一种定量检测猪肺炎支原体的方法

文档序号:573591阅读:548来源:国知局
专利名称:一种定量检测猪肺炎支原体的方法
技术领域
本发明属于分子生物学和病原体定量检测技术领域。具体而言,本发明涉及用于检测猪 肺炎支原体的实时荧光定量PCR引物及探针,以及使用其进行定量检测的方法。更具体地说, 是对肺炎支原体p110基因设计的实时荧光定量的PCR引物及探针,以及使用其进行定量检 测的方法。
背景技术
猪肺炎支原体(iKyo^/awra tyop"ramo"/ae, Mhp)是引起猪地方流行性肺炎(Swine Enzootic Pneumoniae, EP)的主要病原。猪地方流行性肺炎在又称猪气喘病,具有高发病率, 低死亡率的特点,发病后可出现慢性干咳,生长缓慢,发育迟缓等特点,感染后可引起猪免 疫力降低,从而导致其他病原如胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、肺炎巴氏杆 菌等混合感染,引发猪呼吸道综合征或者其他疾病,严重危害养猪业的发展。
Mhp分离困难,需要较长时间,且分离效率较低。即使分离成功,Mhp菌体特征不明显, 显微镜观察菌体无法得到明确的结果。Mhp的固体菌落直径仅500nm,菌落特征与其他支原 体菌落特征区别不明显(毕丁仁,"软皮体纲内霉形体的重新分类及最新命名",1997年兽医 微生物学学术年会论文集,第68-71页),因此分离培养难以成为Mhp的主要诊断方法。在分 子生物学方法得到充分发展前,血清学诊断是Mhp的主要诊断方法,现在仍然被广泛使用, 主要有免疫荧光技术,免疫酶技术,凝集试验,放射免疫酶试验,补体结合试验,间接血 凝试验以及ELISA。其中以间接血凝试验、补体结合试验、ELISA和放射免疫酶试验较为常 用。
随着分子生物学检测技术的发展,针对Mhp的诊断方法主要集中于DNA水平上的检测, 包括核酸探针检测和PCR检测。Stemke等(Molecular and Cellular Probes.1989, 3(3): 225-232) 将Mhp DNA的EcoR I酶切片断随机克隆后,用重组产物制成探针,该探针虽然在严格杂交 条件下对Mhp特异,但易与絮状支原体产生交叉反应,可检测到10pg的DNA,但无法直接 检测到病肺中的MhpDNA。随后,有一系列同位素、地高辛标记的探针被开发出来(Ahrens P等,Letters in Applied Microbiology, 1991,12(6): 249-253 ); Satoshi Futo等,Journal of Clinical Microbiology, 1992,30(6): 1509-1513; Kwon D等,Veterinary Pathology, 1999,36(4): 308-313)。 目前核酸探针主要用于基因克隆和克隆产物的鉴定,用于临床病例的检测,其敏感度和特异 性尚需要更进一步的发展,而且探针检测步骤复杂。于是,后来发展出了灵敏度更高、操作 更为简便的PCR检测方法(Blanchard等,Molecular and cellular probes. 1996,10(1): 15-22;of Clinical Microbiology, 1998,36(7): 1984-1988; Sorensen等,Veterinary Microbiology, 1997,54:23-24)。随着nested PCR方法的出现,PCR检测Mhp的灵敏度和特异 性进一步提高,同时临床样品的可检测时期也被延长(Stemke等,Molecular and Cellular Probes.1989, 3(3): 225-232; Stark等,Applied and Environmental Microbiology, 1998,64(2): 543-548; Calasmiglia等,Veterinary Microbiology, 2000, 76(3): 299-303)。
Real Time PCR即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法,是在PCR定性技术基础上发 展起来的核酸定量技术(MontgomeryRA等,Cytokine, 1997, 9(10): 717-726),又称荧光定量 PCR。
