专利名称：一株芽孢杆菌及其在棒曲霉防治中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株芽孢杆菌及其应用，特别是涉及该芽孢杆菌及其在棒曲霉防治中 的应用。
背景技术：
棒曲霉(Aspergillus clavalus)是曲霉属的一种丝状真菌，棒曲霉产生的棒曲霉 素具有致畸性和致癌性，对动物的胚胎具有致死性，人误食棒曲霉或棒曲霉素污染的食物 易发生神经系统症状，如头晕、头痛、迟钝、躁动或运动失调，甚至出现惊厥、昏迷、麻痹等症 状。棒曲霉素主要污染苹果及其制品，严重影响我国苹果制品的出口 ；此外，饲料也常受到 棒曲霉菌的污染。目前，棒曲霉的防治方法主要有以下几种1、喷洒农药法主要用于苹果的田间防护，但是大量农药的施用容易引起二次污 染，危害人体健康，同时对生态环境造成污染；2、纸包或塑料袋包装法主要用于苹果的田间防护，但是这种防护方法应用起来 比较麻烦，费时费力，并且也对生态环境造成污染；3、聚乙烯(PE)袋包装配合气调法主要用于苹果贮藏过程的防护，将苹果包装在 聚乙烯(PE)袋中，同时用C02或者N2调节贮藏室的气体，可以有效的抑制棒曲霉菌的生长， 但是这种方法需要修建特殊的贮藏室，花费比较大；4、冷藏法主要用于苹果贮藏过程的防护，但是这种方法需要修建大型的冷库，投 资比较大，并且单独应用冷藏法不能完全抑制棒曲霉的生长；5、化学法可以用于苹果的田间防护和苹果收获后贮藏过程的防护，但是化学试 剂的毒副作用使得该方法的广泛应用受到一定的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的芽孢杆菌，该菌株经过发酵后能够产生具有抑制棒 曲霉作用的活性代谢产物，该活性代谢产物可用于制备防治棒曲霉的生防制剂，用于棒曲 霉的生物防治。本发明所提供的芽孢杆菌，是芽孢杆菌(Bacillus sp.)NA2008-JKl,已于2009年 2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北 京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No 2914。芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914，是从陕西省白水县宏达果 库的红富士苹果中分离得到的。本发明的另一个目的是提供一种防治棒曲霉的生防制剂。本发明所提供的防治棒曲霉的生防制剂，是发酵芽孢杆菌(Bacillus sp.) NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914 得到的代谢产物。所述代谢产物可从除去芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns2914菌体的发酵滤液中获得。上述生防制剂中，所述发酵芽孢杆菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC No 2914 的发酵培养基的组成为蛋白胨1%、牛肉膏0. 3%, NaCl 0. 5%，其余为水；所述百分含量 均为质量百分含量；所述发酵培养基的pH值为7. 0-7. 2。所述发酵培养条件为36°C 38°C，140r/m 160r/m，旋转半径20mm 26mm，振荡 培养20h 24h。本发明的第三个目的是提供上述防治棒曲霉的生防制剂的制备方法。本发明所提供的防治棒曲霉的生防制剂的制备方法，是发酵芽孢杆菌 (Bacillussp.)NA2008-JKl CGMCC No 2914，从其发酵液中分离得到的代谢产物即为防治棒 曲霉的生防制剂。上述制备方法中，所述发酵芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC No 2914 的发酵培养基的组成为蛋白胨1%、牛肉膏0. 3%, NaCl 0. 5%，其余为水；所述百分含量 均为质量百分含量；所述发酵培养基的pH值为7. 0-7. 2。所述发酵培养条件为36°C 38°C，140r/m 160r/m，旋转半径20mm 26mm，振荡 培养20h 24h。实验证明，本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914对棒 曲霉具有很强的拮抗作用。平板菌落的抑菌活性试验结果表明，芽孢杆菌(Bacillussp.) NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914能明显抑制棒曲霉菌的生长，棒曲霉菌落的平均直径为 13. 4mm，且棒曲霉随时间的推移不再生长；而对照菌株则不能抑制棒曲霉菌的生长，棒曲霉 越过对照菌株继续生长，3天后棒曲霉菌落的平均直径为32. 3mm。抑菌圈实验结果表明，芽 孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914发酵滤液在PDA平板上可对棒曲霉产生 明显的抑菌圈，抑菌圈的平均直径为15. 6mm。因此，芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914和用它制备的生防制 剂在棒曲霉的防治中具有良好的应用前景。
