专利名称：一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法
技术领域：
本发明涉及一种黄瓜枯萎病菌检测方法。
背景技术：
黄瓜枯萎病是由黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum，也称为尖孢镰刀菌)寄生 引起的一种世界性土传真菌病害，侵染广泛，病原菌从根部侵入，引起维管束病害，造成植 株枯死，在植株的全生育期均可发生，尤其在成株期发病严重。 黄瓜枯萎病尤为严重，一旦发病，难以根除，并随着连作年份的增加，发病率升高， 是一种顽固的土传病害，病田 一般减产20 % 30 % ，严重田块可达50 % 60 % ，甚至绝产， 是目前造成黄瓜生产大面积减产的主要原因。因此，及早对枯萎病菌侵染初期作出检测和 诊断，建立快速、准确的枯萎病早期预警诊断方法具有重要的理论和应用价值，对及时有效 控制病原菌的传播和病害流行以及及时有效防治其危害具有重要意义。
目前，黄瓜枯萎病菌分子检测方法的研究，陈微等人采用PCR-RFLP和巢式PCR方 法，能够从人工接种感病黄瓜苗上检测到病原菌的存在，PCR-RFLP方法所用引物为真菌通 用引物，特异性不强，而且需将PCR产物进行限制性酶切分析，方法繁琐，特异性不强；巢式 PCR方法需要2步PCR扩增，增加了污染机会，而且没有对两种方法的灵敏性进行分析。
发明内容
本发明目的是为了解决现有黄瓜枯萎病菌分子检测中采用PCR-RFLP方法存在真 菌通用引物特异性不强及方法繁琐，而采用巢式PCR方法需要2步PCR扩增，易污染的问 题，而提供一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法。 黄瓜枯萎病菌分子检测方法按以下步骤实现一、根据黄瓜枯萎病菌的核糖体 内转录间隔区(ITS)DNA序列的特性，设计对枯萎病菌具特异扩增作用的一对引物Fc-l 和Fc-2 ; 二、提取染病样品基因组DNA，采用引物Fc-1和Fc_2对基因组DNA进行PCR扩 增；三、将PCR扩增产物在含GelRed染色剂的1.0%琼脂糖凝胶上用1XTAE缓冲液进 行电泳，电泳结束后用凝胶成像系统分析，在315bp处出现特异条带，则染病样品带有黄 瓜枯萎病菌，即完成检测；其中步骤一中Fc-1为5—-CATACCACTTGTTGCCTC-3—， Fc_2为 5—-ATTAACGCGAGTCCCACC-3—;步骤二中PCR扩增反应体系25 ii 1反应体系，由10 XPCR 缓冲液2. 5 ii 1 (200mM Tris-HCl pH 8.4，200mM KCl， 100mM(NH4)2804， 20mM MgS04) ， 2. 5mM d證2ii 1，10iiM弓l物Fc-llii 1、10iiM弓l物Fc-21ii l，10ng/ii 1基因组DNA 1 ii 1， Easy Tag DNAPolymerase 1U和余量无菌去离子水组成；步骤二中PCR扩增条件为94。C预变性 5min ;然后94。C变性30s， 60。C退火lmin， 72。C延伸lmin，共40个循环，最后72。C延伸10min 补齐末端，扩增完成；步骤三中电泳的电压为4 5V/cm。 本发明黄瓜枯萎病菌分子检测方法中，选取具有特异性的黄瓜枯萎病菌的核糖体 内转录间隔区DNA序列，设计的引物Fc-l和Fc-2具有高度特异性，表现为该引物仅对黄瓜 枯萎病菌具特异扩增产物，对其他33种病原真菌和细菌均无扩增产物。本发明中PCR方法的灵敏性高，表现为该PCR方法对枯萎病菌基因组DNA的最低检出量为10fg，对土壤中病菌 孢子的检出量为1000个孢子/克土壤。本发明中PCR方法的快速性表现为仅需1步反应 在2h内就可获得检测结果，快速、简单，不易污染。本发明中PCR可以从无症状早期感病植 株中检测到病原菌，重复性和稳定性高，可以作为黄瓜枯萎病早期预警诊断方法进行实际 应用。
图1为具体实施方式
一中对引物Fc-l和Fc-2特异性检测的电泳图，其中l泳 道为100_bp DNA ladder marker (100_bp DNA分子量标准)，2-5泳道为F. oxysporum f. sp. cucumerineum isolates (黄瓜枯妻病菌)，6泳道为F. avenaceum(小麦根腐病菌)， 7泳道为F. proliferatum(水稻恶苗病菌)，8泳道为F. solani (大豆根腐病菌)，9泳 道为F. poae(小麦根腐病菌)，10泳道为Botrytiscinerea(番茄灰霉病菌)，ll泳道为 Alternaria solani (番茄早疫病菌)，12泳道为Ascochyta citrallina (黄瓜蔓枯病菌)， 13泳道为S印toria lycopersici (番莉斑枯病)，14泳道为Pythium即hanidermatum(黄 瓜猝倒病菌)，15泳道为Fusarium spp.(大豆根腐病菌)，16-17泳道为Rhizoctonia solani (黄瓜立枯病菌)，18泳道为Cladosporium fulvum(番茄叶霉病菌)，19泳道为 Sclerotinia sclerotiorum(大豆菌核病菌)，20泳道为F. graminearum(小麦赤霉病菌)， 21泳道为Verticilliumdahliae(葵花黄萎病菌)，22泳道为negative control (阴性对 昭). 图2为具体实施方式
