专利名称：：白藜芦醇合酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及白藜芦醇合酶及其编码基因与应用。
背景技术：
：白藜芦醇是蒽醌萜类化合物，主要来源于蓼科植物虎杖的根茎提取物。白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，是植物受到病原性进攻和环境恶化时产生的一种植物抗毒素，广泛存在于种子植物中，包括藜芦、决明、虎杖、葡萄、桑梓、花生、凤梨等。研究表明，虎杖中的白藜芦醇含量明显高于其它植物。白藜芦醇不仅是一种重要的植物抗毒素，还具有众多的药理和保健功能，主要包括抗癌作用；心血管保护作用；抗氧化、抗自由基作用；神经保护作用；消炎作用；抗细菌、真菌作用；机体损伤的保护作用；植物雌激素作用；对骨代谢和内皮素拮抗剂的影响等。其中，最令人瞩目和具有发展前景的是其在抗肿瘤、心血管保护、抗氧化方面的作用。白藜芦醇的应用前景非常广泛，已引起广泛关注。据报道，白藜芦醇对鼻咽癌、肺癌、肠癌、胃癌、乳腺癌、白血病等均有拮抗作用，例如，在2.5-10mg/kg的剂量范围内，白藜芦醇可使小白鼠的肿瘤体积减小42%，重量降低44%，使肿瘤向肺部的转移减慢56%。尤其是，白藜芦醇对癌症的起始、增殖、发展三个主要阶段均有抑制乃至逆转作用(1)抑制起始作用减少自由基形成，诱导II期药代酶增多，拮抗二噁英作用。(2)抑制增进作用抑制环氧合酶(COX)，抑制过氧化氢酶。(3)抑制发展作用抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞分化，诱导癌细胞凋亡。特别是白藜芦醇对癌细胞具有选择性的杀伤力，同时对癌症具有化学预防作用，是一种极有前景的抗癌新药，不仅可以用于癌症的治疗，也可以用于癌症的预防，而且毒性很小。白藜芦醇对冠心病也有防护作用(1)可以抑制血小板聚集，调节血脂代谢，引起血管舒张，对慢性缺血心肌起保护作用，减轻梗塞面积。(2)休克的治疗效应增加脉压，促进毛细血管开放，减少休克时白细胞激活和粘附，扩张微血管，改善微循环，增强心功能，提高心输出量，提高休克动物存活率。白藜芦醇具有抗氧化、清除自由基以及影响花生四烯酸代谢的作用。白藜芦醇这方面的药理作用和保健功能最引人注目，因为这些生理代谢涉及到与人体健康密切相关的许多生理疾病，如动脉粥样硬化、老年痴呆症、老年人退行疾病、病毒性肝炎、炎症与过敏反应、胃溃疡、辐射损伤等，不仅关系到人们的健康，更关系到人们的生活质量。近年来的研究表明，白藜芦醇苷还具有增强心肌收缩，调节血管张力，改善微循环，保护肝细胞，降血脂及抗氧化等作用。
发明内容本发明的目的是提供一种白藜芦醇合酶及其编码基因与应用。本发明所提供白藜芦醇合酶，命名为PcSTS，来源于虎杖，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白藜芦醇合成相关的由a)衍生的蛋白质。为了使a)的PcSTS蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述b)中的PcSTS蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的PcSTS蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。所述PcSTS蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述蛋白的编码基因是如下1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1；2)在严格条件下与1)限定的DNA片段杂交且编码与白藜芦醇合成相关的蛋白的DNA分子；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性，且编码与白藜芦醇合成相关的蛋白的DNA分子。所述步骤3)中的基因，与1)的基因最好有95%以上的同源性。上述严格条件可为在6XSSC,0.5%SDS的溶液中，在68°C下杂交，然后用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。扩增PcSTS基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上述PcSTS基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种生产白藜芦醇的方法。本发明所提供的生产白藜芦醇的方法，是将所述基因导入宿主菌中获得重组菌；以香豆酸为底物，发酵培养所述重组菌生产白藜芦醇。所述宿主菌具体可为酵母、芽孢杆菌或大肠杆菌等。本发明从虎杖中克隆了一个白藜芦醇合酶基因，该基因编码的蛋白具有白藜芦醇合酶功能，在体外酶促反应体系中能够催化香豆酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A聚合形成具有生物活性的白藜芦醇。目前，虎杖是生产白藜芦醇的主要原料。本发明将白藜芦醇合酶编码基因在酿酒酵母中表达，发酵该酿酒酵母生产白藜芦醇，白藜芦醇的产量可达到lmg/L。