图 1 为芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC No 2914 的具体形态图2为芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914与棒曲霉的平板对峙
培养试验结果图3为芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914对棒曲霉产生的抑菌 圈的照片
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实现本发明所采用的培养基具体如下所述1、细菌(NA)培养基蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、NaCl 0.5%，其余为水；pH7.0-7.2。所述百分含量均为质量百分含量。在NA液体培养基中加入1.5%质量百分含量 的琼脂即得到NA固体培养基。2、马铃薯(PDA)培养基去皮马铃薯20%、葡萄糖2%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢 钾0.1%，其余为水；pH 6.8-6.2。所述百分含量均为质量百分含量。在PDA液体培养基中 加入2%质量百分含量的琼脂即得到PDA固体培养基。实施例1、芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008JK1 CGMCC Ns 2914的分离、纯化及鉴
定将取自陕西省白水县宏达果库的红富士苹果放在pH6. 8的0. 07mol/L的PBS洗液 中振荡5min，摇床转速180r/min，洗去苹果表面黏附的微生物；然后将上述清洗过的苹果 加入到pH6. 8的0. 07mol/L的PBS洗液中振荡15min，摇床转速240r/min ；取出苹果，将洗 液用无菌水倍比稀释后涂布在NA培养基平板上，28°C条件下培养。不到24h，菌落便布满整 个平板，菌落呈白色、不透明。挑取上述NA培养基平板上的单菌落将其命名为NA2008-JK1，对NA2008-JK1进行 染色观察，具体过程如下在一块干净的载玻片上滴一滴无菌水，用接种环挑取单菌落，轻 轻在无菌水中涂布均勻，待水分干燥后，载玻片于火焰上停留l_2s，以固定菌体；在菌体上 滴加结晶紫染色液lmin后，用清水冲洗，干燥后显微镜下观察。按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙 英等编著，北京科学出版社，2001. 2)中描述的方法，对菌株NA2008-JK1进行形态特征、培 养特性和生理生化特性鉴定，具体结果如下(1)菌体的形态特征该菌株细胞呈直杆状，细胞中部有明显芽孢，每个细胞产一个芽孢，生孢不被氧所 抑制，芽孢椭圆形，侧生鞭毛，革兰氏阳性。菌株的具体形态如图1所示。(2)培养特性菌落白色，不透明，好氧，在NA培养基平板上生长迅速，当培养基中NaCl的质量百 分含量大于10%时不能生长。(3)生理生化特性在碱性培养基上不能分解木质素、不能分解硫胺素、不含脂环酸、接触酶阳 性、产乳酸、V-P测定阳性、能将硝酸盐还原为亚硝酸盐、能水解酪朊、能水解淀粉。基于以上特征，将菌株NA2008-JK1鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，并于2009年 2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北 京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No 2914。实施例2、芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914及其代谢产物的 抑菌活性试验1、平板菌落的抑菌活性试验采用平板对峙法，将培养48h后的棒曲霉(Aspergillus clavalus)(购于中国农 业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC30579)用直径0. 5cm的打孔器打制菌饼，然后 将菌饼置于PDA培养基平板中央，在不同培养皿中，距离棒曲霉菌饼1cm处分别点接芽孢杆 菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914或无拮抗作用的对照菌株，将培养皿用封口 膜密封，置于25°C培养箱中培养，3天后观察试验结果。每处理三个重复。
