专利名称：微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制作方法
技术领域：
本发明属于生物领域，涉及细菌纤维素异型产品的制备方法，具体涉及微生物发酵直接 生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法，特别涉及以木葡糖酸醋杆菌(^"co朋c"o/^"er 《^j'/7i/历)CGMCC No. 1. 1812、具有氧渗透功能的材料为模具和培养基为原料通过菌种培养、 发酵、洗涤和干燥制备细菌纤维素异型产品的方法。
背景技术：
细菌纤维素(bacterial cellulose)是某些细菌合成的高分子化合物，具有超精细网状 结构，虽然细菌纤维素和植物或海藻产生的纤维素具有相同的分子结构单元，但细菌纤维素 却具有很多独特的性质如高结晶度、高化学纯度、高抗张强度、高弹性模量、高持水性、良
好的生物相容性、生物合成的可调控性等，这些性质是其它来源的纤维无法比拟的。因此， 在食品、造纸、医学材料、化妆品、化工、废水处理、林业等领域有广泛的应用，成为近年 来国际上生物医学材料的研究热点。
目前，生物合成的细菌纤维素产品形状及性能较单一。为提高细菌纤维素的生产效益， 我们申请了 "葡萄糖氧化杆菌发酵生产细菌纤维素的方法"专利，2004年2月4日获得国家 授权，专利号ZL 99 1 09800.5。 2006年10月25日国家知识产权局公布了 "一种人造皮 肤用细菌纤维素湿膜的制备方法"，专利申请号200610026708. X。 2007年5月28日国家 知识产权局公布了 "一种相互粘连多层细菌纤维素膜的制备方法"，专利申请号 200610118317.0。由于膜状或片状的细菌纤维素拉伸性能较好，其应用较广，而其它形状产 品拉伸性能较差(如细菌纤维素管的拉伸强度一般小于lMPa)，而且其生产工艺较复杂，有 些需要额外供纯氧造价较高应用受到限制。2007年10月17日国家知识产权局公布了 "一 种利用细菌纤维素制备人工硬脑膜的方法"的专利，专利号200710015537.5。以上制备细菌 纤维素材料时都需要将发酵获得的细菌纤维素膜粉碎后，再次加工成一定的形状的细菌纤维 素产品。这样不仅工艺复杂，而且产品成本提高。2008年7月18日，我们申请了 "具有抑 菌性能的细菌纤维素管的制备方法":的专利，专利号200810053871.4，就是通过发酵技术 直接合成细菌纤维素管后，将细菌纤维素管与e-聚赖氨酸复合，制备出具有良好拉伸性能和 抑菌功能的细菌纤维素管，工艺简单，造价较低。在此基础上，我们提供一种微生物发酵直 接生物合成任意形状的细菌纤维素异型产品的制备方法，不仅简化了工艺、降低了生产成本， 并且可通过工艺条件的改变，控制其拉伸性能、形状和厚度。该方法有助于丰富细菌纤维素 产品的品种，具有良好的应用前景。
发明内容
要解决的问题
本发明的目的是针对上述问题，提供一种利用微生物发酵技术直接合成、拉伸性能、形
3状和厚度等产品性能指标可控的细菌纤维素异型产品的制备方法，为拓展细菌纤维素的应用 领域奠定基础。 技术方案
微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法是以木葡糖酸醋杆菌
(67i/co朋ce^^a"er《Wi/7娜)CGMCC No. 1. 1812、具有氧渗透功能的材料为模具和培养基 为原料通过菌种培养、发酵、洗涤和干燥制备细菌纤维素异型产品的方法。具体步骤是
① 菌种培养将一环或两环活化的木葡糖酸醋杆菌CGMCC No. 1. 1812斜面种子，接入HS 种子培养基中，3(TC条件下160r/min振荡培养24h;
② 发酵如图1所示，以具有氧渗透能力的材料作为封闭异型发酵模具(3)(同时作为 发酵容器，类似注塑模具，留有培养基注入口)，即以5-20。/。(v/v)的接种量接入装有HS发酵 培养基(4)的异型发酵模具(3)中，异型发酵模具(3)直接热封口 (1)或用胶塞及其它 封口物密封后，经3(TC静置培养5-10d，细菌纤维素即附着在模具(3)的内表面合成，经分 离，得到细菌纤维素异型产品；或如图2所示，将具有氧渗透能力的模具(2)置于发酵容器
(5)中，该发酵容器(5)选自三角瓶、烧杯、广口瓶或发酵罐，发酵容器(5)中装有HS 发酵培养基(3)，具有渗氧功能的模具(2)与空气(1)相通，经3(TC静置培养5-10d，细 菌纤维素即附着在模具外表面合成，经分离，从模具(2)外即可剥离细菌纤维素异型产品；
③ 洗涤和干燥将上述发酵制备的细菌纤维素异型产品，以流动水浸泡洗涤处理l-2d 后，再经O. lmol/L的Na0H溶液浸泡l-2d除去培养基及残存菌体，洗涤至中性，冷冻干燥或 热风干燥，即可得细菌纤维素异型产品。