本发明生产白藜芦醇的方法解决了原料的限制问题，且生产工艺简单，获得的白藜芦醇的纯度高，易于纯化，有利于大规模的工业生产。图1为PcSTS蛋白SDS-PAGE电泳图。A纯化后的PcSTS蛋白，B上清液，C总蛋白，M；蛋白分子量标准。图2为酶促反应产物HPLC-MS检测结果。A=HPLC检测图谱，B保留时间为5.38分钟的物质的质谱图。图3为pESC:4CL-STS酵母表达载体图谱。图4为重组酵母以香豆酸为底物的发酵产物的HPLC检测图谱。A为白藜芦醇标准品(购于Sigma)HPLC图谱，B为重组酵母以香豆酸为底物的发酵产物的HPLC结果。具体实施例方式下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。下述实施例中的百分含量如无特殊说明均为质量百分含量。实施例1、生产白藜芦醇DPcSTS蛋白的获得使用奥莱博生物技术公司植物RNA提取试剂盒提取虎杖的幼叶总RNA，采用天根生物技术公司反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。以该cDNA为模板PCR扩增白藜芦醇合酶基因。PCR扩增所用引物为Pl和P2，Pl和P2的核苷酸序列如下Pl5'-TCACATATGGCAGCTTCAACTGAAGAGATG-3‘(下划线表示NdeI识别位点)；P2:5，-TAACTCGAGAATGATGGGCACACTTCGTAG-3‘(下划线表示XhoI识别位点)。PCR反应条件为95°C变性4分钟；94°C30秒、55°C30秒、72°C90秒，30个循环；72°C延伸10分钟。PCR扩增出1200bp左右的片段，回收后经过NdeI/XhoI双酶切后连接到pET30a载体上，构建重组质粒pET30a-PcSTS，并转化大肠杆菌BL21，以Pl和P2为引物PCR鉴定阳性克隆，扩增出1200bp左右片段的克隆为阳性克隆，命名为BL21-PcSTS。提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，克隆得到的cDNA序列如序列表中序列1所示，序列表中的序列1由1167个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。挑取BL21-PcSTS单克隆接种到100mlLB培养基中，37°C200转/分钟培养至OD6tltl=0.6，加入IPTG使其终浓度为0.4mmol/L，26°C诱导培养8小时。诱导培养结束后12000转/分钟离心2分钟收集菌体，适量bindingbuffer(pH8.0的25mMTris-HCL，250mM氯化钾，5mM咪唑，2mM巯基乙醇)重悬菌体，冰浴中超声破碎，然后12000转/分钟离心20分钟，将上清转移至用bindingbuffer平衡好的Ni-琼脂糖柱(购于Novogen)中，用5X柱体积bindingbuffer洗柱，再用5X柱体积washingbuffer(25mMTris_HCL，pH8.0，250mM氯化钾，20mM咪唑，2mM巯基乙醇)洗柱，最后用3mlelutionbuffer(pH8.O的25mMTris-HCL,250mM氯化钾，500mM咪唑，2mM巯基乙醇)洗脱目的蛋白，收集洗脱液。SDS-PAGE和Bradford法对蛋白纯度和浓度进行分析。SDS-PAGE电泳图谱如图1所示，目的蛋白浓度为0.75mg/mL,该蛋白命名为PcSTS蛋白。2)HPLC-MS检测PcSTS蛋白体外酶促反应产物250uL标准酶促反应体系含有150uM的香豆酰辅酶A，280uM丙二酸单酰辅酶A，0.IM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，以及2.Oug的PcSTS蛋白。上述反应体系置于30°C下反应30分钟后，加入终浓度为5%(体积百分含量)的乙酸，之后用250uL的乙酸乙酯抽提并于IOOOOg下离心10分钟。去上层液真空干燥后，加入50uL50%(体积百分含量)的甲醇水溶液。使用配有KromosilC18反相柱(5um，250mmX4.6mm)的WatersAlliance2695高效液相色谱系统(HPLC)分析酶促反应产物。流动相为水(A)和甲醇(B)，流速为0.6mlmirT1，使用以下梯度条件30%(体积百分含量)B3分钟、30-70%(体积百分含量)B27分钟、70-80%(体积百分含量)B2分钟、80-95%(体积百分含量)B3分钟以及95%(体积百分含量)B5分钟。检测波长为330nm。质谱检测条件为波普范围设定在120-350；干燥气体流速，1.5Lmin_1,CDL温度250°C，block温度200°C,probe电压+4.5kV。酶促反应产物的HPLC-MS检测结果如图2所示，表明产物的结构如式1所示，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式1该产物为白藜芦醇。上述结果表明，PcSTS蛋白具有白藜芦醇合酶功能，在体外酶促反应体系中能够催化香豆酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A聚合形成具有生物活性的白藜芦醇。