专利名称：一种腈水合酶基因簇及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说涉及一种腈水合酶基因簇及其在丙烯 酰胺生产中的应用。
背景技术：
腈代谢酶系主要包括腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。在腈代谢酶系的参与 下，含腈代谢酶系的菌株可将毒性很强且难以降解的腈类转变为酰胺或羧酸加
以利用。其中，腈水合酶(Nitrile Hydratase，简称NHase， EC 4. 2. 1.84)可 以催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺，酰胺酶则进一步将丙烯酰胺催化水解生产丙 烯酸。由于腈水合酶催化丙烯腈生成丙烯酰胺的生物催化过程反应条件温和、 产率高、副产物少、产物的自聚损失少，环境污染小、生产成本低，而且具有 区域选择性、立体选择性和光激活性，近年来广泛用于生产丙烯酰胺，并将进 一步应用于其它多种氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。
能产生腈水合酶的微生物的分布相当广泛，如红球菌、诺卡氏菌、假诺卡 氏菌、棒状杆菌、假单胞菌、产碱杆菌或短杆菌等。在细菌以及高等的真核牛 物的遗传图谱屮，普遍存在着许多基因在染色体上成簇排列。基因簇的定义就 是编码不同蛋白的多个基因片段按照一定的顺序首尾相连的排列在一起，由一 个启动子启动他们的表达，表达的蛋白大多能相互调控，相互协作完成一系列 的代谢功能。而腈水合酶和酰胺酶通常就位于这样一个典型的基因簇上。
绿针假单胞菌B23的腈类化合物代谢基因编码五种蛋白的开放阅读框，依 次为酰胺酶基因、NHase ct亚基基因、0亚基基因、p47K基因和OrfE基因
(Nishiyama等，J. Bacteriol. ， 1991, 173: 2465~2472)。在被称为生产丙 烯酰胺的第三代生物催化剂的玫瑰红球菌Jl (处o^cocc^ /^^oc力roM Jl) 中不仅含有2种不同的腈水合酶，分别为高分子量腈水合酶(H-NHase， 520kDa
(千道尔顿))和低分子量腈水合酶(L-NHase， 130kDa)，而且两种腈水合酶基 因也都是以基因簇的形式出现(Komeck等，Biol. Chem. ， 1996， 271 (26): 15796 15802; Komeda等，Proc, Natl. Acad, Sci. USA， 1996， 93 (9): 4267 4272)。编码L-NHase的a 、 p亚基的下游1.9 kb (千碱基对)为编码酰胺酶的基因，而上游3.5kb区域内分别是负调控子和正调控子基因。编码
H-NHase的a 、 p亚基的上游4. 6kb区域至少还存在5个开放阅读框(0RF1 5)。 其中0RF1和0RF2是腈水合酶表达的正调控基因，0RF4 (即基因簇中的插入序 列IS1164)则参与金属离子的转运过程。在红球菌N-774中，也发现了酰胺酶 -腈水合酶基因簇，他们在同一个启动子的调控下启动(Hashimoto,等，Biosci Biotechnol Biochem， 1994， 58 (10): 1859~1865)。红球菌N-771的腈水合酶 基因簇包含6个基因，依次编码腈水合酶调控子2、腈水合酶调控子1、酰胺酶、 腈水合酶a亚基、腈水合酶P亚基和腈水合酶激活子(Nojiri等，J. Biochem. (Tokyo), 1999， 125 (4) :696 704)。玫瑰红球菌/ / o^cocc^ r力oobc/ /WAs M8 的腈水合酶基因簇依次编码腈水合酶正调控子l、腈水合酶调控子2、腈水合酶 P、 a亚基和腈水合酶激活子(Veiko等，Biotekhnologiia (Mosc.) ， 1995， 5， 3-5)。芽孢杆菌BR449的腈水合酶基因和酰胺酶基因同样是以基因簇的形式 存在，核苷酸测序发现6个开放阅读框，它们依次编码2个推定的未知蛋白、酰 胺酶、腈水合酶P与a亚基和1个推定的由101个氨基酸残基组成的小蛋白 pl2K;从编码区的间隔和方向上可以判断，酰胺酶、P亚基、a亚基和pl2K 的基因共转录(Kim等，Enzyme and Microb Technol， 2000， 27 (7) : 492 501)。 红球菌7 力oflbcoccM印.RHA1中的酰胺酶基因和腈水合酶基因也位于同一个大 基因簇上，且l皮质米立pRHL2携带(0kamoto et al. Molecular Microbiology, 2007， 65 (3)， 828 — 838)。
总之，在上述已经发现报道的腈水合酶和酰胺酶基因簇中，以玫瑰红球菌 Jl的低分子量腈水合酶基因簇、红球菌N-774的腈水合酶基因簇和芽孢杆菌 BR449为代表，酰胺酶基因和腈水合酶基因位于同一个基因簇上。而在玫瑰红 球菌Jl的高分子量腈水合酶基因簇和玫瑰红球菌M8中，腈水合酶基因和酰胺 酶基因不在同一个基因簇上。
发明内容
本发明目的在于提供一种腈水合酶基因簇。
本发明另一 目的是提供含有上述腈水合酶基因簇工程菌的构建方法。 本发明的还一目的是提供上述腈水合酶基因簇在丙烯酰胺生产中的应用。
实现本发明的技术方案如下
本发明一种腈水合酶基因簇"力^/^S^，具有序列表中SEQ ID NO: l所示的 核苷酸序列，共7935个碱基对。所述的腈水合酶基因簇来自红色红球菌处oabcoccw51 2T/6ar TH。
上述腈水合酶基因簇，具有/ 力Z^、 /7力W、 /7力W、 /7力"、T7力M和77力t共6个编 码基因
/7力^f立于基因簇核苷酸序列的第1025 — 2110位碱基处，长度为1086个碱基 对，编码腈水合酶调控蛋白NhtC，共361个氨基酸(SEQ ID NO: 2);
"力t/ 位于基因簇核苷酸序列的第2161 — 2607位碱基处，长度为447个碱基 对，编码腈水合酶调控蛋白NhtD，共148个氨基酸(SEQ ID NO: 3);
/7力W位于基因簇核苷酸序列的第2898 — 3188位碱基处，长度为291个碱基 对，编码腈水合酶调控蛋白NhtE，共96个氨基酸(SEQ ID NO: 4);
/7力W位于基因簇核苷酸序列的第4755 — 5444位碱基处，长度为690个碱基 对，编码腈水合酶13亚基NhtB，共229个氨基酸(SEQ ID NO: 5);
/7力M位于基因簇核苷酸序列的第5458 —6069位碱基处，长度为612个碱基 对，编码腈水合酶a亚基NhtA，共203个氨基酸(SEQ ID NO: 6);
T7力"位于基因簇核苷酸序列的第6066 — 6380位碱基处，长度为315个碱基 对，编码腈水合酶调控蛋白NhtG，共104个氨基酸(SEQ ID NO: 7)。
上述腈水合酶基因簇中所述的基因"力Z^、 /7力W、 /7力W、 T7力"、/7力M和/7力W
共用一个启动子，其中77力t厨t]/ 力M分别表达腈水合酶(/7M别)的P亚基和a亚 基，而77/ W、/7力t从77力^Sl"力t紛别表达腈水合酶NhtBA的正调控蛋白NhtC、NhtD、 NhtE或NhtG。调控蛋白与腈水合酶的共表达可以显著提高腈水合酶的表达活性。
上述腈水合酶基因簇中所述的腈水合酶NhtBA由J3亚基NhtB和ct亚基NhtA组 成，其中J3亚基NhtB具有SEQIDN0: 5所示的氨基酸序列，a亚基NhtA具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。
含有本发明腈水合酶基因簇的表达载体或基因工程菌均属于本发明的保护 范围。
含有上述腈水合酶基因簇工程菌的构建方法，就是将含有上述腈水合酶基 因簇的重组表达载体导入宿主；或者直接将上述腈水合酶编码基因或基因簇插 入表达宿主的染色体即可。
所述的宿主是指大肠杆菌、红球菌、诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、乳酸棒杆 菌或酵母菌等之一种，优选宿主为红球菌或大肠杆菌。
上述用于插入所述的腈水合酶基因簇的表达载体是指能在在所述宿主中表 达的质粒载体，如可在红球菌中表达的穿梭质粒载体PNV18，或可在大肠杆菌中 表达的pET，或可在毕赤酵母菌中表达的pPIC9K等。含有上述腈水合酶基因簇的重组表达载体可按照常规方法构建。
含有上述腈水合酶编码基因簇的重组细胞可按常规同源重组方法构建。
本发明腈水合酶基因簇(SEQIDNO: 1， 7935bp)，不包含酰胺酶基因。与
同源性最高的玫瑰红球菌W力OACOCCM 2^00bc力rOM Jl的高分子量腈水合酶基
因簇(6555bp)相比，本发明所述的腈水合酶基因簇不存在/7力力H阅读框，同时 外延1380 bp， 二者的序列一致性为66. 7%。与朋ocbcoccM t^ g^c力2yws M8 的腈水合酶基因簇相比(4540bp)相比，本发明腈水合酶基因簇多含有一个/7力^ 阅读框，二者的序列一致性为56.2%。