Real Time PCR不仅广泛应用于于基因表达解析,还广泛应用于SNP分型解析、物种鉴 定、病毒和病原菌的检测、转基因食品的定量分析、导入基因拷贝数的解析等诸多领域。Real Time PCR秉承及发展了普通PCR的快速、高灵敏度检出等优点,同时克服了普通PCR不能 准确定量、容易污染等不足。它不仅实现了对DNA模板的定量,而且具有灵敏度高、特异 性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、实时性和准确性等特点(张立 国等,生物技术,113(12):39-40;张蓓,国外医学临床生物化学与检验学分册, 2003,24(6):327-329;蔡刚,国外医学临床生物化学与检验学分册,2003,24(6):330-332)。
Real Time PCR的原理是利用在PCR反应体系中加入荧光物质,并通过Real Time PCR 检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测,最终对实验数据进行分析处理的 方法。根据引入荧光信号的方法不同,可将Real Time PCR分为下列几种荧光嵌合法(SYBR GREEN I法);TaqMan探针法;杂交探针法;分子信标法(Molecular beacons); scorpions方法; cycling探针法(张立国等,2003;张蓓,2003;蔡刚,2003;阳成波等,2003年;Takara, 2006;王小 红,2001; Joseph A. Whelan et al, 2003)。目前应用最广泛的是荧光嵌合法和TaqMan探针法。
近年来,国内外开始利用荧光定量PCR技术检测支原体,但目前仅限于Mhp的定性检 测,仍难以真正实现Mhp精确定量检测。
本发明人经过大量研究和反复实验,筛选出一对以Mhp p110基因为靶序列的引物 pU0realF/R及探针,在此基础上建立了一种能够对Mhp精确定量的TaqMan探针荧光PCR 检测方法。

发明内容
本发明目的在于提供用于猪肺炎支原体pllO基因定量检测用的荧光PCR引物及探针序 列,及使用该引物进行定量检测的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现根据己发表在GenBank上的猪肺炎支原体基因组
5pll0(p76)基因序列(ACCESSION No. NC—006360),应用MegAlign软件分析其基因序列, 根据引物和探针的设计原则,利用Primer Express v2,0软件设计荧光定量PCR引物及探针。
在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物,目前在荧光定量 PCR方法中最广泛使用的TaqMan探针就是运用了这个原理。PCR扩增时在反应体系加入一 对引物和一条模板特异性的荧光探针,该探针为一两端标记的寡核苷酸链,5'端标记一个荧 光报告基团和3'标记一个荧光淬灭基团,探针完整时5'端荧光基团吸收能量后将能量转移 给临近的3'端荧光淬灭基团,因此检测不到该探针5'端荧光基团发出的荧光。但在PCR 扩增中,模板变性低温退火后,T叫酶在引物的介导下,沿模板向前延伸,Taq酶的5' -3' 外切酶活性将早己结合在模板上的探针切割,5'端荧光报告基游离于反应体系中,脱离3' 端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号。即每有一条DNA链生成,就接收到一 个荧光分子,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成对应,常用的荧光基团是FAM, TET, VIC, HEX。
本发明提供了用于对猪肺炎支原体培养物半成品进行实时荧光定量PCR检测的引物对及 探针,其中所述的引物及探针是特异性针对猪肺炎支原体pllO基因的保守区域。
在本发明的方案中,其中所述的特异性地针对猪肺炎支原体pllO基因的引物对及探针,
其核苷酸序列为
