香雪兰UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡萄糖基转移酶的cDNA的制作方法

文档序号:573304阅读:213来源:国知局
专利名称:香雪兰UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡萄糖基转移酶的cDNA的制作方法
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域,具体涉及从红花香雪兰花瓣中克隆分离 编码UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡糖基转移酶(UF3GT)的cDNA。
背景技术
在植物花色形成过程中,UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UF3GT)能将花色素催 化生成花色苷,糖基化通常发生在该物质的0 (OH-和COOH-)、 N、 S、 C原子上,通常是 在糖基转移酶的作用下,以核酸活化的糖分子作为^^体底物进行的。最常见的受体是羟基 化的分子,而UDP-葡萄糖是最常见的供体分子。花色素结合糖苷对花色素的稳定性及在液 泡中的溶解性起着至关重要的作用,糖基化作用使花的最大吸收光谱向紫外线端移动而呈 现蓝色。
到目前为止,人们已经克隆得到许多与植物次生代谢产物相关的UF3GT基因,如在玉 米(N. V. Fedoroff et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 119 (1988) 185-197),金鱼草(C. Martinet al. Plant J. 1 (1991) 37 - 49),龙胆(Y. Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 37 (1996) 711-716),紫苏(Z. Gongetal. Plant Mo 1. Biol. 35 (1997) 915 - 927),葡萄(C.M. Ford etal. J. Biol. Chem. 273 (1998) 9224 - 9233),矮牵牛(M. Yamazaki et al. Plant Mol. Biol. 48 (2002) 401 - 411)等。
对巳有的糖基转移酶氨基酸序列和根据cDNA推测出的糖基转移酶的氨基酸序列的比较 分析,编码区具有2个保守的区域 一个是编码44个氨基酸的糖基转移酶所特有的特征性区 域(Lim E.K. , Bowles D.J. EMB0 J (2004) 23: 2915 - 2922),它被认为是UDP-葡萄糖的 结合区域,在这个区域氨基酸序列与其它已知的糖基转移酶基因有43% 78%的相似性;另 一个保守的区域位于糖基转移酶基因的上游附龍,它们的相似性在30°/。 45%。但是,这类酶 不同成员及在不同植物种类中的蛋白质一级结构序列的相似性很低,所以至今尚未见用糖 基转移酶基因保守区合成简并引物获得糖基转移酶基因的报道。
本发明克隆所得到的FhGTl基因能编码与植物次生代谢过程相关的UF3GT,具体说该基
4因是植物花色形成过程中的结构基因之一,能将UDP-葡萄糖上的葡萄糖转移到花色素分子 的C3羟基上生产花色苷,保持花色素分子结构稳定,同时是花色素分子运输到液泡必不可少 的因素,与花色合成密切相关。 '

发明内容
本发明首次从红花香雪兰中克隆得到UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡糖基转移酶(UF3GT) 的新cDNA,并确定了它的核苷酸序列和由此得出的氨基酸序列。另外,FhGTl基因在大肠杆 菌细胞中成功的表达了所述的UF3GT蛋白,并且发现表达的重组蛋白,在体外酶活实验中可 以将花色素催化生成花色苷。
所以,本发明的目的是提供编码UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡糖基转移酶(UF3GT)的新 cDNA和由此推断的氨基酸序列。