本发明具有的优点本发明腈水合酶基因簇能够在工程菌中高效表达。如 单独过表达腈水合酶基因的工程菌中腈水合酶的比活性是野生玫瑰红球菌龙 r力oAc力2^AsATCC 33278的7倍；过表达整个腈水合酶基因簇的工程菌中，腈水 合酶的比活性是野生玫瑰红球菌菌龙r力Moc力7W/5"ATCC 33278的70多倍。以丙 烯腈为底物，每毫克细胞(干重)每分钟可以催化生成大约220微摩尔丙烯酰胺。
图i.红色红球菌腈水合酶基因簇/7力^z^5^;的结构组成示意图。
图2.红色红球菌腈水合酶5'端侧翼序列一次热不对称基因扩增 (TAIL-PCR)的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DNA分子量标准，I 、 II、 III 分别代表引物SP1、 SP2、 SP3参与的3轮PCR产物；AD1、 AD2、 AD3和AD4分 别代表由相应简并引物完成的TAIL-PCR。
具体实施例方式
实施例l腈水合酶基因簇/2力^Z^E^的克隆
(1)红色红球菌(A^oobcocc^srMerTH)的培养并提取菌体的染色体DNA。 用无菌的接种环挑取自土壤中筛选的红色红球菌(保藏在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCC No. 2380)单菌落接种 于装有50mL的LB液体发酵培养基(LB液体发酵培养基的组成及其比例为葡萄 糖10g/L;酵母膏5g/L;蛋白胨10g/L;氯化钠10g/L，其余为水)的三角瓶 中；然后在温度为28。C、转速为200 rpm的摇床中培养72小时，再在10000rpm下 离心5min，收集菌体沉淀，10ml无菌水重悬，10000rpm下离心5min，收集菌体， 酚/氯仿法提取菌体的总DNA，用Promega公司的Wizard Genomic DNA Purification Kit提取和纯化红色红球菌总DNA，备用。 (2)腈水合酶基因/7/^^4的PCR扩增和测序
根据腈水合酶基因的保守序列设计并合成腈水合酶基因的上游与下游引
7物，其中上游引物P1为5， -CAGAATTCACGTCCCCGTAGTGT-3，(下划线部分为fcoM 酶切位点)(SEQ ID NO: 9);
下游引物P2为5， -AAGGATCCGAAAGCGCGATG-3，(下划线部分为5a巡M酶切位 点)(SEQIDNO: 10)，引物由北京赛百盛生物工程公司合成；然后用无菌水 溶解引物至浓度为50^imol/L。 PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、四种脱氧核苷
酸溶液均由宝生物工程(大连)有限公司购得。以步骤(1)所得红色红球菌 欣w/ococcm rWer TH的总DNA为模板进行聚合酶链反应(PCR)扩增
PCR反应体系为
扩增缓冲液 5pL
四种脱氧核苷酸 5pL
引物P1 lpL
引物P2 lpL
总DNA溶液 8pL
EX Taq DNA聚合酶 0. 5|aL
无菌水 29. 5jiL
总体积 50pL;
反应条件为94°C， 5min; 94。Clmin、 50°C1. 5min、 72。Clmin，循环30次； 最后72。C10min。扩增得到腈水合酶基因片断。将扩增得到的腈水合酶基因片段 和质粒pUC18分别用限制性核酸内切酶fco/ I和W湖7〃1 (宝生物工程(大连)有 限公司)在37。C下进行酶切反应4h;将所得酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化 (天根生化科技(北京)有限公司)，然后用T4DNA连接酶(Promega公司)在4。C 进行连接反应16h;再将连接反应产物转化宿主菌A c^i JM109的感受态细胞 (天根生化科技(北京)有限公司)，采用氨苄青霉素抗性(Amp) LB平板挑选 阳性克隆，在LB培养基中37。C过夜培养后提取小量质粒进行酶切和电泳验证， 得到含有腈水合酶基因片断的重组质粒pUC18-T7力t说。将重组质粒进行DNA测序， 测序结果表明所得基因"力^^具有序列表中SEQ ID NO: 8所示的多核苷酸序列。
(3)采用TAIL-PCR (热不对称PCR)方法反向扩增获得腈水合酶基因簇 77力^Y^^堪因序列并测序。根据已经获得的腈水合酶基因/7力"A在5'末端分 别设计三个嵌套引物NSSPl- N5SP3。所述的引物分别为
N5SP1: 5'-CCTTGAGATGCATCCAGGTCAGMT-3， ； (SEQ ID NO: 11) N5SP2: 5，-CCATTTCCTCATTCCTTTCATCGG-3， ； (SEQIDNO: 12) N5SP3: 5，-GAATCCTTCACAGCACAACAATCG-3，(SEQ ID NO: 13)根据TAIL-PCR方法原理设计四个简并引物AD1—AD4，所述的引物序列分别
为
AD1: 5，-TG(A/T)GNAG(A/T)ANC(G/C)AGA-3， ； (SEQ ID NO: 14) AD2: 5，-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3， ； (SEQ ID NO: 15) AD3: 5，-CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GAA-3， ； (SEQ ID NO: 16) AD4: 5，-TC(G/C)TICGNACIT(A/T)GGA-3， (SEQ ID NO: 17) 上述引物序列中所述的n可以为a或c或g或t;其中的I为次黄嘌呤核苷。 第一轮以质粒pUC18-z7力z^4为模板，以N5SP1和四个简并引物AD1、 AD2、 AD3 和AD4的混合物为上、下游引物，进行如下TAIL-PCR变温循环95°C， 2min; 5 个循环(94。C， 30s， 60°C， lmin， 72°C， 2min30s); 94°C， 30s， 25°C， lmin， 72°C， 2min 30s; 10个f盾环(94°C， 30s， 44°C， lmin， 72°C， 2rain 30s); 15 个循环(94°C， 15s， 62°C， lmin， 72°C， 2min 30s， 94°C， 15s， 62°C， lmin， 72°C， 2min 30s， 94°C, 15s， 44。C， lmin， 72°C， 2min 30s); 72°C， 10min。 将所得PCR产物纯化后作为下一轮TAIL-PCR的模板。依次类推，第二轮TAIL-PCR 的引物分别为N5SP2和四个简并引物AD1、 AD2、 AD3和AD4的混合物;第三轮 TAIL-PCR的引物分别为N5SP3和四个简并引物AD1、 AD2、 AD3和AD4的混合物。 第二轮和第三轮TAIL-PCR的条件为15个循环(94。C， 30s， 58°C， lmin， 72°C， 2min30s， 94°C， 30s， 58°C， lmin， 72°C， 2min 30s， 94°C， 30s， 44°C， 2min 30s， 72°C， lmin 30s)， 72。C(10min)。三轮TAIL-PCR结束后，用l %的琼脂糖 凝胶电泳观察扩增产物的大小分布，结果(如图2所示)简并引物AD1与3个嵌套 引物SP1、 SP2、 SP3进行TAIL-PCR时，第II轮和第III轮产物都有一条清晰的扩 增带，约为2000bp，而且第ni轮的条带比第II轮略小，与嵌套引物在DNA序列 上结合位置的差别相一致。按凝胶回收试剂盒方法回收第三轮PCR目标产物，并 按连接试剂盒说明方法将其分别克隆至pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公 司)上。连接产物转化DH5 a感受态细胞(宝生物工程(大连)有限公司)，最后在 含有IPTG和X-gal的LB/Amp抗性平板上蓝白筛选阳性克隆，挑取白色菌落作为 模板，分别以pMD18-T载体上的通用RV-M和M13-47为引物，进行菌落PCR扩 增筛选。筛选出的目的菌株用LB/ Amp液体培养基培养过夜，送菌液给北方诺赛 基因组研究中心测序。根据测序结果，进一步设计新一轮5，端TAIL-PCR上游引 物，分别为
N5-2SP1: ATCTCAGTCATCCATTCCAGGCAG; (SEQ ID NO: 18) N5-2SP2: TAGACTGCGGTGTAGACATACGGAA; (SEQ ID NO: 19)N5-2SP3: TCMCGMGACCGGCGTMCCT。(SEQ ID NO: 20) 同样采用简并引物AD1、 AD2、 AD3和AD4为下游引物，采用同上方法进行三轮 TAIL-PCR。回收测序获得SEQ ID No: l中所示/7力^4基因5，端上游自第1位到第4754 位的侧翼片断，长度为4754 bp。