一中对引物Fc-1和Fc-2特异性检测的电泳图，其中1泳道 为100-bp DNA ladder marker (100-bp DNA分子量标准)，2-3泳道为F. oxysporum f. sp. cucumerineum isolates(黄瓜枯妻病菌)，4泳道为F. moniliforme(水稻恶苗病菌)， 5泳道为F. solani (菜豆根腐病菌)，6泳道为F. equiseti (菜豆叶霉病菌)，7泳道为 F. vasinfectum(辣椒茎枯病菌)，8泳道为F. oxysporum f. sp. soybean (大豆根腐病菌)， 9泳道为Phytophthora melonis (甜瓜疫病菌)，10泳道为Bacillus subtilus B29 (枯草 芽孢杆菌)，11泳道为E. coliJM109 (大肠杆菌)，12泳道为Bacillus amyloliquefaciens TF28 (解淀粉芽孢杆菌)，13-14泳道为F. nivale (大麦苗枯病菌)，15泳道为 Colletortichumlindemuthia皿m(菜豆炭疽病菌)，16泳道为Sphacelotheca reiliana(玉 米丝黑穗病菌)，17泳道为Pyricularia oryzae (水稻稻瘟病菌)，18泳道为Botrytis ci證ea (黄瓜灰霉病菌)，19泳道为Alternaria c腦merina (黄瓜黑斑病菌)，20泳道为 Alternaria d塞i (胡萝卜黑斑病菌)，21泳道为Colletotrichum lagenari咖(黄瓜炭疽 病菌)，22-23泳道为Pythium spp.(大豆根腐病菌)，24泳道为negativecontrol (阴性对 昭). 图3为具体实施方式
一中PCR方法对枯萎病菌基因组DNA的最低检出量的灵敏性 检测电泳图，其中l泳道为100-bp DNA ladder marker (100-bp DNA分子量标准)，2-9泳 道为PCR products using DNA at concentrations of 10ng， lng， 100pg， 10pg， lpg， 100fg， 10fg， Ifg (2-9泳道为模板DAN浓度分别为10ng， lng， 100pg， 10pg， lpg， 100fg， 10fg， lfg的 PCR扩增产物)，10泳道为negative control (阴性对照); 图4为具体实施方式
一中PCR方法对土壤中病菌孢子的检出量的灵敏性检测电
4泳图，其中1泳道为negative control (阴性对照)，2-6泳道为numbers ofspores were 10， 102， 103， 104 and 105， respectively (2-6泳道分别为孢子数为10， 102， 103， 104和105的 PCR扩增产物)，7泳道为positive control (阳性对照)，8泳道为100-bp DNA ladder marker (100-bp DNA分子量标准)； 图5为具体实施方式
四中对自然感病黄瓜根部的黄瓜枯萎病菌的PCR扩增检测 图，其中l泳道为100-bp DNA ladder marker (100-bp DNA分子量标准)，2泳道为positive control (阳性对照)，3泳道为negative control (阴性对照)，4泳道为healthy cucumber root(健康黄瓜根部)，5泳道为healthy cucumber stem(健康黄瓜茎部)，6泳道为 infected cucumber stem (Chengxi)(城西村感病黄瓜蓬部)，7泳道为infected cucumber root(Chengxi)(城西村感病黄瓜根部)，8泳道为infected cucumber stem(Xuejia)(薛 家感病黄瓜茎部)，9泳道为infectedcucumber root(Xuejia)(薛家感病黄瓜根部)，10 泳道为infected cucumber stem(Jianguo)(建国村感病黄瓜蓬部)，11泳道为infected cucumber root (Jianguo)(建国村感病黄瓜根部)； 图6为具体实施方式