P110realF : AGGATACAAACTGAGAAACCGAGCTA P110realR: CAAGACCGAGTGGGTATGACCT 探针TGGACAGATCGGTGATACAACCCCACA 附图简述


图1图示的是猪肺炎支原体基因组的扩增曲线结果。1,以基因组稀释10倍为模板的扩增曲
线;2,以基因组的10—2为模板的扩增曲线;3,以基因组的10—3为模板的扩增曲线;4,以基
因组的10—4为模板的扩增曲线;5,以基因组的10—5为模板的扩增曲线;6,以DDW为模板 的扩增曲线;
图2图示的是标准质粒的扩增曲线结果。1,以标准质粒稀释10倍(浓度为106拷贝/^1)为 模板的扩增曲线;2,以标准质粒的10—2(浓度为105拷贝~1)为模板的扩增曲线;3,以标准 质粒的10—3 (浓度为104拷贝&1)为模板的扩增曲线;4,以标准质粒的10"(浓度为103拷 贝尔l)为模板的扩增曲线;5,以标准质粒的10'5 (浓度为102拷贝&1)为模板的扩增曲线; 6,以标准质粒的UrS(浓度为10'拷贝/^1)为模板的扩增曲线;7,以DDW为模板的扩增曲 线;图3图示的是标准质粒的标准曲线结果。横轴表示起始模板浓度(log10),纵轴表示Ct值。将 标准质粒进行10倍梯度稀释,取六个浓度的稀释样品做模板,每个浓度做三组平行样,相关 系数=0.999,扩增效率=98.5%。
图4图示的是特异性试验结果。M, DL2000 plus; 1,以口腔支原体基因组为模板的PCR结 果;2,以细菌BL21基因组为模板的PCR结果;3,以细菌DH5a基因组为模板的PCR结果; 4,以猪鼻支原体基因组为模板的PCR结果;5,以猪肺炎支原体基因组为模板的PCR结果; 6,以猪圆环病毒DNA为模板的PCR结果;7,以PRRSVcDNA为模板的PCR结果;8,以 标准质粒为模板的PCR结果;9,以DDW为模板的PCR结果;
图5图示的是待检9个样品扩增曲线结果。1,以4号样品基因组为模板的扩增曲线;2,以 3号样品基因组为模板的扩增曲线;3,以7号样品基因组为模板的扩增曲线;4,以6号样 品基因组为模板的扩增曲线;5,以9号样品基因组为模板的扩增曲线;6,以5号样品基因 组为模板的扩增曲线;7,以1号样品基因组为模板的扩增曲线;8,以2号样品基因组为模 板的扩增曲线;9,以8号样品基因组为模板的扩增曲线;
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,而决不对本发明的内容和保护范围构 成任何限制。
实施例
试剂和设备
蛋白酶K购自MERCK公司;CTAB购自AMRESCO公司;/Ve附/x & 7^TM(perfect Real Time PCR) kit购自大连宝生物工程有限公司;其它试剂均为国产分析纯。Real Time PCR仪 (iCycler )购自美国BIO-RAD公司;Real Time PCR 8联管购自美国BIO-RAD公司;Real Time PCR 8联管盖子购自美国BIO-RAD公司。
实施例1 Mhp TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
本实施例旨在使用引物对pllOrealF/R及探针进行荧光定量PCR,建立了 Mhp TaqMan 荧光定量PCR检测方法。
1.1引物和探针的设计和合成
根据己发表在GenBank上的猪肺炎支原体基因组pllO(p76)基因序列(ACCESSION No. NC—006360),利用Primer Express v2.0软件设计下列荧光定量PCR弓|物及探针。
P110realF : AGGATACAAACTGAGAAACCGAGCTA
P110realR: CAAGACCGAGTGGGTATGACCT
探针TGGACAGATCGGTGATACAACCCCACA1.2猪肺炎支原体基因组的提取
1) 将lml Mhp支原体培养物12000rpm室温离心10 min,弃上清;
2) 向沉淀中加入300h1蛋白酶K裂解缓冲体系U0mM Tris-EDTA [pH=7.5] , 0.5% [wt/vol] SDS, 100|ag/ml蛋白酶K)中,充分悬浮后6(TC消化1 h;