与此类似，在腈水合酶基因"力"力的3'端设计TAIL-PCR嵌套引物如下 N3SP1: 5，-CGAAATCCGCTACATCGTCATCC-3， ； (SEQ ID No: 21) N3SP2: 5'-CTCGATGATCGGTGTCAGTMTGCG-3， ； (SEQ ID No: 22) N3SP3: 5，-GAAGACACACTCACTGATCGGCT-3， 。
(SEQ ID No: 23) 采用相同的AD1、 AD2、 AD3和AD4简并引物，第一轮扩增以质粒pUC18-/ 力^4为 模板，第二轮和第三轮扩增分别以前一轮扩增产物为模板。参照TAIL-PCR方法 的标准变温循环，扩增获得腈水合酶基因3'端的基因大片断。用1%的琼脂糖凝 胶电泳验证后采用同上方法切凝回收、连接pMD18-T载体、转化DH5a感受态细 胞、筛选阳性克隆并测序。最终获得SEQIDNo: 1中77力MJ基因3'端下游自第6070 位到7935位碱基的侧翼片断，长度为1866bp。
将77^别基因5，端上游的侧翼片断、T7力^4基因以及/7力t别基因3，端下游的
侧翼片断的DNA序列测序后拼接起来，获得序列表中SEQ ID NO: l所示的腈水合 酶基因簇全DNA序列，长度为7935 bp。
实施例2.携带腈水合酶基因/7力M力的重组穿梭质粒和工程菌株的构建
根据序列表中SEQ ID NO: l所示的腈水合酶基因簇序列设计引物
上游引物PBA1: CAGGATCCAATGGATGGTATCCACGA (下划线部分为5湖7M酶切 位点)；(SEQ ID NO: 24)
下游引物PBA2: CGAAGCTTCACTCATACGATCACTT (下划线部分为历'770111酶切 位点)(SEQ ID NO: 25)。以红色红球菌允rSer TH基因组DNA为模板，采用 常规PCR方法克隆"力t^4基因。以携带&c启动子的诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒 pNV18-Ptac为载体(一种腈水合酶基因工程菌的构建方法以及基因工程菌株和 应用.于慧敏，等，CN 101186911A)，用万aWI和历'77dll双酶切腈水合酶基因 T7M说和穿梭质粒pNV18-Ptac， 37"C反应过夜；将酶切产物用PCR产物回收试剂 盒纯化，然后采用T4 DNA连接酶在4"C进行连接反应14 h;将连接反应产物转化 宿主菌￡ JM109的感受态细胞，挑选阳性克隆，在LB培养基中37。C过夜培
养后提取小量质粒进行酶切和电泳验证，得到含有腈水合酶基因/7力t^4的穿梭质 粒pNV-Ptac-由肌
采用革兰氏阳性菌电穿孔感受态细胞的标准制备方法(《分子克隆指南》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉赛尔著)，制备玫瑰红球菌(朋oAcocciAsr力oc/oc/ 2w^) ATCC 33278 (购自美国ATCC菌种保藏中心)的感受态细胞。取l ii 1纯化后的 穿梭质粒pNV-Ptac-/2力z^4于一个1. 5ml的离心管中，将其和O. 1CM的电转杯一起 置于冰上预冷；将50ul制备好的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心 混匀，冰上放置10min;打开电转仪，调节电压为1250V;将穿梭质粒和感受态 细胞的混合物转移至己预冷的电转杯中，放入电转化仪，按下电击键，听到蜂 鸣声后，向杯中迅速加入800y 1的S0C液体培养基(配方见《分子克隆指南》)。 重悬细胞后，转移到l. 5ml的离心管中。置于28'C、 220rpm摇床培养2h;取200 u 1 菌液涂布于含有20w g/ml卡那霉素的LB固体培养基平板，放入28'C培养箱培养 6 0 7 2小时后出现重组红球菌的单菌落，得基因重组玫瑰红球菌 r力。obc/ ，s ATCC 33278/ pNV-Ptac-t / 亂
实施例3携带腈水合酶基因簇/7Ma^別《的重组质粒和工程菌株的构建
根据序列表中SEQ ID No:l所示的腈水合酶基因簇序列设计引物
上游引物Pclusterl: GCTCTAGAACTGGCAAGCTCCTTT (下划线部分为ZZ sI酶 切位点)；(SEQ ID NO: 26)
下游引物Pcluster2: CGAAGCTTGGAGAAGCATAGGTCGT (下划线部分为历'/7dn 酶切位点)(SEQ ID NO: 27);
以红色红球菌y . rWwTH基因组DNA为模板，采用常规PCR方法克隆腈水合 酶基因簇基因"力ta^S^。同实施例2所述的方法，以穿梭质粒pNV18-Ptac为载 体，用Wal和ffi/^ ni分别酶切穿梭质粒pNV18-Ptac和腈水合酶基因簇 /7力^Z i5S^， 37t:反应过夜；将酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化，然后采用 T4 DNA连接酶在4。C进行连接反应14 h;将连接反应产物转化宿主菌A co"' JM109的感受态细胞，挑选阳性克隆，在LB培养基中37"C过夜培养后提取小量质 粒进行酶切和电泳验证，验证正确的穿梭质粒即为含有腈水合酶基因簇的穿梭 质粒pNV-Ptac-tCZ^S^。
同实施例2所述的方法，采用电穿孔转化法将重组穿梭质粒pNV-Ptac-/7MO^别6转入玫瑰红球菌兄r力oobcv^o〃s ATCC 33278感受态细胞，得到玫 瑰红球菌工程菌疋r力oo^c力ro〃s ATCC 33278/pNV-Ptac-77力tO!5S^。
实施例4腈水合酶基因和腈水合酶基因簇在红球菌工程菌中的表达试验
(1)玫瑰红球菌工程菌的发酵培养
将实施例3所得分别携带外源腈水合酶基因或腈水合酶基因簇全序列的玫 瑰红球菌工程菌尤 r/ oGbcArows/pNV-Ptac-y 力z^4 (范广/7力^^ )或TP.r力oobcAro^s/pNV-Ptac-/7M6Z^S^ (处-/ / ^7促別6D进行摇瓶平行培养，并以 原始野生菌株尤r/ oobc力roM ATCC 33278为对照，在28t:、摇床转速200转 /min条件下培养72小时，然后将发酵菌液分别离心，收集菌体；培养基的组 成及比例为葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨7g/L， K戰0.5g/L， K2HP04 0.5g/L， MgS04 7H20 0 . 5g/L， pH7. 5，诱导剂甲基丙烯酰胺0. 2g/L，其余为水。 (2)玫瑰红球菌工程菌催化丙烯腈生成丙烯酰胺试验
用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)在50mL三角瓶中重悬步骤(1)中 所得菌体，加入终浓度为0.5%丙烯腈液体，在28"C、 200rpm条件下摇床反应 10min，再加入lml盐酸中止反应，利用GC-9AM气相色谱仪检测反应产物丙烯 酰胺，测定所得工程菌催化丙烯腈生成丙烯酰胺的活性。结果野生玫瑰红球菌 的腈水合酶活性为3.0 U/mg干菌；单独过表达腈水合酶的玫瑰红球菌工程菌 朋-77力t别的总酶活为21.0 U/mg干菌，是野生菌的7倍；过表达整个基因簇的 玫瑰红球菌工程菌朋-T7力tO^^^的总酶活为220 U/mg干菌，是腈水合酶单独 过表达时的10.5倍。说明本发明腈水合酶基因簇的腈水合酶的活性高，表达量 高。其中，酶活的单位定义为每单位质量干菌细胞每分钟催化生成1 li mol丙 烯酰胺所需的酶量；lymol丙烯酰胺/ (min'mg干菌)=1 U/mg干菌。
12序列表
<110>清华大学
<120> —种腈水合酶基因簇及其应用
<160> 27
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 7935
<212> DNA
<213> Rhodococcus ruber
<400> 1
actggcaagc tcctttccag cggagtctga gaactcgcgc tcccaagagg ccggccgacc 60
agggggcgaa cggcgctaaa cgtggactgt ccgattgaac gtctacaacc ttgcgaatct 120
atgaccgccg ctgctcggtg tgggggctgt tcctgcgtcg gcatcgatcg tgcatcagtg 180
gcaaaccccc tcccatgcct cggttcgtgc caccgccacg taggcggctc gtagttcata 240
cctgcacatc ccttgagaca gaccgctgta cagagccgac tcgcccgtcc gtcgccggtg 300
gtacacgcac ggctgtgggg ttgtgtgctc tcagggtaga ccagatactg tcattgtgta 360
