专利名称：微管内等电聚焦和剪断吹出培养测定微生物等电点的方法
技术领域：
本发明应用一种微管内等电聚焦和将微管等分剪断，再吹出微生 物进行培养，测定微生物等电点的方法，属于生物分析领域。
背景技术：
微生物具有表面电荷和两性特性，具有等电点(pl)。微生物表面 电荷和等电点特性是由微生物细胞膜或细胞壁表面的氨基酸残基、糖 蛋白和脂类等分子的总体带电性质所决定。因此，不同微生物以及不 同生长代谢状态时的微生物均可用其表面电荷特性以及等电点特性 进行表征。研究微生物表面电荷的带电特征，可表征微生物自身的生 理生化特性，并对研究其生长代谢状态、检测和表征微生物表面的生 化反应等具有重要的理论和应用价值。已有毛细管电泳方法主要是将 微生物样品进行等点聚焦分离，以初步分离不同的微生物，通过比较 微生物样品与等电点标记物迁移时间的相对关系估算等电点。此等点 聚焦方法需要经过复杂的进样步骤，且不能直观地检测到活体微生物 和准确测定微生物等电点。目前生物学尚没有通用的确定微生物等电 点的测定方法和报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决简单、快速、直观判断微生物等电点 范围的问题，而提供一种微管内等电聚焦和剪断吹出培养测定微生物 等电点的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的
本发明的一种微管内等电聚焦和剪断吹出培养测定微生物等电 点的方法，具体测量步骤为
1)用0.1M盐酸对微管壁进行冲洗，去除管壁上附着的杂质；然 后将体积分数为4%的载体两性电解质和体积分数为0.1%为甲基纤维素加入无菌水，向其中加入微生物样品，浓度为105cfti/ml，构成 样品溶液，注满微管； 一端插入阴极缓冲液，另一端插入阳极缓冲液， 然后加10~25KV的恒定电压进行聚焦，待电流平稳后，聚焦完成， 停止加电压，使微管内部形成连续pH梯度的两性电解质。
其中微管材料为石英熔融、光纤或高分子聚合物，内径 25-1000pm，长度20-200cm。
2) 将微管取出，根据所加两性电解质形成的pH梯度与微管总长 的线性关系，对微管进行等分剪断，使每段微管指示了一定的pH范 围。
3) 用无菌水将微管内溶液吹出到固体培养基上，进行细菌培养。 对细菌培养结果进行菌落观察，根据有菌落生长的微管在总管长中所 处的位置来确定微生物的pH范围，即等电点范围。
本发明的有益效果是
1) 自由溶液等电聚焦操作简单，对所用微管要求不高，无需对 微管内壁进行修饰和复杂的前处理。
2) 检测方法采用细菌培养的生物学方法，成熟可靠。
3) 测定方法简单，快速，直观，该方法不仅可用于各种微生物 等电点测定，并可用于微生物菌种的筛选。
图l为微管内充满溶液示意图2为微管内等电聚焦完成示意图3为微管等分剪断示意图4为每段微管内液体吹出培养示意图。
其中l-检测窗口。
具体实施例方式
实施例11) 将熔融石英毛细管(100|umi.d.柱长52cm)用0.1MHC1冲 洗5 min。
用磷酸盐缓冲液(PBS pH 7.0)将菌样制成菌悬液。使用时用PBS 溶液稀释至10SCFU/ml浓度，并加入4%两性电解质(Ampholine ， pH范围3.5-10.0)和0.1%甲基纤维素制成细菌样品。
2) 用手动泵向毛细管内注入制备好的细菌样品，使用阴极缓冲 液20mMNaOH，阳极缓冲液20 mM H3P04，加15kV进行聚焦。聚 焦15min后，电流趋于平稳，聚焦完成，停止加电压。
3) 轻轻水平取出含细菌溶液的毛细管，将毛细管等分切断，每 4cm长为一段，52cm共切成13段，则每段对应的pH范围为0.5。 用无菌水将每段的样品液吹出至已灭菌的固体LB培养基上进行细菌 培养，同时设置空白对照。细菌培养条件为37'C恒温培养18~24h。 对培养结果进行观察。在pH范围为6.5~7 —段毛细管吹出的样品， 有微生物Exoli JM83菌落生长，而其它平板及空白对照组均无菌落 生长，从而可以确定微生物E.coliJM83的等电点在pH6.5 7之间。
实施例2
将熔融石英毛细管(lOOiumi.d.柱长52cm)用0.1MHC1冲洗5
min。
改变菌悬液浓度，菌悬液用PBS溶液稀释至106CFU/ml浓度， 并加入4%两性电解质Ampholine (pH范围3.5-10.0)和0.1%甲基
纤维素制成细菌样品。
等电聚焦其他条件同上。
每4cm长为一段，52cm共切成13段，用无菌水将每段的样品 液吹出至已灭菌的固体LB培养基上进行细菌培养，同时设置空白对 照。细菌培养条件为37。C恒温培养18 24h。
实施例3
将熔融石英毛细管(lOOpmi.d.柱长52cm)用0.1MHC1冲洗5mm0
改变菌悬液浓度。菌悬液用PBS溶液稀释至107CFU/ml浓度， 并加入4%载体两性电解质(Ampholine ， pH范围3.5-10.0)和0.1%
甲基纤维素制成细菌样品。 等电聚焦其他条件同上。
每4cm长为一段，52cm共切成13段，用无菌水将每段的样品 液吹出至已灭菌的固体LB培养基上进行细菌培养，同时设置空白对 照。细菌培养条件为37"C恒温培养18~24h。
权利要求
1、微管内等电聚焦和剪断吹出培养测定微生物等电点的方法，其特征在于具体测量步骤如下1)用0.1M盐酸对微管壁进行冲洗，去除管壁上附着的杂质；然后将体积分数为4％的载体两性电解质和体积分数为0.1％为甲基纤维素加入无菌水，向其中加入微生物样品，浓度为105cfu/ml，构成样品溶液，注满微管；一端插入阴极缓冲液，另一端插入阳极缓冲液，然后加10～25KV的恒定电压进行聚焦，待电流平稳后，聚焦完成，停止加电压，使微管内部形成连续pH梯度的两性电解质；2)将微管取出，根据所加两性电解质形成的pH梯度与微管总长的线性关系，对微管进行等分剪断，使每段微管指示了一定的pH范围；3)用无菌水将微管内溶液吹出到固体培养基上，进行细菌培养；对细菌培养结果进行菌落观察，根据有菌落生长的微管在总长中所处的位置来确定微生物的pH范围，即等电点范围。
2、 如权利要求1所述的微管内等电聚焦和剪断吹出培养测定微生物等 电点的方法，其特征在于其中微管材料为石英熔融、光纤或高分子聚合 物，内径25 1000iim，长度20 200cm。
全文摘要
本发明为微管内等电聚焦和剪断吹出培养测定微生物等电点的方法，属于生物分析领域。本发明首先将载体两性电解质溶液在毛细管内采用恒定电压进行等电聚焦，使毛细管内形成了连续pH梯度的两性电解质；然后根据所加两性电解质形成的pH梯度与毛细管总长的线性关系，对毛细管进行等分剪断；最后对每段微管样品进行菌落培养，根据有菌落生长的微管在总管长中所处的位置来确定微生物的pH范围。本发明测定方法简单，快速，直观，该方法不仅可用于各种微生物等电点测定，并可用于微生物菌种的筛选。
文档编号C12Q1/02GK101556261SQ20091008483
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月25日 优先权日2009年5月25日
发明者锋 屈, 蔡波太, 马文韬 申请人:北京理工大学