专利名称：一种提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高体细胞胚发育同步化的方法。
背景技术：
水曲柳(Frax/"w wa"A/zwn'c" i^p"属木犀科白蜡树属，是我国东北重要的 珍贵硬阔树种之一。其树干通直，树龄长，木材材质优良，纹理美观，广泛应 用于军工、建筑、机械、航空、车辆、居室装修、运动器械制造等方面。水曲 柳种子具有深休眠特性，利用传统的种子繁殖苗木存在种子处理时间长、幼苗 成型慢，繁殖周期长等问题，很难在短时间内得到大量的、具有特定优良性状 的水曲柳优质苗木。植物组织培养技术中的体细胞胚胎发育技术以其繁殖数量 大、繁殖速度快、后代遗传性状稳定等优点受到人们的青睐，水曲柳体细胞胚 胎发育技术为解决水曲柳种子匮乏和水曲柳优良品系种质保存的问题提供了 一个重要的方法和手段。
目前，水曲柳体细胞胚胎发育技术中存在严重的体细胞胚胎发育不同步 化，即体细胞胚发育阶段不一致、体细胞胚大小差异很大，体细胞胚发育的一
致性差(小于7%),导致体细胞胚再生植株的存活率低(小于12%);而且存在利
用化学调控，导致体细胞胚后期发育不正常、体细胞胚畸形(高达75%)的问题， 无法实现水曲柳体细胞胚的工厂化和自动化生产，不能满足大面积造林的需要。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有水曲柳体细胞胚胎发育技术中存在体细胞 胚胎发育不同步化，体细胞胚发育的一致性差，导致体细胞胚再生植株的存活 率低以及利用化学调控，导致体细胞胚畸形率高的问题，而提供的一种提高水 曲柳体细胞胚发育同步化的方法。
提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法按以下步骤实现 一、将水曲柳外
植体接种于体细胞胚诱导培养基中，在温度为22 30°C、湿度为60% 70% 的无光照条件下培养至得到球形体细胞胚；二、将球形体细胞胚接种于同步化调控培养基中，在温度为22 30。C、湿度为60% 70%、每20 30天更换新 鲜同步化调控培养基的无光照条件下培养40 60天，得成熟体细胞胚；三、
将成熟体细胞胚从外植体上剥离出来后置于无菌的空培养皿中，在温度为 22 30°C、湿度为60% 70%的自然光照条件下干燥10 30min，然后接种于 萌发培养基中，在温度为22 3(TC、湿度为60°/。 70%、每天光照14 18h、 光照强度为1500 2000Lux、每20 30天更换新鲜萌发培养基的条件下培养 60 80天，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳体细胞胚发育同步化*,其中 步骤一中体细胞胚诱导培养基是以MS1/2培养基为基本培养基，且每1L体细 胞胚诱导培养基中还包含400 700mg的酸水解络蛋白、40000 70000mg的 蔗糖、1.0 1.5mg的奈乙酸、0.1 0.5mg的6-苄基氨基嘌呤和6000 7000mg 的琼脂，pH值为5.8;步骤二中同步化调控培养基是以MS1/2培养基为基本 培养基，且每1L同步化调控培养基中还包含20000 50000mg的蔗糖和6000 7000mg的琼脂，pH值为5.8;步骤三中萌发培养基是以MS1/2培养基为基本 培养基，且每1L萌发培养基中还包含20000 25000mg的蔗糖、100 200mg 的酸水解络蛋白、0.01 0.05mg的奈乙酸和6000 7000mg的琼脂，pH值为 5.8。
本发明成本低、操作简单，通过调节同步化调控培养基中的蔗糖浓度，可 调节培养基的渗透压，进而实现对水曲柳体细胞胚同步化发育的物理调控，避 免了化学调控可能带来的体细胞胚后期发育不正常、体细胞胚畸形的问题，使 体细胞胚畸形率降低到50%以下，体细胞胚发育的一致性达80%以上；本发 明采用的干燥可提高水曲柳体细胞胚再生植株的存活率，存活率高达64% 81%，并且干燥后的体细胞胚萌发后其植株抗性明显增强，移栽到土壤介质中， 则90%以上均可成活，且后期生长几乎不受影响。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法按以 下步骤实现 一、将水曲柳外植体接种于体细胞胚诱导培养基中，在温度为
22 30°C、湿度为60% 70%的无光照条件下培养至得到球形体细胞胚；二、 将球形体细胞胚接种于同步化调控培养基中，在温度为22 30°C、湿度为 60% 70%、每20 30天更换新鲜同步化调控培养基的无光照条件下培养40 60天，得成熟体细胞胚；三、将成熟体细胞胚从外植体上剥离出来后置于无
菌的空培养皿中，在温度为22 30°C、湿度为60% 70%的自然光照条件下 干燥10 30min，然后接种于萌发培养基中，在温度为22 3(TC、湿度为60% 70%、每天光照14 18h、光照强度为1500 2000Lux、每20 30天更换新鲜 萌发培养基的条件下培养60 80天，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳体 细胞胚发育同步化；其中步骤一中体细胞胚诱导培养基是以MS1/2培养基为 基本培养基，且每1L体细胞胚诱导培养基中还包含400 700mg的酸水解络 蛋白、40000 70000mg的蔗糖、1.0 1.5mg的奈乙酸、0.1 0.5mg的 氨基嘌呤和6000 7000mg的琼脂，pH值为5.8;步骤二中同步化调控培养基 是以MSl/2培养基为基本培养基，且每1L同步化调控培养基中还包含20000 50000mg的蔗糖和6000 7000mg的琼脂，pH值为5.8;步骤三中萌发培养基 是以MS1/2培养基为基本培养基，且每1L萌发培养基中还包含20000 25000mg的蔗糖、100 200mg的酸水解络蛋白、0.01 0.05mg的奈乙酸和 6000 7000mg的琼脂，pH值为5.8。