3) 加入5MNaC150pl , CTAB (10% [wt/vol], 0.7M NaCl) 40 pi ,混匀后65。C作用 10 min;
4) 加等体积苯酚氯仿,轻轻混匀,12000卬m 4。C离心5min;
5) 小心吸取350|_il上层水样到另一空离心管中,加1/10体积的3M NaAC混匀后再加 入2倍体积-20。C预冷的无水乙醇,4'C放置2 h或过夜;
6) 12000 rpm, 4。C离心10min;
7) 弃上清,用700pl 75%酒精洗涤沉淀,将离心管倒置于吸水纸上,使酒精彻底干燥;
8) 加30pl-5(^1灭菌DDW溶解,分装后-20'C保存。 1.3荧光PCR反应体系及反应条件的建立
按下列配制Real Time PCR反应体系(20ial):
尸rewk五jc 7b《1 M(2 X ) 1 OjJ
PCR Forward Primer(lO, 0.4nl
PCR Reverse Primer(lOjxM) 0.4(^1
荧光探针溶液 0.8^1
DNA 2pl
ddw 6.4/jI
反应液配好后,瞬时离心,将样品管放入Real-time PCR仪后,按照iVe附;x五x 7i^TM试 剂盒说明书,采用如下条件进行反应95°C 30秒预变性,95°C IO秒变性,60°C 31秒复性 及延伸,变性及复性过程重复共40个循环。根据扩增曲线判定结果。延伸过程中荧光定量 PCR仪采集记录490nm波长的荧光信号。 1.4 TaqMan Real Time PCR方法的建立 1.4.1 Mhp基因组10倍梯度稀释
1) 取7个灭菌的1.5ml离心管,编号为l-7,每管加入90^11灭菌DDW;
2) 取提纯的Mhp基因组10W,将其加入l号管,更换移液器枪头;
3) 将1号管混匀,取1(HU加入2号管,更换移液器枪头;
4) 依次类推,至7号管,更换移液器枪头,将7号管混匀;
5) 将稀释好的不同浓度的基因组分别分装,-20"备用。 1.4.2扩增曲线的建立
8项方法提基因组,用灭菌DDW将基因组 进行IO倍梯度稀释,稀释至10—7。取稀释倍数为10々-l(^的基因组作模板DNA,按照1.3项 进行Real Time PCR。根据扩增过程中荧光值的变化,由软件计算出荧光阚值(Threshold value),并计算出各条曲线的Ct(Cyclethreshold)值。以Ct值为横坐标,荧光值为纵坐标,建 立荧光定量PCR的扩增曲线。根据扩增曲线形状及Ct值的变化,分析PCR体系的可信性, 结果见图l。 1.4.3标准曲线的建立
扩增曲线建立后,根据扩增曲线由软件自动分析计算Ct值;将稀释倍数为l(T7、 10—6、……
icr2的基因组浓度依次规定为10'拷贝/w、 102拷贝411、……106拷贝杨以模板起始浓度的 对数值为横轴,以ct值为纵轴,由软件拟合出标准曲线;根据曲线的相关系数(一)确定标准
曲线的可信度;结合标准曲线的斜率(sl叩e),由软件或者根据公式计算PCR扩增效率(E)。 计算公式E=10[—1/sl°pe]-l。
由三组扩增曲线得到三组Ct值,由软件拟合出三组标准曲线。相关系数—反映标准曲线 的直线性,理想值应大于0.98,越接近l说明直线性越好,定量越准确。理想的PCR扩增效 率应在0.8<E<1.2范围,用pllOrealF/R引物及探针进行TaqMan荧光定量PCR建立标准曲线, 相关系数分别为0.999,说明标准曲线的直线性良好。扩增效率分别是87.5%,结果表明引物 pllOrealF/R及探针符合荧光定量PCR技术的要求。
1.5标准质粒的构建
1.5.1引物设计及PCR产物制备
根据己发表在GenBank上的猪肺炎支原体基因组p110基因序列(ACCESSION NO. NC—006360, NC—007332, NC—007295),结合筛选出的pllOrealF/R引物,使用DNAStar软件 的Primerselect设计引物对
PI 1 OcloneF: GCGGATCCACCAGGTGCATCTTCATC
P11 OcloneR: GCTC丁AGACCGCTGTGGCTAATAGTA