为了从香雪兰中克隆得到FhGTl基因,本发明首先利用RT-PCR的方法在拟南芥中制备相 关的探针,使用ECL发光试剂盒对实验室已建立的红花香雪兰花瓣的cDNA文库进行筛库,分 离得到919bp的cDNA片段,测序得到该片段的核苷酸序列。分析该序列显示此片段与Iris hollandica的UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡糖基转移酶(UF3GT)同源性最高,达到63%。另夕卜, 序列分析显示该片段包含ATG起始密码子。利用RACE法克隆该基因的3'端序列,得到833bp 的片段,测序得到该片段的核苷酸序列。分析该序列显示此片段与Iris hollandica的UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡糖基转移酶(UF3GT)同源性最高,达到64%。另外,序列分析显示该 片段包含TGA终止密码子。提取红花香雪兰花瓣总RNA作为模板,进行RT-PCR,克隆得到 1383bp的全长FhGTl基因,开放阅读框架长1338bp,其编码的蛋白序列长446个氨基酸,蛋 白质的分子量推测是48, 043Da,等电点为5.71。
在pET-28(a+)原核表达载体中插入克隆得到的的FhGTl基因,并且转入到大肠杆菌 BL21(DE3)细胞中,表达重组UF3GT蛋白。
进行香雪兰UF3GT蛋白的体外酶活反应,高效液相(HPLC)检测反应产物,结果显示反 应产物中有花色苷的生成,说明原核表达制备的UF3GT蛋白有糖基转移酶的活性,证明克隆 得到的基因是UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡萄糖基转移酶基因。
香雪兰UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡萄糖基转移酶cDNA的特征如下 其中l: FhGTl基因5'端的核苷酸序列(SEQ ID NO. 1)CGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGC
FhGTl基因5,端核苷酸序列长为919bp。 其中2: RACE法获得FhGTl基因的3'端序列(SEQ ID NO. 2)
AAATTCTTCTTGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC
FhGTl基因3'端核苷酸序列长为833bp。 其中3: FhGTl基因的全长核苷酸序列(SEQ ID NO. 3)GACATTGTAATTGCACGTTGAGGTTCAGCTAGTGTTCGGAATATGACTGAAGTCTGA
克隆得到FhGTl基因全长为1383bp,开放阅读框架长1338bp,下划线表示的是该序列的 起始密码子和终止密码子。
其中4:由FhGTl基因核苷酸序列推测得到的蛋白质序列(SEQ ID N0, 4)
RANVAE細KKVVVGEEGRKMRERAAAIREMAAGSVRPGGSSVQNFKALLDIVIAR-
FhGTl基因编码的蛋白序列长446个氨基酸,蛋白质的分子量推测是48, 043Da,等电点 为5.71。


图l为FhGTl基因的全长RT-PCR电泳图; 图2为FhGTl基因原核表达载体构建的分子鉴定电泳其中M: DL 2000; 1:重组质粒酶切;2:重组质粒PCR扩增;3:重组质粒
图3为HPLC检测结果图,其中体外酶活反应,在保留时间17min时检测到花色苷的生成;图4为HPLC检测结果图,其中阴性对照反应,反应无花色苷生成。
具体实施例方式
在下面的具体实施例中进一步说明本发明,但并不限制本发明的范围。 实施例l FhGTl基因全长的克隆
1、 探针的获得根据拟南芥序列,设计特异的引物,即5'-CGA AGA CGG TGA AGA GGA C-3' (SEQ ID NO. 5)的上游引物和5'-GGT GAC TGA AAC AAA GAG CC-3' (SEQ ID NO. 6) 的下游引物。然后用Trizol试剂盒提取拟南芥的总RNA,反转录生成cDNA的第一条链,以此 作为模板进行RT-PCR,得到的PCR产物即为筛库的探针。
2、 FhGTl基因5'序列的获得利用ECL发光试剂盒和上述探针对红花香雪兰花瓣的cDNA 文库进行筛库,挑取曝光得到的阳性菌落进行测序,序列如SEQ ID NO. l所示。
3、 FhGTl基因3'序列的获得根据上述测序得到的结果,设计特异的上游引物,即 5'-AATCCCACCCTGAACC-3' (SEQ ID NO. 7);根据mRNA保守的polyA结构设计特异的下游引 物5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC-3' (SEQ ID NO. 8)。用Trizol试剂盒提 取红花香雪兰花瓣的总RNA,反转录生成cDNA的第一条链,以此作为模板进行RACE,得到 FhGTl基因3,序列,结果如SEQ ID NO. 2所示。