本实施方式步骤一中是将水曲柳种胚上的胚根和胚轴切去后取单片子叶 做为水曲柳外植体。
本实施方式步骤一中MS1/2培养基为所有元素含量都减半的MS培养基。 本实施方式步骤一中体细胞胚诱导培养基经过12rC灭菌20min，自然冷却。
本实施方式步骤二中通过调节同步化调控培养基中的蔗糖浓度，可调节培 养基的渗透压，进而实现对水曲柳体细胞胚同步化发育的物理调控，体细胞胚 发育的一致性达80%以上，体细胞胚畸形率降低到50%以下。
本实施方式步骤三中干燥是在无菌的超净工作台上进行，且无菌空培养皿 中的直径为9.5厘米，每个培养皿中放10 20个体细胞胚。
本实施方式歩骤三中干燥可提高水曲柳体细胞胚再生植株的存活率，存活 率高达64% 81%，并且干燥后的体细胞胚萌发后其植株抗性明显增强，移栽 到土壤介质中，则90%以上均可成活，且后期生长几乎不受影响。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同是步骤一中在温度 为25°C、湿度为65%的无光照条件下培养。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二的不同是步骤二中在温度
为25。C、湿度为65%、每25天更换新鲜同步化调控培养基的无光照条件下培 养50天。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三的不同是步骤三中在温度
为25°C、湿度为65%的自然光照条件下干燥20min。其它步骤及参数与具体 实施方式三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
四的不同是步骤三中在温度
为25。C、湿度为65%、每天光照16h、光照强度为1800Lux、每25天更换新 鲜萌发培养基的条件下培养75天。其它步骤及参数与具体实施方式
四相同。
具体实施方式
六本实施方式提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法按以 下步骤实现 一、将水曲柳外植体接种于体细胞胚诱导培养基中，在温度为
25°C、湿度为70%的无光照条件下培养至得到球形体细胞胚；二、将球形体细 胞胚接种于同步化调控培养基中，在温度为25t:、湿度为70%、每30天更换 新鲜同步化调控培养基的无光照条件下培养60天，得成熟体细胞胚；三、将 成熟体细胞胚从外植体上剥离出来后置于无菌的空培养皿中，在温度为28°C、 湿度为60。/。的自然光照条件下干燥10min，然后接种于萌发培养基中，在温度 为25。C、湿度为70%、每天光照16h、光照强度为2000Lux、每30天更换新 鲜萌发培养基的条件下培养70天，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳体细 胞胚发育同步化；其中步骤一中体细胞胚诱导培养基是以MS1/2培养基为基 本培养基，且每1L体细胞胚诱导培养基中还包含400 700mg的酸水解络蛋 白、40000 70000mg的蔗糖、1.0 1.5mg的奈乙酸、0.1 0.5mg的6-节基氨 基嘌呤和6000 7000mg的琼脂，pH值为5.8;步骤二中同步化调控培养基是 以MS1/2培养基为基本培养基，且每1L同步化调控培养基中还包含20000 50000mg的蔗糖和6000 7000mg的琼脂，pH值为5.8;步骤三中萌发培养基 是以MS1/2培养基为基本培养基，且每1L萌发培养基中还包含20000 25000mg的蔗糖、100 200mg的酸水解络蛋白、0.01 0.()5mg的奈乙酸和 6000 7000mg的琼脂，pH值为5.8。
本实施方式中体细胞胚发育的一致性达81%，体细胞胚畸形率为10%，水曲柳小植株的存活率达80.2%，将小植株移栽到土壤介质中92%可成活。
具体实施方式
七本实施方式提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法按以 下步骤实现 一、将水曲柳外植体接种于体细胞胚诱导培养基中，在温度为