需要说明的是
具有渗氧能力的管材，选自PVC材料或硅胶材料；异型发酵容器的形状为正方形、圆形、
手形、V形等各种规则或不规则形状；异型产品的形状、大小和厚度可控；异型产品形状可
为中空。
所述的HS培养基成分为1L水中含葡萄糖25g，酵母膏5g，蛋白胨5g， Na2HP04 2 . 7g， 柠檬酸1. 15g， pH 6. 0。
有益效果
本发明提供的微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法，属于生物领域， 涉及微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法，特别涉及以木葡糖酸醋杆菌
(W〃co/7aceto&3"enj^ifl譜)CGMCC No. 1. 1812、具有氧渗透功能的材料为模具和培养基 为原料通过菌种培养、发酵、洗涤和干燥制备细菌纤维素异型产品的方法。本发明的方法不 需要额外供给氧气，工艺简单，造价较低。该方法制备的细菌纤维素异型产品其形状和厚度 具有可控性，同时具有良好的拉伸性能和生物相容性，可作为食品包装材料以及组织工程支 架材料，如肉制品肠衣、糖果或糕点的可食用包装、人体不同部位皮肤敷料、脑膜、角膜、 耳膜、气管、血管替代物等，具有良好的应用前景。
图1是本发明使用的发酵装置。 图2是本发明使用的发酵装置。 图3为实施例1结果照片。 图4为实施例3结果照片。
在图l中l为封口， 2为空气，3为模具，4为培养基。在该发酵装置中，模具3同时还 兼做发酵容器，即将培养基放入模具3中。
在图2中1为空气，2为模具(模具中空，与空气相通)，3为培养基，4为封口塞，5 为发酵容器。在该发酵装置中，将模具2放入装满培养基的发酵容器5中。
图3为除去培养基和菌体后洗涤至中性的手形细菌纤维素异型产品。
图4为冷冻干燥后的圆环形细菌纤维素异型产品。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细阐述。
实施例1:
木葡糖酸醋杆菌CGMCC No. 1.1812，(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)斜面种子 接入装有种子培养基的锥形瓶中，3(TC下160r/min振荡培养24h后，木葡糖酸醋杆菌种子以 5-20%(v/v)的接种量接入装有500mLHS发酵培养基的三角瓶中，摇匀后倒入手形发酵容器中， 热封口后在3(TC下静置培养10d，发酵结束后，细菌纤维素即附着在容器内壁表面合成。从 内壁表面剥离后，即可得到细菌纤维素异型产品。然后流动水浸泡洗涤l-2d后再用 0. lmol/LNaOH溶液浸泡1-2d除去培养基和菌体，洗涤至中性(pH值约7.2)，如图3所示， 然后冷冻干燥即得细菌纤维素异型产品。
不同尺寸的控制
选择不同大小尺寸的异型发酵容器即可得到不同大小的细菌纤维素异型产品。 在其它培养条件不变的情况下，培养时间与产品厚度呈正比关系，分别培养至6天、7 天、8天、9天和10天时从容器内壁表面剥离细菌纤维素产品后，测得的厚度为1. 6mm、 2. lmm、 2.6mm、 3.0鹏、3.2 mm，流动水浸泡洗涤l_2d后再用0. lmol/LNa0H溶液浸泡1-2d，洗涤 至中性，冷冻干燥后测得的细菌纤维素产品的厚度分别为11.26nm、 13.45um、 14.81yra、 15. 17践、15. 69um。
实施例2:
菌种及种子培养词实施例l，木葡糖酸醋杆菌种子以5-20%(v/v)的接种量接入装有300mL HS发酵培养基的三角瓶中，摇匀后倒入W形发酵容器中，封口后在3(TC下静置培养10d，发 酵结束后，细菌纤维素即附着在容器内壁表面合成。从内壁表面剥离后，将细菌纤维素异型 产品置于流动水浸泡洗涤1-2d后，再用0. lmol/LNa0H溶液浸泡l-2d除去培养基和菌体，洗 涤至中性(pH值约7.2)后冷冻干燥。实施例3:
菌种及种子培养同实施例l，木葡糖酸醋杆菌种子以5-20%(v/v)的接种量接入装有300mL HS发酵培养基的三角瓶中，摇匀后倒入圆环形发酵容器中，封口后在3(TC下静置培养10d， 发酵结束后，细菌纤维素即附着在容器内壁表面合成。从内壁表面剥离后，将细菌纤维素异 型产品置于流动水浸泡洗涤1-2d后，再用0. lmol/LNaOH溶液浸泡l_2d除去培养基和菌体， 洗涤至中性(pH值约7.2)，然后冷冻干燥，结果如图4所示。
实施例4:
菌种及种子培养同卖施:例l，木葡糖酸醋杆菌种子以5-20%(v/v)的接种量接入装有300mL HS发酵培养基的三角瓶中，摇匀后倒入V形发酵容器中，封口后在30。C下静置培养10d，发 酵结束后，细菌纤维素即附着在容器内壁表面合成。从内壁表面剥离后，将细菌纤维素异型 产品置于流动水浸泡洗涤1-2d后，再用0. lmol/LNaOH溶液浸泡1-2d除去培养基和菌体，洗 涤至中性(pH值约7.2)，然后冷冻干燥。
权利要求
1. 微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法，其特征在于以木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.1812为生产菌株，具有氧渗透功能的材料为模具，培养基为原料，通过菌种培养、发酵、洗涤和干燥制备细菌纤维素异型产品，具体方法是①菌种培养将一环或两环活化的木葡糖酸醋杆菌CGMCC No.1.1812斜面种子，接入HS种子培养基中，30℃条件下160r/min振荡培养24h；②发酵以具有氧渗透能力的材料作为封闭异型发酵模具(3)(同时作为发酵容器，类似注塑模具，留有培养基注入口，以手型为例)，即以5-20％(v/v)的接种量接入装有HS发酵培养基(4)的异型发酵模具(3)中，异型发酵模具(3)直接热封口(1)或用胶塞及其它封口物密封后，经30℃静置培养5-10d，细菌纤维素即附着在模具(3)的内表面合成，经分离，得到细菌纤维素异型产品；或将具有氧渗透能力的模具(2)(同样以手型为例)置于发酵容器(5)中，该发酵容器(5)可以选自三角瓶、烧杯、广口瓶或发酵罐等，发酵容器(5)中装有HS发酵培养基(3)，具有渗氧功能的模具(2)与空气(1)相通，经30℃静置培养5-10d，细菌纤维素即附着在模具外表面合成，经分离，从模具(2)外即可剥离细菌纤维素异型产品；③洗涤和干燥为除去上述发酵法制备的细菌纤维素异型产品上的培养基和菌体，以流动水浸泡洗涤处理1-2d后，再经0.1mol/L的NaOH溶液浸泡1-2d后洗涤至中性，然后冷冻干燥或热风干燥，即可得细菌纤维素异型产品。
2. 按照权利要求l所述的微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法，其特征在于模具为具有渗氧功能的管材，选自PVC材料或硅胶材料，从而不需要额外供给氧气，工艺简单，造价较低。
3. 按照权利要求l所述的微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法，其特征在于异型发酵容器的形状为正方形、圆形、手形、V形等各种规则或不规则形状。
4 拔昭拟宋ll亜步1断汰的掛A-物^缺亩拔/ar4勿AR&细苗^P維妄旦刑;fe且的生ll夂卡、汰其特征在于异型产品的形状、大小和厚度可控，可以根据目的产品的三维尺寸，即制作出相应模具，从而制备相应细菌纤维素异型产品。
5. 按照权利要求l所述的微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法，其特征在于异型产品形状可为中空。
6. 按照权利要求l所述的微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法，其特征在于发酵时静置培养5-10d。
7. 按照权利要求1所述的微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法，其特征在于洗涤和干燥时，以流动水浸泡洗涤处理1-2d后，再经0. lmol/L的Na0H溶液浸泡l-2d后洗涤至中性，然后干燥。
全文摘要
本发明公开了微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法，属于生物领域，涉及微生物发酵直接生物合成细菌纤维素异型产品的制备方法，特别涉及以木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.1812、具有氧渗透功能的材料为模具和培养基为原料通过菌种培养、发酵、洗涤和干燥制备细菌纤维素异型产品。本发明的方法工艺简单，利用微生物技术直接合成不同形状的产品，造价较低。该方法制备的细菌纤维素异型产品其形状和厚度具有可控性，同时具有良好的拉伸性能和生物相容性，不仅可作为食品包装材料，还可作为组织工程支架材料，具有良好的应用前景。
文档编号C12P19/00GK101487033SQ20091006791
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月23日 优先权日2009年2月23日
发明者张桂才, 朱会霞, 飞 李, 杨洪江, 谭之磊, 贾原媛, 贾士儒 申请人:天津科技大学