该引物对由上海生物工程公司合成,上述pllOrealF/R处于该引物对扩增的序列内。 以1.2中提取猪肺炎支原体DNA为模板,加引物对P110cloneF / R建立50pl反应体系
灭菌去离子水 33.7p
10 X PCR buffer 5 ^
2.5 mmol/l dNTP 4 jal
rTaq(5U^d) 0,
P110cloneF(10pmol/nl) 3^1
P11 OcloneR( 1 Opmol/(il) 3 (il
DNA模板 lplPCR反应热循环参数为95'C预变性5min; 95'C变性45秒、55"C退火30秒、72'C延 伸1分钟,共30个循环;然后72°C延伸5 min。取4^1 PCR扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶 电泳以5V/cm的电压电泳30min, EB染色20min后,紫外凝胶成像系统下观察结果。 1.5.2重组质粒的制备及鉴定
使用购自全式金公司的EASY PCR purification试剂盒,按照产品说明书进行PCR产物纯 化。将回收的PCR产物克隆到pEASY-Tl中,连接产物转化DH5a感受态细胞,向管中加入 800pl LB培养基,37'C摇床中150 rpm摇动培养1 h,取20(^1菌液涂布于含AMP( 100 u g/ml) 的LB平板上,37。C培养过夜。从平板上随机挑取单菌落,分别接种到5ml LB(AMP+, 100 u g/ml)液体培养基中进行37"C振荡培养10 h,采用碱裂解法小量制备质粒DNA,将质粒DNA 溶于30Ml灭菌TE中,取4jnl电泳鉴定,其余-20'C保存。电泳后通过凝胶成像系统观察结果, 根据质粒大小初步判断挑选阳性重组质粒。以初步判断为阳性的重组质粒进行PCR扩增,除 以重组质粒代替猪肺炎支原体基因组DNA外,PCR反应体系及反应条件同1.5.1。反应结束 后,取4nl PCR扩增产物以5V/cm的电压进行琼脂糖凝胶电泳30min,紫外凝胶成像系统 下观察结果。将PCR鉴定阳性的重组质粒送交公司测序,将测序结果与GENBANK公布的 Mhp p110基因序列进行对比,与公布序列一致的重组质粒为阳性质粒,将构建的含有Mhp p110基因的重组质粒记做标准质粒pEASY-Tl-p110。 1.6标准质粒的扩增曲线的建立
将标准质粒进行适度稀释,用紫外分光光度计在260nm波长测定其OD值,结合标准质 粒的分子量,计算每nl溶液中质粒拷贝数。
将已计算出拷贝数的标准质粒进行10倍梯度稀释,稀释至10拷贝/>1。取浓度为106-101 拷贝4d的标准质粒为模板,pllOrealF/R为引物,用BIO-RAD icycler荧光定量PCR仪做Real TimePCR,每个浓度做3个平行样,根据结果建立扩增曲线,曲线遵循从高浓度到低浓度的 次序排列,每个浓度的三个平行样Ct值差异不显著,如图2所示。 1.7标准质粒的标准曲线的建立
以拷贝数为106-10V|al的标准质粒为模板做Real Time PCR,每个浓度同时做三个平行样。 反应结朿后由软件自动分析荧光阈值,结合扩增曲线计算出Ct值,然后以模板起始浓度的对 数值为横轴,以荧光值为纵轴,由软件拟合得到标准曲线,并计算出曲线的相关系数和PCR 扩增效率。
将标准质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行PCR,每个浓度做3个平行样,扩增结朿 后由计算机根据起始模板浓度的对数值和相应的Ct值拟合出标准曲线,标准曲线相关系数 =0.999,表明不同梯度定量模板的对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线直线性好。经计算,标准曲线扩增效率E:98.5y。,如图3所示。 1.8 TaqMan荧光定量PCR方法反应条件的优化
以标准质粒为模板,pllOrealF/R为引物,选用不同的引物浓度、退火温度、延伸时间进 行Real Time PCR反应,根据PCR反应结果,选择最佳Real Time PCR反应条件。
通过多次实验,确定的荧光定量PCR最佳反应条件是最佳引物终浓度为0.2tmiol/l;
PCR反应体系如下(20pl):