gtagagtttc gtaagattct tgtaacgcgc cgaacaggca gggtcgtgcg agtcctcccg 420
tcgacggtag cccgacatgg gtcccaggcc cgaaggcgtg cacagcgaac attagttaca 480
gaacgcaatt ttcagagaga gatgaacccg tacgaccagc tgaccgaatg tgggtttggc 540
acggacccgg agaatcgtgc tgcggttgcc cagctggtgc acctccggcg gaatttccca 600
agccctaggt gtctccaggc ttcacgtgcc ggctacgtta ccgagcgcag aatcactggc 660
cgacgggaat gcccgtgaac gtcgattccc cgtgagaccg gtaacgacgt gacccgccgg 720
ccctggggcg aggcccctct ttggcccctg tccggcgcgc acctgcacga tctccggctt 780
cgacacattc gccccgaccg ctcgctca3g 3gatccc昭g ctccacagca ggttgggacc 840
gtgcggccga tcggtccgcc gtttcgaacg acacgaatgt gcggttctcc acctccatga 900
tttggttgag gccgtcgatc gagcacacgt taaccgtcgc gaaacacccg gtcatggaca 960
gagcaatgtg aacgggttca tactccggag agcatgttgc ctagatcccc gcaaggagac 1020
13cgctgtgccc cttggccgac cgaacctggg cttggtgcta cctcagagtg gaccgtccgg 1080
cattttcggt ccgtcatgcc aggcgagcgc cgagtacgcc atcgatgagc tcaacgcggg 1140
cggcggaatc ctgggccgag aggttacgcc ggtcttcgtt gacgggggcg cggacccgtc 1200
cgccgtagca gcatgcatcg ccgaccagac gaaacgtcgg gaattggacg ccgtagtcgg 1260
gtggcacacg tctgctgttc gtcgacgcat cgtgagcgcc atcggcggac gtattccgta 1320
tgtctacacc gcagtctacg agggcggcga gaactccgac ggcgtgttca tgacgggaga 13 80
ggtaccgacg aatcagattc ttcctgccct ggaatggatg actgagatcg gcgtgcgtaa 1440
gtggtatgtc attggcagtg actacgtttg gccccgaaag actgtctcgg tcattcgcga 1500
attcctggcg tcgaaccagc gaccgagtcg aggccgcagc gacgttcgac tggcgtcgtg 1560
cgagttcttg tcactaggca catccgattt cacttcaacg ctcgaggcaa ttgagatgtc 1620
gggggccgat ggcgttctcg tcctcctcct cggccaggac gcagtacagt tcaaccggtc 1680
tttttcacggaaagggctgc accgcgacat cgtcagactc agtccgctga tggatgagaa 1740
catgctgttg gcaagcggcg cacacgccgc gcacggactc tactcggtgt cggggttctt 1800
cgagtgcctg gtcaccgggc acagcatgga tttcgaatcc aggtacatca agcacttcgg 1860
cccgaccgcc tcgccgatca cttcgcctgg agagtcgtgc tacgagggca ttcgactgtt 1920
ggccactctt gcagaccggg ccggcgatct cgacccgatg tctctgagct atcacgcaga 1980
ccgtaccctc gactacgaca gccctcgagg ccatgtccgc tttgacggtc gccatctcgc 2040
tcaggacatg tacatcgcgc gggctgacgg agtagagttc gacatcttag cgcaggtttc 2100
ccatgtgtga gttgctttga tgcgtttcga gcgatgtcga ggcacacaga tgaaagtgcg 2160
ttactcgaac caagtttcca ataccgtgcg caggacctgc cgatcgggaa tcgcgaattc 2220
atccatgaac tcgtcctcga cctgctgcac gagtgggagc aaccgactgt gagcggaacc 2280
gccgcgcttc gaagcatgga ccagtacttt cctgcgatcg gcgtgatcag gaaggcggaa 2340
caccagcgcc gtggtgacca ggcgatccac atgcttcgtc gttgtcggcg caggtgagcc 2400
cagggatcga gcgatctcgg tcatcgcgat tccatcgttg cggacgatga tgtccaatac 2460
gtaccactgg tccgcggtca acttctcttg atcgaccacg ttatggattc tacgactcag 2520
ggaccggctc acggcttcca gggcgcctcc gaccaaaggt gatcgaacga catttccgga 2580
ttcagccacc gcttccgact cgatcattcc tgtccctccc cgtccacgcg cagttgatct 2640
tacctcctca tcaagaggat atccactgaa cgaattattt caagtggaag tacttggagt 2700
cgatcctaca cgtgagtgga caatgcctgg gcgctagtcg gatgtacgac ccccaccctc 2760
tcctcccgcc cacgtcgagg gcaggaacca gcgtcgtccc agcctgccgt ctcttgcagc 2820
tgttgtgaac gcccgagcgg cctcacggct cttcagttgg cgcggatcgc catggcggac 2880
14gtcgcccacg acgggaccta cgcatcctcg gccggaaggc agccgcggtc acgaacgccg 2940
tagcggcagt tgcgcacctg agacgaagac tgccggcgtc ctgccccgga aatccgcagc 3000
ccagctgtga cagccatgtg acagccaaca gtcgtggcgg ttcccttccg tactaggggc 3060
tttgactcgg caccaacgcc tgcgagggcg ctcgtcgcgg accacttgtc caggtctgtg 3120
ccgcaggtca ccgagcgcac ccttcttcgt tctatgcgca tcggcctgga ctgcgaccgc 3180
ggcaacactg cgacgtctga caatgaggtt ttctcagtga gttgatcttg cttgggcggt 3240
gtcaggaccg gatcgccaag agacgcagag cccctggtag gactggattt gcgaagatca 3300
敏cc3Cga3 ccagaggctc cacgtgatca cctattctgc cacgctcgac gtccctcgac 3360
cgctcgccca gtacctgtgt cgactgttgc sggccgaccg ccacgcacgc ggtacccgca 3420
ggggccgccg ggccctgact gcgttcgccc aggcggtact cgtgctgcgc tggttccggc 3480
aggacaccgc gctcaccgcc ctggctcgcg acgccggcat ctcgatcgct accggctacc 3540
ggtacctgca cgaaggcatc gacgtgctcg ccgcccaggc cccggacctg cccgacgtgc 3600
tgcgcgagcg cctcgccgcc ggcgagaccc acgtgatcct cgacggcact ctcatcccca 3660