对峙培养的结果如图2所示。其中左侧图为无拮抗作用的对照菌株，右侧图为芽 孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914。结果表明，芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914能明显抑制棒曲 霉菌的生长，棒曲霉菌落的平均直径为13. 4mm，且棒曲霉随时间的推移不再生长；而对照 菌株则不能抑制棒曲霉菌的生长，棒曲霉越过对照菌株继续生长，3天后棒曲霉菌落的平均 直径为32. 3mmo2、抑菌圈测定采用平板打孔法。将芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914接种于 NA液体培养基中，37°C培养2天后，将发酵液过滤，所得滤液置于90°C水浴中加热15min，备 用。将培养3天的棒曲霉(Aspergillus clavalus)(购于中国农业微生物菌种保藏管理中 心，保藏编号ACCC30579)用无菌生理盐水洗脱其孢子，制备成1 X 105CFU/mL的孢子悬浮 液，取0. lmL孢子悬浮液均勻涂布于PDA培养基平板上，静置30min后，取牛津杯置于平板 中央，将0. 25mL上述90°C水浴加热处理后的芽孢杆菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC M 2914的发酵滤液注入牛津杯中，对照组注入同样体积的NA液体培养基，封口膜密封， 25°C培养3天后观察试验结果，十字交叉法测量抑菌圈直径。每处理三个重复。抑菌试验结果如图3所示。其中左侧图为NA液体培养基，右侧图为芽孢杆菌 (Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914 的发酵液。实验结果表明，芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914发酵滤液在 PDA平板上可对棒曲霉产生明显的抑菌圈，其三次重复的抑菌圈平均直径为15. 6mm。
权利要求
芽孢杆菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1，其保藏登记号为CGMCC №2914。
2.芽孢杆菌(Bacillussp.)NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914在制备防治棒曲霉的生防制 剂中的应用。
3.一种防治棒曲霉的生防制剂，是发酵芽孢杆菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1CGMCC Na 2914得到的代谢产物。
4.根据权利要求3所述的生防制剂，其特征在于所述代谢产物从除去芽孢杆菌 (Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914 菌体的发酵滤液中获得。
5.根据权利要求3或4所述的生防制剂，其特征在于所述发酵芽孢杆菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Na 2914的发酵培养基的组成为蛋白胨1%、牛肉膏0. 3%, NaCl 0. 5%，其余为水；所述百分含量均为质量百分含量；所述发酵培养基的PH值为7. 0-7. 2。
6.根据权利要求5所述的生防制剂，其特征在于所述发酵培养条件为36°C 38°C， 140r/m 160r/m，旋转半径20mm 26mm，振荡培养20h 24h。
7.一种制备权利要求3-6中任一所述的防治棒曲霉的生防制剂的方法，是发酵芽孢杆 菌(Bacillus sp.)NA2008-JKl CGMCC N2 2914，从其发酵液中分离得到的代谢产物即为防 治棒曲霉的生防制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述发酵芽孢杆菌(Bacillussp.) NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914的发酵培养基的组成为蛋白胨1 %、牛肉膏0. 3%、NaC10. 5%， 其余为水；所述百分含量均为质量百分含量；所述发酵培养基的PH值为7. 0-7. 2。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述发酵培养条件为36°C 38°C，140r/ m 160r/m，旋转半径20mm 26mm，振荡培养20h 24h。
10.权利要求3-6中任一所述的生防制剂在防治棒曲霉中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株芽孢杆菌及其在棒曲霉防治中的应用。该菌株是芽孢杆菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC №2914。该菌株经过发酵后产生对棒曲霉具有拮抗作用的代谢产物。平板菌落的抑菌活性试验结果表明，芽孢杆菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC №2914能明显抑制棒曲霉菌的生长，棒曲霉菌落的平均直径为13.4mm，且棒曲霉随时间的推移不再生长；而对照菌株则不能抑制棒曲霉菌的生长，棒曲霉越过对照菌株继续生长，3天后棒曲霉菌落的平均直径为32.3mm。抑菌圈实验结果表明，芽孢杆菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC №2914发酵滤液在PDA平板上可对棒曲霉产生明显的抑菌圈，抑菌圈的平均直径为15.6mm。
文档编号C12N1/20GK101824389SQ20091007870
公开日2010年9月8日 申请日期2009年3月2日 优先权日2009年3月2日
发明者刘阳, 张亚健, 邢福国 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所