25°C、湿度为70%的无光照条件下培养至得到球形体细胞胚；二、将球形体细 胞胚接种于同步化调控培养基中，在温度为25t:、湿度为60%、每30天更换 新鲜同步化调控培养基的无光照条件下培养60天，得成熟体细胞胚；三、将 成熟体细胞胚从外植体上剥离出来后置于无菌的空培养皿中，在温度为25°C、 湿度为70n/。的自然光照条件下干燥30min，然后接种于萌发培养基中，在温度 为25"、湿度为60%、每天光照16h、光照强度为2000Lux、每20天更换新 鲜萌发培养基的条件下培养70天，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳体细 胞胚发育同步化；其中步骤一中体细胞胚诱导培养基是以MS1/2培养基为基 本培养基，且每1L体细胞胚诱导培养基中还包含400 700mg的酸水解络蛋 白、40000 70000mg的蔗糖、L0 1.5mg的奈乙酸、0.1 0.5mg的6-节基氨 基嘌呤和6000 7000mg的琼脂，pH值为5.8;步骤二中同步化调控培养基是 以MS1/2培养基为基本培养基，且每1L同步化调控培养基中还包含20000 50000mg的蔗糖和6000 7000mg的琼脂，pH值为5.8;步骤三中萌发培养基 是以MS1/2培养基为基本培养基，且每1L萌发培养基中还包含20000 25000mg的蔗糖、100 200mg的酸水解络蛋白、0.01 0.05mg的奈乙酸和 6000 7000mg的琼脂，pH值为5.8。
本实施方式中体细胞胚发育的一致性达85%,体细胞胚畸形率为15%， 水曲柳小植株的存活率达70%，将小植株移栽到土壤介质中90%可成活。
权利要求
1、一种提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法，其特征在于提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法按以下步骤实现一、将水曲柳外植体接种于体细胞胚诱导培养基中，在温度为22～30℃、湿度为60％～70％的无光照条件下培养至得到球形体细胞胚；二、将球形体细胞胚接种于同步化调控培养基中，在温度为22～30℃、湿度为60％～70％、每20～30天更换新鲜同步化调控培养基的无光照条件下培养40～60天，得成熟体细胞胚；三、将成熟体细胞胚从外植体上剥离出来后置于无菌的空培养皿中，在温度为22～30℃、湿度为60％～70％的自然光照条件下干燥10～30min，然后接种于萌发培养基中，在温度为22～30℃、湿度为60％～70％、每天光照14～18h、光照强度为1500～2000Lux、每20～30天更换新鲜萌发培养基的条件下培养60～80天，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳体细胞胚发育同步化；其中步骤一中体细胞胚诱导培养基是以MS1/2培养基为基本培养基，且每1L体细胞胚诱导培养基中还包含400～700mg的酸水解络蛋白、40000～70000mg的蔗糖、1.0～1.5mg的奈乙酸、0.1～0.5mg的6-苄基氨基嘌呤和6000～7000mg的琼脂，pH值为5.8；步骤二中同步化调控培养基是以MS1/2培养基为基本培养基，且每1L同步化调控培养基中还包含20000～50000mg的蔗糖和6000～7000mg的琼脂，pH值为5.8；步骤三中萌发培养基是以MS1/2培养基为基本培养基，且每1L萌发培养基中还包含20000～25000mg的蔗糖、100～200mg的酸水解络蛋白、0.01～0.05mg的奈乙酸和6000～7000mg的琼脂，pH值为5.8。
2、 根据权利要求1所述的一种提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法， 其特征在于步骤一中在温度为25°C、湿度为65%的无光照条件下培养。
3、 根据权利要求2所述的一种提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法， 其特征在于步骤二中在温度为25。C、湿度为65%、每25天更换新鲜同步化调 控培养基的无光照条件下培养50天。
4、 根据权利要求3所述的一种提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法， 其特征在于步骤三中在温度为25°C、湿度为65%的自然光照条件下干燥 20min。
5、根据权利要求4所述的一种提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法，其特征在于步骤三中在温度为25°C、湿度为65%、每天光照16h、光照强度为 1800Lux、每25天更换新鲜萌发培养基的条件下培养75天。
全文摘要
一种提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法，它涉及一种提高体细胞胚发育同步化的方法。它解决了现有水曲柳体细胞胚胎发育技术中存在体细胞胚胎发育不同步化，体细胞胚发育的一致性差，导致体细胞胚再生植株的存活率低以及利用化学调控，导致体细胞胚畸形率高的问题。方法一、外植体接种于体细胞胚诱导培养基中培养，得球形体细胞胚；二、球形体细胞胚接种于同步化调控培养基中培养，得成熟体细胞胚；三、成熟体细胞胚干燥后接种于萌发培养基中培养，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳体细胞胚发育同步化。本发明实现了对水曲柳体细胞胚同步化发育的物理调控，使体细胞胚畸形率降低到50％以下，体细胞胚发育的一致性达80％以上，存活率高达64％～81％。
文档编号C12N5/04GK101503671SQ20091007155
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月16日 优先权日2009年3月16日
发明者宇 张, 玲 杨, 沈海龙 申请人:东北林业大学;沈海龙;杨 玲