gcgaccgggt cgccgagacc accctcggca gcagaggcac cccgatccac ctgtggtatt 3720
ccggcaaaca ccgccgattc ggcgcggaca tccagttcgt ggcgaccgcg gacggattcc 3780
cgctgtgggt ctccgacgcg ctgccgggca gcacccacga tctgaccgct gcccgcacac 3840
accgggtcac cgg3gccctg tocgccgccg cggcgcaggg tctgctcacc ctcgccgacc 3900
agggctatca gggcaccggc atcggtatcc acatgcccac gaaagcccct gctgacggca 3960
acaccctcga taccgacacc gtctgccgca acatgctgct gaccagtctg cggtgcctcg 4020
gcgaacgtgc cgctgcgctg ctcaccacgc gatggaaggc actcgacagg atcaccctgt 4080
gccccaaaag gatcggttcc atcaccaaag cggcgctcgt actcacgcaa ttcgagcacg 4140
caggccgtta ctgagaaaac ctcaatgctg atcaccctgc cgccgttgga cgaccacggt ' 4200
tgctacgagt gtgcggagcc aaccataggc atcatgcgat cgccggagtc ttcatcctgt 4260
tttgggatgc gcaggattaa cacatctaca cattgacatc cgttccgatg tgaagtaaaa 4320
attgtcacgt agggcggcag gcgaagtctg cagctcgaac atcgaagggt gggagccgag 4 380
agatcggaga cgcagacacc cggagggaac ctagcctccc ggaccgatgc gtgtcctggc 4 440
aacgcctcaa gattcagcgc aagcgattca atcttgttac ttccagaacc gaatcacgtc 4500
cccgtagtgt gcggggagag cgcccgaccg cagggatggt atccatgcgc cccttctctt 4560
ttcgaacgag aaccggccgc tacagccgac ccggagacac tgtgacgccg ttcaacgatt 4620
gttgtgctgt gaaggattca ctcaagccaa ctgatatcgc cattccgttg ccggaacatt 4680
tgacaccttc tccctacgag tagaagccag ctggacccct ctttgagccc agctccgatg 4740aaaggaatga ggaaatggat ggtatccacg acacaggcgg catgaccgga tacggaccgg 4800
tcccctatca gaaggacgag cccttcttcc actacgagtg ggagggtcgg accctgtcga 4860
ttctgacctg gatgcatctc aagggcatgt cgtggtggga caagtcgcgg ttcttccggg 4920
agtcgatggg gaacgaaaac tacgtcaacg agattcgcaa ctcgtactac acccactggc 4980
tgagtgcggc agaacgtatc ctcgtcgccg acaagatcat caccgaagaa gagcgaaagc 5040
accgtgtgca ggagatcctc gagggtcggt acacggacag gaacccgtcg cggaagttcg 5100
3tccggccga gatcg3g3ag gcgatcg肌c ggcttc3cga gccccactcc ctegcacttc 5160
caggagcgga gccgagtttc tccctcggtg acaaggtcaa agtgaagaat atgaacccgc 5220
tgggacacac acggtgcccg aaatatgtgc ggaacaagat cggggaaatc gtcacctccc 5280
acggctgcca gatctatccc gagagcagct ccgccggcct cggcgacgat ccccgcccgc 5340
tctacacggt cgcgttttcc gcccaggaac tgtggggcga cgacggaaac gggaaagacg 5400
tagtgtgcgt cgatctctgg gaaccgtacc tgatctctgc gtgaaaggaa tacgatagtg 5460
agcgagcacg tcaataagta cacggagtac gaggcacgta ccaaggcaat cgaaactttg 5520
ctgtecgagc gagggctcat cscgcccgcc gcggtcgacc g3gtcgtttc gtactocgag 5580
aacgagatcg gcccgatggg cggtgccaag gtcgtggcga agtcctgggt ggaccctgag 5640
taccgcaagt ggctcgaaga ggacgcgacg gccgcgatgg cgtcattggg ctatgccggt 5700
gagcaggcac accaaatttc ggcggtcttc aacgactccc aaacgcatca cgtggtggtg 5760
tgcactctgt gttcgtgcta tccgtggccg gtgcttggtc tcccgcccgc ctggtacaag 5820
agcatggagt accggtcccg agtggtagcg gaccctcgtg gagtgctcaa gcgcgatttc 5880
ggtttcgaca tccccgatga ggtggaggtc agggtttggg acagcagctc cgaaatccgc 5940
tacatcgtca tcccggaacg gccggccggc accgacggtt ggtccgagga cgagctggcg 6000
aagctggtga gccgggactc gatgatcggt gtcagtaatg cgctcacacc ccaggaagtg 6060
atcgtatgag tgaagacaca ctcactgatc ggctcccggc gactgggacc gccgcaccgc 6120
cccgcgacaa tggcgagctt gtattcaccg agccttggga agcaacggca tacggggtcg 6180
ccatcgcgct ttcggatcag aagtcgtacg aatgggagtc cttccgacag cgtctcattc 6240
actccatcgc tgaggccaac ggttgcgagg catactacga gagctggaca aaggcgctcg 6300
aggccagcgt ggtcgactcg gggctgatca gcgaagatga gatccgcgag cgcatggaat 6360
cgatggccat catcgactga catcccctgc gtttccatcc agaatcagtg cgggcgtacc 6420
ccgacggggc tgagcctacc gggtacatga cgttctgagg cacacagcgc agagtcgagc 6480
tgagtgcctc agaaacgtca tgacggtggt tcctaattcg gctcggtggg tactgagctc 6540
gcggaaggta acgcggtgac gctgtaggcg ttcatggcaa gtgggactcc ggtgcgccga 6600
16gcctgaggtg ttcgatatgg tataccgctt cgtccaacaa cgacgcgaca tgcgagtcgt 6660
3gaggctgta caccscgcto cg3ccactgc gttcgccgat cacc犯ccgc 3gcgctcgca 6720
■acaggcggag ctggtgagaa accgcaggtt gttccatacc gacagcctcg gcgagctcgg 6780
tgactccgca cggtccttgc cgcaacctgg ccaaaatcaa cagtcgattc ggtgacgcca 6840
atgcctgcaa agtctccgcg actgttgccg ccgcagccgg atccagagcg acctccgggg 6900