四中对自然感病土壤的黄瓜枯萎病菌的PCR扩增检测图， 其中1泳道为100-bp DNA ladder marker (100-bp DNA分子量标准)，2泳道为positive control (阳性对照)，3泳道为rhizosphere soil of infectedcucumber (Chengxi)(城西 村感病黄瓜根部病土 ) ， 4泳道为rhizosphere soil ofinfected cucumber (Xuejia)(薛家 感病黄瓜根部病土 ) ， 5泳道为rhizosphere soilof infected cucumber (Jianguo)(建国 村感病黄瓜根部病土 ) ， 6泳道为rhizosphere soil of healthy cucumber (Xuejia)(薛家 健康黄瓜根部土壤)，7泳道为negative control (阴性对照)； 图7为具体实施方式
四中对人工接种不同时期样品黄瓜根部枯萎病菌的PCR扩 增检测图，其中1泳道为100-bp DNA ladder marker (100-bp DNA分子量标准)，2泳道 为positive control (阳性对照)，3泳道为root 1 days afterinoculation(接禾中1天 的根部样品)，4泳道为root 3 days after inoculation(接3天的根部样品)，5泳道为 root 5 days after inoculation (接禾中5天的根部样品)，6泳道为root 7 days after inoculation(接禾中7天的根部样品)，7泳道为root 9days after inoculation (接禾中9天 的根部样品)，8泳道为root 15 days afterinoculation (接种15天的根部样品)，9泳道 为root 21 days after inoculation (接禾中21天的根部样品)，10泳道为root 30 days after inoculation (接种30天的根部样品)，11泳道为healthy root(健康的根)，12泳 道为negative control (阴性对照)。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一 本实施方式黄瓜枯萎病菌分子检测方法按以下步骤实现 一、根据黄瓜枯萎病菌的核糖体内转录间隔区(ITS)DNA序列的特性，设计对枯萎病菌 具特异扩增作用的一对引物Fc-l和Fc-2;二、提取染病样品基因组DNA，采用引物Fc-l 和Fc-2对基因组DNA进行PCR扩增；三、将PCR扩增产物在含GelRed染色剂的1. 0 % 琼脂糖凝胶上用1XTAE缓冲液进行电泳，电泳结束后用凝胶成像系统分析，在315bp处出现特异条带，则染病样品带有黄瓜枯萎病菌，即完成检测；其中步骤一中Fc-1为 5—-CATACCACTTGTTGCCTC-3—， Fc_2为5—-ATTAACGCGAGTCCCACC-3—;步骤二中PCR扩增反 应体系25ii 1反应体系，由IOXPCR缓冲液2. 5ii 1(200mM Tris-HCl pH 8.4，200mM KCl， 100mM(NH4)2S04，20mM MgS04) ， 2. 5mMdNTP 2 ii 1， 10 ii M引物Fc-ll ii 1、10 ii M引物Fc-21 ii 1， 10ng/ii 1基因组DNA 1 iil， Easy Tag DNA Polymerase 1U和余量无菌去离子水组成；步骤 二中PCR扩增条件为94t:预变性5min ;然后94"C变性30s， 6(TC退火lmin， 72"C延伸lmin， 共40个循环，最后72t:延伸10min补齐末端，扩增完成；步骤三中电泳的电压为4 5V/ cm。 本实施方式中的引物Fc-l和Fc-2由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
本实施方式中引物Fc-l和Fc-2的特异性检测结果如图1和图2所示，引物Fc-l 和Fc-2具有高度特异性，该引物仅对黄瓜枯萎病菌具特异扩增产物，对其他33种病原真菌 和细菌均无扩增产物。 本实施方式步骤二中染病样品为自然感病黄瓜的根部、人工接种不同时期样品黄 瓜根部或自然感病土壤。 本实施方式步骤三中1. 0%琼脂糖凝胶，即凝胶中琼脂糖的质量浓度为1. 0%。
本实施方式中进行PCR扩增，其灵敏性检测结果如图3和图4所示，本实施方式中 PCR方法的灵敏性高，该PCR方法对枯萎病菌基因组DNA的最低检出量为10fg(图3)，对土 壤中病菌孢子的检出量为1000个孢子/克土壤(图4)。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中黄瓜枯萎病菌 的核糖体内转录间隔区(ITS)DNA序列为 cataccactt gttgcctcgg cggatcagcc cgctcccggt aaaacgggac ggcccgccag
aggaccccta aactctgttt ctatatgtaa cttctgagta aaaccataaa taaatcaaaa
ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcaaa atgcgataag
taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgcca
gtattctggc gggcatgcct gttcgagcgt catttcaacc ctcaagcaca gcttggtgtt
gggactcgcg ttaat。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤二中提取染病 样品基因组DNA是将20mg染病样品置于-7(TC冷冻3h，取出后放入灭菌研钵中进行研磨， 加入500ii 1的TES缓冲液(100mM Tris，pH8. 0， 10mMEDTA， 2% SDS， 100 ii g蛋白酶K)，然后 将溶液转入离心管中放入6(TC水浴中温育lh，取出后加入140 iil的5M NaCl和65 yl的 10% CTAB之后放入65。C水浴中温育10min，再加入700 yl氯仿在(TC放置30min，取出后 4t:下离心10min，将上层溶液移到新的灭菌的离心管中，加入RNA酶5iil，37t:温育lh后 加入510 iil异丙醇置于冰上30min沉淀DNA，然后在4°C 、 12000r/min的条件下离心10min， 收集沉淀，用质量浓度为70%冰乙醇洗涤1次，吹干后溶于无菌去离子水中，稀释DNA终浓 度为10ng/iU。其它步骤及参数与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式黄瓜枯萎病菌分子检测方法按以下步骤实现一、 根据黄瓜枯萎病菌的核糖体内转录间隔区(ITS)DNA序列的特性，设计对枯萎病菌具特 异扩增作用的一对引物Fc-l和Fc-2 ;二、提取染病样品基因组DNA，然后采用引物Fc-l 和Fc-2对黄瓜根部基因组DNA进行PCR扩增；三、将PCR扩增产物在含GelRed染色剂的1.0%琼脂糖凝胶上用1XTAE缓冲液进行电泳，电泳结束后用凝胶成像系统分析，在 315bp处出现特异条带，则染病样品带有黄瓜枯萎病菌，即完成检测；其中步骤一中Fc-1为 5—-CATACCACTTGTTGCCTC-3— ， Fc_2为5—-ATTAACGCGAGTCCCACC-3—;步骤二中PCR扩增反应 体系25ii 1反应体系，依次加入10XPCR缓冲液2. 5ii l(200mM Tris-HCl pH 8.4，200mM KCl， 100mM(NH4)2S04，20mM MgS04)，2.5mM dNTP 2 ii 1， 10 ii M弓l物Fc-l禾卩Fc—2各1 ii 1， 10ng/ Pl基因组DNA liil， Easy Tag DNA Polymerase 1U，然后用无菌去离子水补齐至25 ii 1 ; 步骤二中PCR扩增条件为94t:预变性5min ;然后94"变性30sec，6(TC退火lmin，72t:延 伸lmin，共40个循环，最后一循环，72t:延伸10min补齐末端，扩增完成；步骤三中电泳的 电压为5V/cm。 本实施方式中染病样品为提取自然感病黄瓜根部；黄瓜枯萎病菌分子检测的结果 如图5所示，在315bp处出现特异条带，自然感病黄瓜的根部带有枯萎病菌。
本实施方式中染病样品为自然感病土壤；黄瓜枯萎病菌分子检测的结果如图6所 示，在315bp处出现特异条带，自然感病土壤带有枯萎病菌。 本实施方式中染病样品为人工接种不同时期样品黄瓜根部；黄瓜枯萎病菌分子检 测的结果如图7所示，在315bp处出现特异条带，人工接种不同时期样品黄瓜根部带有枯萎病菌。序列表〈110〉黑龙江省科学院微生物研究所〈120〉 一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法〈160>3〈210>1〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉对枯萎病菌具特异扩增作用引物Fc-l的序列。〈400>1cataccactt gttgcctc 18〈210>2〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉对枯萎病菌具特异扩增作用引物Fc-2的序列。〈400>2attaacgcga gtcccacc 19〈210>3〈211>315〈212>DNA
7
〈213〉黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum) 〈220〉 〈223〉黄瓜枯萎病菌的核糖体内转录间隔区(ITS)DNA序列。 〈400>3 cataccactt gttgcctcgg cggatcagcc cgctcccggt aaaacgggac ggcccgccag 60 aggaccccta aactctgttt ctatatgtaa cttctgagta aaaccataaa taaatcaaaa 120 ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcaaa atgcgataag 180 taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgcca 240 gtattctggc gggcatgcct gttcgagcgt catttcaacc ctcaagcaca gcttggtgtt 300 gggactcgcg ttaat 31权利要求