p謂/x £x rVM(2 x) 1 Onl
PCR Forward Primer(l0, O.争
PCR Reverse Primer(l O岸) 0,
荧光探针溶液 0.8^
DNA 2^1
DDW 6牟
循环参数95'C 3分钟预变性,95°C 5秒变性,60°C 30秒复性及延伸,变性及复性过程 重复共40个循环。
实施例2猪肺炎支原体荧光PCR检测方法的特异性试验
分别实验室常见的实验室常见的基因工程菌(大肠杆菌DH5(x株和BL21株)、口腔支原 体、以及常与猪肺炎支原体混合感染病原体(猪圆环病毒、PRRSV和猪鼻支原体)为对照样 品,同时以标准质粒作为阳性对照,以灭菌DDW作为阴性对照,检验基于猪肺炎支原体基础 上的荧光PCR检测方法的特异性。 2.1实验材料
对照用的口腔支原体(Mycoplasma orale) CVCC 379株、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis) CVCC 361株均购自中国兽医药品监察所,其他均为实验室保存菌种。 2.2样品前处理 2. 2. 1病毒DNA的获得
按照Invitrogen公司说明书提取PRRSV RNA。利用Oligo(dt) 15 Primer (Promega),按照 PROMEGA公司M-MLV Reverse Transcriptase说明书进行反转录,合成的cDNA保存于-2(TC , 用作PCR模板。PCV利用天泽基因公司的病毒DNAout试剂盒提取DNA,保存于-20'C ,用 作PCR模板。 2. 2. 2细菌基因组的获得
按照常规方法复苏基因工程菌株£.coh' DH5cu BL21。上述菌株菌液分别各取50W,用 天泽基因公司的细菌基因组out试剂盒提取基因组,保存于-2(TC,用作PCR模板。2.2.3 口腔支原体和猪鼻支原体基因组的获得
口腔支原体CVCC 379株和猪鼻支原体CVCC 361株基因组提取方法同1.2。 2.3引物对pllOrealF/R的特异性试验
取2. 2. 2中制备的各种细菌基因组、2. 2. 3中制备的各种支原体基因组、2. 2. 1中制备的 PRRSV cDNA和PCV的DNA、标准质粒及DDW分别模板做PCR。 PCR体系(50^1)如下
灭菌去离子水 31.7nl
10xPCR buffer 5pl
2.5 mmol/1 dNTP 4pl
rTaq(5U/pl) 0.3nl
pI10realF(10pmol/nl) 3^1
pllOrealR(10pmoI/nl) 3^1
DNA模板 3 PCR反应热循环参数为
95'C预变性 5 min
95。C变性 30s
60'C退火 30s
72。C延伸 30s 重复35个循环
72。C延伸 5min
PCR产物各取4pl,在1%的琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压电泳30min,通过紫外凝胶 成像系统观察结果,结果如图1所示。
从图4可知,阳性对照及以Mhp为模板的泳道5和8在约100bp处出现一特异性条带, 与预期大小117bp符合,其余泳道的扩增产物均为引物二聚体。这表明本发明所设计的引物 对能够满足特异性检测的需要,并且与检测样品中可能存在的其它微生物不存在交叉干扰现 象。
实施例3猪肺炎支原体荧光PCR检测方法的灵敏度试验
将已计算出拷贝数的含目的基因的标准质粒做IO倍梯度稀释,稀释至10拷贝/pl。取浓度 为106、 105、 104、 103、 102、 1(^拷贝尔1的质粒为模板做Real Time PCR。有产物的最低起始 模板浓度即为该Real Time PCR的灵敏度。根据扩增曲线分析,该Real Time PCR方法检测灵 敏度为10拷贝/jul或者是20拷贝/20pl反应体系。详见图2。
实施例4荧光PCR方法对培养物中猪支原体的定量检测4. 1待检样品准备
培养三代猪肺炎支原体培养物,每代设有三个平行样,培养48小时后收获,分别记为 l-9号样品,收获时立即作测定CCU实验,每天观察变色情况。