tcgctg肌cg犯cccgcata ccgtgtccca tgcsccaatt caatcacacc tatecacatg 696 0
taaatctcaa cactcttgca tgcattggct tcaaccccct tcctgccgca ataccggtag 7020
ataggccctt ggcggatcga cacggatagg cgcagcgctc ccgcccgcca acctgaacat 7080
gaataacggc agtacgcacc cagcacgcag gaacaggcac ccgccacaag ttttcgcgcg 7140
gtgaccacgc cgccctgctc ggaa3cgaag g犯犯tacgt gtctaaccgc tcgccccgcc 7200
gagaacgaga gaaccggatc aacccgttcc acccggtaga agatcaagac tgtctaaccg 7260
ataccgacct cgcaactgtc atcagagccc tcaccggcga agctgcattc cgtccttacg 7320
accgaaaaga caagtgatat ctgcgtcttc atccatccgg gcctcgcggt gccggtccgc 7380
agcatcggca cccggaaacg cctccgacgg gtagtgtggg cggcagcggc cgtcgaagga 7440
ttaatcccgc gggtctcacg aggacaggac cggtccgatc cgcacggcgc catttccgta 7500
gtcgggcccc acccaaccgg cgtcgg3gcc cgctcgaccc gaggtttcgt ccttcgagat "60
cgtatccact ccggttcggt gacaaagccg acatgctggg cgtagtccag cccgccctgg 7620
cccgtagccg acgccctgtg cggcgcggac tacggccaac gctcggacga acgtgtcaac 7680
attcgcaacc ggctaccggc accgggactt cgacacccgc gtcggcaccc tcgacgtggc 7740
catccccaag ctgcggcaag gttcgtactc gctcggacct ctgtgcgtgc ttgtccagca 7800
tgttcgaccg gagctcacgg gtccctcggc tcgacgctgc gccgcaggca gggccctcag 7860
tcctggtcgt ccagagatgc gaaacgaacg tcccgccaga attcgcacag cagggccaac 7920
gacctatgct tctcc 7935
<210> 2 <211> 361 <212> PRT
<213> Rhodococcus ruber <■〉 2
Val Pro Leu Gly Arg Pro Asn Leu Gly Leu Val Leu Pro Gin Ser Gly15 10 15
Pro Ser Gly lie Phe Gly Pro Ser Cys Gin Ala Ser Ala Glu Tyr Ala
20 25 30
lie Asp Glu Leu Asn Ala Gly Gly Gly lie Leu Gly Arg Glu Val Thr
35 40 45
Pro Val Phe Val Asp Gly Gly Ala Asp Pro Ser Ala Val Ala Ala Cys
50 55 60
lie Ala Asp Gin Thr Lys Arg Arg Glu Leu Asp Ala Val Val Gly Trp 65 70 75 80
His Thr Ser Ala Val Arg Arg Arg lie Val Ser Ala lie Gly Gly Arg
85 90 95
lie Pro Tyr Val Tyr Thr Ala Val Tyr Glu Gly Gly Glu Asn Ser Asp
100 105 110
Gly Val Phe Met Thr Gly Glu Val Pro Thr Asn Gin lie Leu Pro Ala
115 120 125
Leu Glu Trp Met Thr Glu lie Gly Val Arg Lys Trp Tyr Val lie Gly
130 135 140
Ser Asp Tyr Val Trp Pro Arg Lys Thr Val Ser Val lie Arg Glu Phe 145 150 155 160
Leu Ala Ser Asn Gin Arg Pro Ser Arg Gly Arg Ser Asp Val Arg Leu
165 170 175
Ala Ser Cys Glu Phe Leu Ser Leu Gly Thr Ser Asp Phe Thr Ser Thr 180 185 190
Leu Glu Ala lie Glu Met Ser Gly Ala Asp Gly Val Leu Val Leu Leu
195 200 205
Leu Gly Gin Asp Ala Val Gin Phe Asn Arg Ser Phe Ser Arg Lys Gly
210 215 220
Leu His Arg Asp lie Val Arg Leu Ser Pro Leu Met Asp Glu Asn Met 225 230 235 240
Leu Leu Ala Ser Gly Ala His Ala Ala His Gly Leu Tyr Ser Val Ser
245 250 255
18<formula>formula see original document page 19</formula>Asp Arg Leu Val Thr Thr Ala Leu Val Phe Arg Leu Pro Asp His Ala
85 90 95
Asp Arg Arg Lys Val Leu Val His Ala Ser Lys Arg Gly Gly Ser Ala
100 105 110
His Ser Arg Leu Leu Pro Leu Val Gin Gin Val Glu Asp Glu Phe Met
115 120 125
Asp Glu Phe Ala lie Pro Asp Arg Gin Val Leu Arg Thr Val Leu Glu
130 135 140
Thr Trp Phe Glu 145
<210> 4 <211> 96 <212> PRT
<213 > Rhodococcus ruber <400> 4
Val Leu Pro Arg Ser Gin Ser Arg Pro Met Arg lie Glu Arg Arg Arg 1 5 10 15
Val Arg Ser Val Thr Cys Gly Thr Asp Leu Asp Lys Trp Ser Ala Thr 20 25 30
Ser Ala Leu Ala Gly Val Gly Ala Glu Ser Lys Pro Leu Val Arg Lys
35 40 45
Gly Thr Ala Thr Thr Val Gly Cys His Met Ala Val Thr Ala Gly Leu
50 55 60
Arg lie Ser Gly Ala Gly Arg Arg Gin Ser Ser Ser Gin Val Arg Asn 65 70 75 80
Cys Arg Tyr Gly Val Arg Asp Arg Gly Cys Leu Pro Ala Glu Asp Ala
85 90 95
<210> 5
20<211> 229 <212> PRT
<213> Rhodococcus ruber
<400> 5
Met Asp Gly lie His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 15 10 15
Pro Tyr Gin Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30
Thr Leu Ser lie Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp
35 40 45
Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val
50 55 60
Asn Glu lie Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80
