基因PmLK906，不能扩增出467bp 片段特异带的单株不携带抗病基因PmLK906。
3.根据权利要求2所述的与小麦抗白粉病基因PmLK906和Pm4连锁的STS标记的用 法，其特征在于所述PCR扩增反应体系PCR试剂组成为H2013. 64 μ L10 X buffer (含 Mg2+) 2. 0 μ L dNTP(25mmol/L) 1. 6μ L 引物 l(10ymol/L) 0. 8 μ L 引物 2(10ymol/L) 0. 8 μ L Taq 酶(20u/ μ L) 0. 16 μ L 模板 DNA (50ng/ μ L) l.OyL 总体积20. OyL，PCR扩增程序为先在94°C预变性4分钟；接35个循环的94°C变性30秒，52°C复性45 秒，72°C延伸1分钟；最后在72°C延伸10分钟。扩增结束后将样品取出置于4°C保存待检 测。
4.根据权利要求2或3所述的与小麦抗白粉病基因PmLK906和Pm4连锁的STS标记的 用法，其特征在于所述检测扩增产物方法为扩增产物在的琼脂糖凝胶电泳上进行分 离，然后用EB进行显色。全文摘要
一种与小麦抗白粉病基因PmLK906和Pm4连锁的STS标记及其用法，属于植物分子育种技术领域。该标记命名为XTaAetPR5-467，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的一对引物。其用法为以待测小麦基因组DNA作为模板，以标记XTaAetPR5-467的引物进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有467bp片段特异带，能扩增出467bp片段特异带的单株携带抗病基因PmLK906，不能扩增出467bp片段特异带的单株不携带抗病基因PmLK906。所述的分子标记可以在不同小麦遗传背景中准确检测PmLK906和Pm4基因的存在。该技术可以加快PmLK906和Pm4基因向小麦生产品种中的转育速度。
文档编号C12N15/11GK101955985SQ20091006542
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者倪永静, 尹钧, 牛吉山, 王保勤, 贾海燕, 马正强 申请人:河南农业大学