一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法，其特征在于黄瓜枯萎病菌分子检测方法按以下步骤实现一、根据黄瓜枯萎病菌的核糖体内转录间隔区DNA序列的特性，设计对枯萎病菌具特异扩增作用的一对引物Fc-1和Fc-2；二、提取染病样品基因组DNA，采用引物Fc-1和Fc-2对基因组DNA进行PCR扩增；三、将PCR扩增产物在含GelRed染色剂的1.0％琼脂糖凝胶上用1×TAE缓冲液进行电泳，电泳结束后用凝胶成像系统分析，在315bp处出现特异条带，则染病样品带有黄瓜枯萎病菌，即完成检测；其中步骤一中Fc-1为5`-CATACCACTTGTTGCCTC-3`，Fc-2为5`-ATTAACGCGAGTCCCACC-3`；步骤二中PCR扩增反应体系25μl反应体系，由10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，10μM引物Fc-11μl、10μM引物Fc-21μl，10ng/μl基因组DNA1μl，Easy Tag DNA Polymerase 1U和余量无菌去离子水组成；步骤二中PCR扩增条件为94℃预变性5min；然后94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸10min补齐末端，扩增完成；步骤三中电泳的电压为4～5V/cm。
2. 根据权利要求1所述的一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法，其特征在于步骤一中黄瓜 枯萎病菌的核糖体内转录间隔区DNA序列为cataccactt gttgcctcgg cggatcagcc cgctcccggt aaaacgggac ggcccgccag aggaccccte ^ctctgttt ctetetgtea cttctgagte a^ccate^ te^tc^^ ctttc^c^ cggatctctt ggttctggca tcgatg^ga 3cgc3gca^ atgcgateag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgcca gtattctggc gggcatgcct gttcgagcgt catttcaacc ctcaagcaca gcttggtgtt gggactcgcg ttaat。
3. 根据权利要求1或2所述的一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法，其特征在于步骤二中 提取染病样品基因组DNA是将20mg染病样品置于-7(TC冷冻3h，取出后放入灭菌研钵中进 行研磨，加入500 iil的TES缓冲液，然后将溶液转入离心管中放入6(TC水浴中温育lh，取 出后加入140 iil的5M NaCl禾P 65 yl的10% CTAB之后放入65。C水浴中温育10min，再加 入700iU氯仿在Ot:放置30min，取出后fC下离心10min，将上层溶液移到新的灭菌的离 心管中，加入RNA酶5iU，37。C温育lh后加入510iU异丙醇置于冰上30min沉淀DNA，然 后在4°C、12000r/min的条件下离心10min，收集沉淀，用质量浓度为70%冰乙醇洗涤1次， 吹干后溶于无菌去离子水中，稀释DNA终浓度为10ng/iU。
全文摘要
一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法，它涉及一种黄瓜枯萎病菌检测方法。它解决了现有黄瓜枯萎病菌分子检测中采用PCR-RFLP方法存在真菌通用引物特异性不强及方法繁琐，而采用巢式PCR方法需要2步PCR扩增，易污染的问题。方法一、引物Fc-1和Fc-2；二、提取染病样品基因组DNA进行PCR扩增；三、将PCR扩增产物进行电泳，然后用凝胶成像系统分析，在315bp处出现特异条带，则染病样品带有黄瓜枯萎病菌，即完成检测。本发明引物Fc-1和Fc-2具有高度特异性，灵敏性高，仅需1步反应在2h内就可获得检测结果，快速、简单，不易污染。
文档编号C12Q1/68GK101698882SQ20091007319
公开日2010年4月28日 申请日期2009年11月12日 优先权日2009年11月12日
发明者孟利强, 张先成, 张淑梅, 李晶, 王玉霞, 赵晓宇 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所