3)生产白藜芦醇设计引物PCLlGCGAATTCATGGAGAAAGATACAAAA(下划线为EcoRI位点)；PCL2:ACGTTAATTAATTTGGAAGCCCAGCAG(下划线为PacI位点)。以PCLl和PCL2为引物，烟草总RNA反转录的cDNA为模板，扩增出1700bp左右的4CL基因，EcoRI和PacI双酶切4CL基因，连接入pESC_HIS3(购于Merck)载体，构建的载体命名为pESC::4CL。设计引物PSlTAGGATCCATGGCAGCTTCAACTGAAGAG(下划线为BamHI位点)，PS2GCGCTCGAGAATGATGGGCACACTTCGT(下划线为XhoI位点)。以PSl和PS2为引物，虎杖总RNA反转录的cDNA为模板，扩增出1200bp左右的PcSTS,BamHI和XhoI双酶切后连接入pESC::4CL载体，构建的载体命名为pESC:4CL-STS载体。pESC::4CL-STS酵母表达载体图谱如图3所示。通过醋酸锂沉淀法将载体pESC:4CL-STS转入营养缺陷型酿酒酵母W330A(ATCC公司)，通过酵母HIS缺失培养基(购于Oxiod)筛选和以引物PSl和PS2进行PCR验证后得到阳性克隆。接种阳性克隆于IOOmLHIS缺失培养基，30°C振荡培养至OD6tltlO.6左右后加入80mg香豆酸(购于Sigma)，继续培养16小时。收集上述培养得到的菌液，加入等体积的乙酸乙酯抽提，取上层乙酸乙酯于一新瓶中，挥干，加入50%甲醇水溶液，溶解沉淀，进行HPLC检测，HPLC检测方法同步骤2)。HPLC检测图谱如图4所示，表明将PcSTS基因导入酿酒酵母中，利用该酿酒酵母以香豆酸为底物的发酵产物为白藜芦醇，白藜芦醇的产量可达到lmg/L。序列表<110>中国科学院植物研究所<120>白藜芦醇合酶及其编码基因与应用<130>CGGNARW92122<160>2<210>1<211>1167<212>DNA<213>虎杖(Polygonumcuspidatum)<400>1atggcagcttcaactgaagagatgatgaaggcacaaacagccgccaccgtcctggccatc60ggcacggccaatcctcccaattgctactaccaagctgactttcccgacttctacttccgt120gccaccaacagcgaccacctcacccacctcaagcacaaattcaagcgcatttgtgagaag180tcaatgattgagaagcgttaccttcaattgacggaagacattctcaaagaaaacccgaat240atcggtgcgtacgaggcaccatcattggatgtaagacacgaaattcaagtgaaaggagtt300gcacagcttgggaaagaggccgctctcaaggccatgcaagagtggggccaacccaaatct360aagatcacacatctcatcgtgtgttgcatagccggggttgacatgccaggtgcagattat420caactcactaagcttcttgacctaaactcttctgttaagcgcttcatgttttaccaccta480ggatgttacgctggtggcaccgtccttcgtcttgccaaggatatagccgagaacaacaaa540ggagctcgtgttctcatcgtttgttcagagatgacgccaatctgcttccgtgggccatct600gaaacccatatagactccatggtagggcaagcaatatttggtgatggtgctgcagctgtc660atagttggagcgaacccagacctaacagttgagaagcccattttcgagttgatttccaca720gcccaaactatcatacctgaatctgatggtgcgattgagggccatttgctagaagttgga780ctcagtttccaactctaccagaatgtccccgcactagtctctaataacatagaaacatgc840ctttcagaagctttcacccctctaaacattagcaattggaactccctcttctggatcgca900catcctggtggccctgctatcctagaccatgttgaggccaccgttggtctcaacaaggag960aaacttaaggcaaccagacaagtgctgaacgactatggaaacatgtcaagtgcttgtgtg1020ttttttatcatggatgagatgaggaagaagtcacttgaaaacggccacgcaaccactgga1080gaaggactgcagtggggcgttctgtttggattcgggcctggtattactgttgaaactgtg1140gtgctacgaagtgtgcccatcatttaa1167<210>2<211>388<212>PRT<213>虎杖(Polygonumcuspidatum)<400>2MetAlaAlaSerThrGluGluMetMetLysAlaGlnThrAlaAlaThr151015ValLeuAlalieGlyThrAlaAsnProProAsnCysTyrTyrGlnAla202530AspPheProAspPheTyrPheArgAlaThrAsnSerAspHisLeuThr354045HisLeuLysHisLysPheLysArglieCysGluLysSerMetlieGlu505560LysArgTyrLeuGlnLeuThrGluAsplieLeuLysGluAsnProAsn65707580lieGlyAlaTyrGluAlaProSerLeuAspValArgHisGlulieGln859095ValLysGlyValAlaGlnLeuGlyLysGluAlaAlaLeuLysAlaMet100105110GlnGluTrpGlyGlnProLysSerLyslieThrHisLeulieValCys115120125CyslieAlaGlyValAspMetProGlyAlaAspTyrGlnLeuThrLys130135140LeuLeuAspLeuAsnSerSerValLysArgPheMetPheTyrHisLeu145150155160GlyCysTyrAlaGlyGlyThrValLeuArgLeuAlaLysAsplieAla165170175GluAsnAsnLysGlyAlaArgValLeulieValCysSerGluMetThr180185190ProlieCysPheArgGlyProSerGluThrHislieAspSerMetVal195200205GlyGlnAlaliePheGlyAspGlyAlaAlaAlaVallieValGlyAla210215220AsnProAspLeuThrValGluLysProliePheGluLeulieSerThr225230235240AlaGlnThrlielieProGluSerAspGlyAlalieGluGlyHisLeu245250255LeuGluValGlyLeuSerPheGlnLeuTyrGlnAsnValProAlaLeu260265270ValSerAsnAsnlieGluThrCysLeuSerGluAlaPheThrProLeu275280285AsnlieSerAsnTrpAsnSerLeuPheTrplieAlaHisProGlyGly290295300ProAlalieLeuAspHisValGluAlaThrValGlyLeuAsnLysGlu305310315320LysLeuLysAlaThrArgGlnValLeuAsnAspTyrGlyAsnMetSer325330335SerAlaCysValPhePhelieMetAspGluMetArgLysLysSerLeu340345350GluAsnGlyHisAlaThrThrGlyGluGlyLeuGlnTrpGlyValLeu355360365PheGlyPheGlyProGlylieThrValGluThrValValLeuArgSer370375380ValProlielie38权利要求一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白藜芦醇合成相关的由a)衍生的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在严格条件下与1)限定的DNA片段杂交且编码与白藜芦醇合成相关的蛋白的DNA分子；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性，且编码与白藜芦醇合成相关的蛋白的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。5.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。6.一种生产白藜芦醇的方法，是将权利要求2或3所述基因导入宿主菌中获得重组菌；以香豆酸为底物，发酵培养所述重组菌生产白藜芦醇。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述宿主菌为酵母、芽孢杆菌或大肠杆菌。8.扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。9.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4所述重组表达载体、权利要求5所述转基因细胞系或重组菌在生产白藜芦醇中的应用。全文摘要本发明公开了白藜芦醇合酶及其编码基因与应用。该白藜芦醇合酶是序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；该蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列1；本发明还公开了生产白藜芦醇的方法，是将所述基因导入宿主菌中获得重组菌；以香豆酸为底物，发酵培养所述重组菌生产白藜芦醇。本发明生产白藜芦醇的方法解决了原料的限制问题，生产工艺简单，且白藜芦醇的产量大，利于工业化生产。文档编号C12N15/63GK101824404SQ20091007883公开日2010年9月8日申请日期2009年3月3日优先权日2009年3月3日发明者刘本叶,叶和春,李国凤,王红,郭艳武,马兰青申请人:中国科学院植物研究所