4、 FhGTl基因全长序列的获得根据上述两次测序得到的结果,设计特异的引物,即 5'-CAG CAA GCA ATG GGA TCG-3' (SEQ ID NO. 9)的上游引物和5'-CAG ACT TCA GTC ATA TTC CGA-3' (SEQ ID NO. 10)的下游引物。用Trizol试剂盒提取红花香雪兰花瓣的总RNA, 反转录生成cDNA的第一条链,以此作为模板进行RT-PCR,电泳结果如图l所示,得到FhGTl 基因全长序列,结果如SEQ ID NO. 3所示。
实施例2 FhGTl基因在大肠杆菌细胞中的表达
为了表达FhGTl蛋白,利用克隆得到的全长FhGTl基因作为模板,分别带有EcoR I和Hind III酶切位点的引物进行FhGTl基因开放阅读框的PCR扩增。其中上游引物5'-CTCGAATTC CAG CAA GCA ATG GGA TCG-3, (SEQ ID NO. 11);下游引物5, -CGG AAG CTT CAG ACT TCA GTC ATA TTC CGA-3' (SEQ ID NO. 12)。
分别利用EcoR I和Hind III两种限制性内切酶消化上述扩增得到的DNA片段,并将其克 隆进入质粒pET-28(a+),这样构建的重组质粒命名为pET-28a-FhGTl,构建后利用酶切及PCR 鉴定,结果如图2所示。然后导入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,培养所述的转化体表达FhGTl
8蛋白,将获得的包涵体用6M尿素裂解,后缓慢透析得到重组的FhGTl蛋白
实施例3 FhGTl蛋白的体外酶活检测
体外酶活反应体系 (250 ul)
0. 1M磷酸钾缓冲液(pH7.0) : 100ul 10mM DTT : 25 u 1
10mM矢车菊花色素(cyanidin) : 10 u 1 lOmM UDP-Glu: 25 w 1
10%甘油 25 u 1
UFGT蛋白 65 ul
反应条件30°C, 30min,反应结束后14, 000rpra离心2min,所得上清液用O. 22 u m过 滤后,进行HPLC检测。
HPLC检测检测使用C18 column (规格250X4.6mm);检测条件35°C, 270咖;洗 脱条件前20min线性洗脱溶液A(10。/。乙酸+0. 1%磷酸)100-60%,溶液B(50。/。乙腈)0—40%; 后20min等度洗脱溶液A: 60%,溶液B: 40%,检测结果如图3所示。检测结果表明体外 酶活检实验,产物中有花色苷的生成,说明原核表达制备的UFGT蛋白有活性,初步证明我 们分离的基因是尿苷二磷酸葡萄糖类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因。
权利要求
1、香雪兰UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶的cDNA,其特征如下其中1FhGT1基因5’端的核苷酸序列为TCATACTCTTGTTTCTTGCTTGTATTTGATTGATCATCAGCAACAGCAAGCAATGGGATCGGCCGATCGCTCCCACGTGGCACTCCTGGCCTTCCCCTTCGGGACCCACGCCGCCCCTCTCCTCTCCCTCGGCCTCAACCTCGCCTCCTCGGCACCCCACGGCACCACTTTCTCCTTTCTTAGCAACCGCCGTCCCGTCTCCTTGCCACCCAATTCCGCCATCAAGTTCTACGAGATCGCGGACGGCTCCGACCCCGAACACGAGGGACACGTGCACCCCGAAGAGGAGGTGAGGGTGTTCATGGAGGAGACGCCCGGGAACTACAAGAAGGCGCTGGAGGCCGCGGTTGATAGGTGCGGGGGGCAGCGTGTCACGTGCATCGTGGCGGACGCGTTCCTCTGGTTCGTTGGGGACATCGCGGCGGAGTTCGGTGTCCATTGGGTCCCACTCTGGACTGGCGGGCCGTGCAGCTTCCTCGCCCACCTCTACACCGACATGCTGAGGAACAAGATAGGTACAGGGAAGGAAGCTGATCCAGATGAGGACCTCCAATTCCTCCCTGGACTTTCCGGTTTCCGTGTACGCGACCTCCCCGACGACATTGTCACCGGAGACCTCACCGGTGCCTTCGCCAGTCTCCTCCACCGCATGTCAATCGAGATTCCCCGCTCCGCTGCCGCCATTGCCATCAACACCTTCGAGGGCCTCCATCCGGACATCGACGCCGACCTCGCCTCCAAGTTCAAGAAGTCACTCCCAATTGGCCCACTCAACCTCCTCAATCCCACCCTGAACCAACCGGACAAGTTCTCTTGCCTAGCCTGGCTGGACAAGTTCGAACCGCATTCGGTCGCCTACGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGCFhGT1基因5’端核苷酸序列长为919bp;其中2RACE法获得FhGT1基因的3’端序列为AATCCCACCCTGAACCAACCGGACAGGTTCTCTTGCCTAGCCTGGCTGGACAAGTTCGAACCGCATTCGGTCGCCTACGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGCCTCGAGCAGAGTGGGGTCCCTTTCCTCTGGTCCCTCAAGGAACCGGGCCAACTGCCGGCCGGGTTCCTGGACCGGACCAAGGACCGGGGTCTCGTGGTCCCGTGGGTGCCGCAAGCCGAAGCATTGAAACATGTTGCGGTGGGCGCATCCTTGAGCCACTGCGGATGGAACTCCGTCATGGAGAGCGTAACGAGCGGCGTGCCGATGCTCTGCAGGCCGTTCCTCGGGGACCAGACAATGAATGCACGTGCCGTGTCGCATGTTTGGAAAGTCGGGGTGACGTTCGAGAATGGCACGATGACTAGGGCCAACGTGGCGGAGGCCATGAAGAAGGTGGTTGTCGGCGAAGAAGGGAGGAAGATGAGGGAGAGAGCGGCGGCGATTCGGGAAATGGCGGCCGGCTCGGTGCGACCGGGCGGAAGCTCGGTGCAAAACTTCAAGGCTCTCCTAGACATTGTAATTGCACGTTGAGGTTCAGCTAGTGTTCGGAATATGACTGAAGTCTGATTGTATTTGAGTGAGATGGAGTATTAGTATTGTGCCTATTAATTCCTTGTTATGTTTGAAGAAATGAATCTAGTAATAATATAATAAACTTCTTGCATTTCGTCCTCTCTTGCTTATTGTGAAAGAGAGACCTGCAAATTCTTCTTGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTCFhGT1基因3’端核苷酸序列长为833bp;其中3FhGT1基因的全长核苷酸序列为CAGCAAGCAATGGGATCGGCCGATCGCTCCCACGTGGCACTCCTGGCCTTCCCCTTCGGGACCCACGCCGCCCCTCTCCTCTCCCTCGGCCTCAACCTCGCCTCCTCGGCACCCCACGGCACCACTTTCTCCTTTCTTAGCAACCGCCGTCCCGTCTCCTTGCCACCCAATTCCGCCATCAAGTTCTACGAGATCGCGGACGGCTCCGACCCCGAACACGAGGGACACGTGCACCCCGAAGAGGAGGTGAGGGTGTTCATGGAGGAGACTCCCGGGAACTACAAGAAGGCGCTGGAGGCCGCGGTTGATAGGTGCGGGGGGCGGCGTGTCACGTGCATCGTGGCGGACGCGTTCCTCTGGTTCGTTGGGGACATCGCGGCGGAGTTCGGTGTCCATTGGGTCCCACTCTGGACTGGCGGGCCGTGCAGCTTCCTCGCCCACCTCTACACCGACATGCTGAGGAACAAGATAGGTACAGGGAAGGAAGCTGATCCAGATGAGGACCTCCAATTCCTCCCTGGACTTTCCGGTTTCCGTGTACGCGACCTCCCCGACGACATTGTCACCGGAGACCTCACCGGTGCCTTCGCCAGTCTCCTCCACCGCGTGTCAATCGAGATTCCCCGCTCCGCTGCCGCCATTGCCATCAACACCTTCGAGGGCCTCCATCCGGACATCGACGCCGACCTCGCCTCCAAGTTCAAGAAGTCACTCCCAATTGGCCCACTCAACCTCCTCAATCCCACCCTGAACCAACCGGACAAGTCCTCTTGCCTAGCCTGGCTGGACAAGTTCGAACCGCATTCGGTCGCCTACGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGCCTCGAGCAGAGTGGGGTCCCTTTCCTCTGGTCCCTCAAGGAACCGGGCCAACTGCCGGCCGGGTTCCTGGACCGGACCAAGGACCGGGGTCTCGTGGTCCCGTGGGTGCCGCAAGCCGAAGCATTGAAACATGTTGCGGTGGGCGCATTCTTGAGCCACTGCGGATGGAACTCTGTCATGGGGAGCGTAACGAGCGGTGTGCCGATGCTCTGCAGGCCGTTCCTCGGGGACCAGACGATGAATGCACGTGCCGTGTCGCATGTTTGGAAAGTCGGGGTGACGTTCGAGAATGGCACGATGACTAGGGCCAACGTGGCGGAGGCCATGAAGAAGGTGGTTGTCGGCGAAGAAGGGAGGAAGATGAGGGAGAGAGCGGCGGCGATTCGGGAAATGGCGGCCGGCTCGGTGCGACCGGGCGGAAGCTCGGTGCAAAACTTCAAGGCTCTCCTAGACATTGTAATTGCACGTTGAGGTTCAGCTAGTGTTCGGAATATGACTGAAGTCTGA克隆得到FhGT1基因全长为1383bp,开放阅读框架长1338bp,下划线表示的是该序列的起始密码子和终止密码子;其中4由FhGT1基因核苷酸序列推测得到的蛋白质序列为MGSADRSHVALLAFPFGTHAAPLLSLGLNLASSAPHGTTFSFLSNRRPVSLPPNSAIKFYEIADGSDPEHEGHVHPEEEVRVFMEETPGNYKKALEAAVDRCGGQRVTCIVADAFLWFVGDIAAEFGVHWVPLWTGGPCSFLAHLYTDMLRNKIGTGKEADPDEDLQFLPGLSGFRVRDLPDDIVTGDLTGAFASLLHRMSIEIPRSAAAIAINTFEGLHPDIDADLASKFKKSLPIGPLNLLNPTLNQPDRFSCLAWLDKFEPHSVAYVSFGTLAALTEAELVELASGLEQSGVPFLWSLKEPGQLPAGFLDRTKDRGLVVPWVPQAEALKHVAVGASLSHCGWNSVMESVTSGVPMLCRPFLGDQTMNARAVSHVWKVGVTFENGTMTRANVAEAMKKVVVGEEGRKMRERAAAIREMAAGSVRPGGSSVQNFKALLDIVIAR-FhGT1基因编码的蛋白序列长446个氨基酸,蛋白质的分子量推测是48,043Da,等电点为5.71。
全文摘要
本发明属于植物分子生物学领域,具体涉及从红花香雪兰花瓣中分离编码UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UF3GT)的cDNA。香雪兰UF3GT基因(FhGT1)cDNA的核苷酸序列分析显示克隆得到的FhGT1基因长1383bp,开放阅读框架长1338bp,其编码的蛋白序列长446个氨基酸,推测蛋白质的分子量是48,043Da,等电点为5.71。利用所述的FhGT1基因在大肠杆菌细胞中表达重组的UF3GT蛋白,该蛋白在体外酶活反应试验中,能促使花色素与UDP-葡萄糖反应,催化生成花色苷。其在转基因植物花卉的花色修饰方面具有应用价值。
文档编号C12N15/54GK101659956SQ20091006736
公开日2010年3月3日 申请日期2009年7月29日 优先权日2009年7月29日
发明者杨 付, 丽 王, 昕 隋 申请人:东北师范大学
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