Arg lie Leu Val Ala Asp Lys lie lie Thr Glu Glu Glu Arg Lys His
85 90 95
Arg Val Gin Glu lie Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser
100 105 110
Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu lie Glu Lys Ala lie Glu Arg Leu His
115 120 125
Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu
130 135 140
Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160
Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys lie Gly Glu lie Val Thr Ser His
165 170 175
Gly Cys Gin lie Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp
180 185 l卯
Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gin Glu Leu Trp Gly 195 200 205<formula>formula see original document page 22</formula>Arg Tyr lie Val lie Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser
165 170 175
Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met lie Gly Val
180 185 190
Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gin Glu Val lie Val 195 200
<210> 7
<211> 104
<212> PRT
<213> Rhodococcus ruber
<■> 7
Met Ser Glu Asp Thr Leu Thr Asp Arg Leu Pro Ala Thr Gly Thr Ala 15 10 15
Ala Pro Pro Arg Asp Asn Gly Glu Leu Val Phe Thr Glu Pro Trp Glu 20 25 30
35 40 45
Glu Trp Glu Ser Phe Arg Gin Arg Leu lie His Ser lie Ala Glu Ala
50 55 60
Asn Gly Cys Glu Ala Tyr Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Ala Leu Glu Ala 65 70 75 80
Ser Val Val Asp Ser Gly Leu lie Ser Glu Asp Glu lie Arg Glu Arg
85 90 95
Met Glu Ser Met Ala lie lie Asp 100
<210> 8 <211> 1315 <212> DNA<213> Rhodococcus ruber<400> 8
atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60
gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcgattct gacctggatg 120
catctcaagg gcatgtcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180
gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240
cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaggag 300
atcctcgagg gtcggtacac ggacaggaac ccgtcgcgga agttcgatcc ggccgagatc 360
gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cacttccagg agcggagccg 420
agtttctccc tcggtgacaa ggtcaaagtg aagaatatga acccgctggg acacacacgg 480
tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtca cctcccacgg ctgccagatc 540
tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcccc gcccgctcta cacggtcgcg 600
ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660
ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga aaggaatacg atagtgagcg agcacgtcaa 720
t肌gtecacg gagtacgsgg C3cgtocc犯ggcaatcgaa actttgctgt 3cgagcgagg 780
gctcatcacg cccgccgcgg tcgaccgagt cgtttcgtac tacgagaacg agatcggccc 840
gatgggcggt gccaaggtcg tggcgaagtc ctgggtggac cctgagtacc gcaagtggct 900
cgaagaggac gcgacggccg cgatggcgtc attgggctat gccggtgagc aggcacacca 960aatttcggcg gtcttcaacg actcccaaac gcatcacgtg gtggtgtgca ctctgtgttc1020
gtgctatccg tggccggtgc ttggtctccc gcccgcctgg tacaagagca tggagtaccg 1080
gtcccgagtg gtagcggacc ctcgtggagt gctcaagcgc gatttcggtt tcgacatccc 1140
cgatgaggtg gaggtcaggg tttgggacag cagctccgaa atccgctaca tcgtcatccc 1200ggaacggccg gccggcaccg acggttggtc cgaggacgag ctggcgaagc tggtgagccg1260
ggactcgatg atcggtgtca gtaatgcgct cacaccccag gaagtgatcg tatga 1315
<210> 9<211> 23<212> DNA<213> 人工序列<220>
24<223> 上游引物
<400> 9
cagaattcac gtccccgtag tgt 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>下游引物
<400> 10
aaggatccga aagcgcgatg 20
<210> 11
<211> 25
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>嵌套引物
<400> 11
ccttgagatg catccaggtc agaat 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>嵌套引物
25<400> 12
ccatttcctc attcctttca tcgg 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌套引物
<400> 13
gaatccttca cagcacaaca atcg 24
<210> 14
<211> 15
<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223> 简并引物<220>
<221> misc—feature
<222> (3， 8)
<223> w=a或t
<220>
<221> misc—feature
<222> (5， 10)
<223> n=a或c或g或t
26<220>
<221> misc—feature
<222> (12)
<223> s= c或g
<400> 14
tgwgnagwan csaga 15
<210> 15
<211> 16