得到9个待检样品,按照实施1中所述提取基因组的方法,提取基因组。以9个样品的 1000倍稀释液和标准质粒的10倍梯度稀释物为模板,作荧光定量PCR,根据建立的标准曲 线,计算待检的样品的拷贝数。 4. 2实验结果
9个样品中8号的CCU值为10—7,其他均为10—8。 8号样品的荧光定量PCR计算的拷贝 数为6.52 X106,其他为4.8土2.5X107,见图5,实验结果表明建立的荧光定量方法与传统 的CCU计数方法有显著的相关性,因此建立的荧光检测方法可以用于猪肺炎支原体培养物的 定量检测。
1权利要求
1.用于对猪肺炎支原体培养物进行实时荧光定量PCR检测的引物对及探针,其中所述的引物对及探针特异性针对猪肺炎支原体的P110基因的保守区域。
2. 权利要求1所述的引物对和探针,其中所述引物对及探针的序列为-P110realF : AGGATACAAACTGAGAAACCGAGCTAPI 10reaR: CAAGACCGAGTGGGTATGACCT 探针TGGACAGATCGGTGATACAACCCCACA
3. —种对猪肺炎支原体进行定量检测的实时荧光PCR检测方法,该方法包括下列步骤1) 菌株的培养;2) 对Mhp的基因组的提取;3) 向提取得基因组样品加入权利要求1所述引物对及探针,以及PCR扩增用的户re则^^y WM(2X)、 DDW,得到PCR扩增反应液;4) 将装有PCR扩增反应液的PCR管置于荧光PCR仪上;5) 根据所用的荧光染料类型,选择对应的荧光通道,进行荧光PCR扩增,记录各检测样 本的PCR扩增循环数(Ct);6) 根据各样本的反应Ct值,按照标准曲线判定待检样本中Mhp的拷贝数。
4. 权利要求3所述的实时荧光PCR检测方法,该方法使用权利要求2所述的引物对及探 针。权利要求3所述的实时荧光PCR检测方法,其中所述的基因组提取包括-1) 将lml Mhp支原体培养物12000rpm室温离心10 min,弃上清;2) 向沉淀中加入300nL蛋白酶K裂解缓冲体系(10mM Tris-EDTA [pH=7.5] , 0.5% [wt/vol] SDS, lOOpg/ml蛋白酶K)中,充分悬浮后6(TC消化1 h;3) 加入5MNaC150pL , CTAB (10% [wt/vol], 0.7MNaCl) 40 pL ,混匀后65。C作用 10 min;4) 加等体积苯酚氯仿,轻轻混匀,12000rpm 4'C离心5min;5) 小心吸取350pL上层水样到另一空离心管中,加1/10体积的3MNaAC混匀后再加 入2倍体积-20。C预冷的无水乙醇,4'C放置2 h或过夜;6) 12000 rpm, 4。C离心10min;7) 弃上清,用700pL 75%酒精洗涤沉淀,将离心管倒置于吸水纸上,使酒精彻底千燥;8) 加30pL-50nL灭菌DDW溶解,分装后-20。C保存。
5. 权利要求3所述的实时荧光PCR检测方法,其中荧光PCR扩增条件为95°C 3分钟预变性,95°C 5秒变性,60°C 30秒复性及延伸,变性及复性过程重复共40个循环。
6.权利要求1或2所述引物对及探针在用于猪肺炎支原体的检测中的用途。
全文摘要
本发明提供了用于检测猪肺炎支原体的实时荧光定量PCR引物以及使用其进行定量检测的方法。猪肺炎支原体是猪地方流行性肺炎的主要病原,其极难培养,形态太小不易借助显微镜定量检测,而传统的支原体CCU检测方法和CFU检测方法耗时长,且污染几率高,且培养基、操作方法或判断标准的不同都可能导致检测结果不一致,难以实际应用。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法利用已知浓度的含目的基因的标准质粒做参照,具有快速、灵敏度高、定量精确的优点,可用于猪肺炎支原体培养物和疫苗半成品的定量或微量检测。
文档编号C12Q1/68GK101492741SQ20091007753
公开日2009年7月29日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者侯绍华, 弋 同 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
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