<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223>简并引物<220>
<221 > misc_feature
<222> (3， 8， 13)
<223> w= a或t
<220>
<221 > misc—feature
<222> (5， 10)
<223> n= a或c或g或t
<400> 15
agwgnagwan cawagg 16
27<210> 16
<211> 16
<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223〉简并引物<220>
<221 > misc—feature
<222> (3)
<223> w=a或t
<220〉
<221 > misc—feature
<222> (6， 11)
<223> n=i
<220>
<221 > misc—feature
<222> (8)
<223> n=a或c或g或t<220>
<221 > misc—feature
<222> (13)
<223〉 s= c或g
<400> 16
cawcgncnga nasgaa 16<210> 17
<211> 16
<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223>简并引物<220>
<221 > mi sc—feature
<222〉 (3)
<223> s二 c或g
<220>
<221 > mi sc—feature
<222> (5， 11)
<223> n二i
<220>
<221 > misc—feature
<222> (8)
<223> n=a或c或g或t<220>
<221> misc—feature
<222> (13)
<223> w=a或t
<■> 17
tcstncgnac ntwgga 16
29<210> 18
<211> 24
<212> DNA<213>人工序列<220>
<223> 上游引物
<■> 18
atctcagtca tccattccag gcag 24
<210> 19
<211> 25
<212> DNA<213>人工序列<220>
<223>上游引物
<400> 19
tagactgcgg tgtagacata cggaa 25
<210> 20
<211> 22
<212> DNA<213>人工序列<220>
<223>上游引物
<400> 20
tcaacgaaga ccggcgtaac ct 22
<210> 21
30<211> 23
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>嵌套引物
<400> 21
cgaaatccgc tacatcgtca tcc 23
<210> 22
<211> 25
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>嵌套引物
<400> 22
ctcgatgatc ggtgtcagta atgcg 25
<210> 23
<211> 23
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>嵌套引物
<400> 23
gaagacacac tcactgatcg get 23
<210> 24 <211> 26<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223〉上游引物
<400> 24
caggatcc犯tggatggtat cc3cg3
<210> 25
<211> 25
<212> DNA <213>人工序列 <220〉
<223>下游引物
<400〉 25
cg犯gcttca ctcatacgat cactt 25
<210> 26
<211> 24
<212> DNA -<213>人工序列 <220>
<223>上游引物
<400> 26
gctctagaac tggcaagctc cttt 24
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
32<213>人工序列
<220>
<223>下游引物 <■> 27
cgaagcttgg agaagcatag gtcgt 2权利要求
1、一种腈水合酶基因簇，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2、 按照权利要求l所述的腈水合酶基因簇，其特征在于具有/7力^\ /7力W、 T7力M、 /2力t仏/7力M和/7力t共6个编码基因"力"位于基因簇核苷酸序列的第1025 —2110位碱基处，长度为1086个碱基 对，编码腈水合酶调控蛋白NhtC， NhtC具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列； T7力W位于基因簇核苷酸序列的第2161 — 2607位碱基处，长度为447个碱基 对，编码腈水合酶调控蛋白NhtD， NhtD具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列； "力M位于基因簇核苷酸序列的第2898 — 3188位碱基处，长度为291个碱基 对，编码腈水合酶调控蛋白NhtE， NhtE具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列； "力W位于基因簇核苷酸序列的第4755 — 5444位碱基处，长度为690个碱基 对，编码腈水合酶13亚基NhtB， NhtB具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列；/7力"位于基因簇核苷酸序列的第5458 — 6069位碱基处，长度为612个碱基 对，编码腈水合酶a亚基NhtA， NhtA具有如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列；/7力t6位于基因簇核苷酸序列的第6066 — 6380位碱基处，长度为315个碱基 对，编码腈水合酶调控蛋白NhtG， NhtG具有如SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。
3、 按照权利要求2所述的腈水合酶基因簇，其特征在于其编码的腈水合酶 NhtBA由13亚基NhtB和a亚基NhtA组成，其中13亚基NhtB具有SEQ ID NO: 5所示的 氨基酸序列，a亚基NhtA具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。
4、 含有权利要求1或2所述的腈水合酶基因簇的表达载体。
5、 按照权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是重组质 粒或基因工程菌。
6、 含有权利要求1或2所述的腈水合酶基因簇的基因工程菌的构建方法， 其特征在于将含有权利要求1或者2所述的的腈水合酶基因簇的重组表达载体导 入宿主。
7、 含有权利要求1或2所述的腈水合酶基因簇的基因工程菌的构建方法， 其特征在于是将含有权利要求1或者2所述的腈水合酶基因簇插入表达宿主的染 色体。
8、 按照权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于所述的宿主是指大肠 杆菌、红球菌、诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、乳酸棒杆菌或酵母菌。
9、 按照权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于所述的宿主是红球菌或大肠杆菌。
10、 按照权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述的质粒是指pNV18、 pET或pPIC9K。
11、 权利要求1或2所述的腈水合酶基因簇在丙烯酰胺生产中的应用。
12、 权利要求4所述的表达载体在在丙烯酰胺生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种腈水合酶基因簇及其应用，该腈水合酶基因簇具有nhtC、nhtD、nhtE、nhtB、nhtA和nhtG共6个编码基因。本发明还公开了含有该腈水合酶基因簇工程菌的构建方法。本发明腈水合酶基因簇的编码基因能够在基因工程菌中高效表达，所得的腈水合酶活性高，因而催化所得丙烯酰胺的产量高。
文档编号C12N15/60GK101463358SQ200910076710
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月15日 优先权日2009年1月15日
发明者于慧敏, 沈忠耀, 潘雯宇, 晖 罗, 马玉超 申请人:清华大学