专利名称：一种培育耐旱植物的方法及其专用重组质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培育耐旱植物的方法及其专用重组质粒。
背景技术：
干旱与水资源短缺已成为制约世界农业和社会发展的重要因素，同时受温室效 应的影响，水资源短缺的问题将愈来愈突出。玉米是世界上三大粮食作物之一，也是重要 的饲料作物，在世界农业生产中占有相当重要的地位。我国是世界上第二大玉米生产国， 也是最大的玉米消费国。干旱是影响玉米产量的重要因素之一，也是限制我国玉米生产 发展和产量提高的第一要素(Hu R-F(胡瑞法)，Meng Erika C-H, Zhang S_H(张世煌)， Shi X-H(石晓华)· Prioritization for maize research anddevelopment in China. Sci Agric Sin (中国农业科学)，2004，37 (6) :781_787 (inChinese with English abstract))。 因此，国内外对玉米抗旱育种的研究越来越重视，然而由于玉米抗旱性状属于数量性状，采 用传统育种方法获得优良抗旱品种十分困难。禾_转基因技术将具有优良性状的外源基因 导入作物中，培育出具有优良性状的作物新品种，为作物的抗逆育种开辟了一条新的途径。植物的转基因抗逆育种，主要有3个方面的问题一方面是目的基因的选择，主 要包括功能抗逆基因和调控抗逆基因，转录因子由于能调控下游一系列抗逆基因的表达而 逐渐受到人们的重视；其次是启动子的选择，由于抗逆基因的组成型表达会给正常生长条 件下的植物带来负面影响，而用胁迫诱导的启动子驱动时对转基因植株生长的影响很小 (Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Improving plantdrought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a singlestress-inducible transcription factor. Novartis Found Symp，2001，236 :176_186)，因此抗逆基因工程需要选择逆境诱导表达的 启动子；转基因抗逆育种的另一重要方面是对获得的转基因植株进行抗逆性的评估，需要 从分子水平、生理水平和代谢水平上对获得的转基因植物进行检测，对于转转录因子抗逆 基因工程育种来说，逆境下其下游调控的抗逆基因表达水平的检测也很重要。植物在非生物胁迫的胁迫下主要表达两类基因编码产物为直接保护植物免受 环境胁迫的功能蛋白类的基因及调控基因表达和胁迫信号转导的基因；第一类基因包 括LEA蛋白基因、抗冻蛋白基因、脯氨酸合成酶基因等；第二类基因包括各种激酶和转录 因子等(Kasuga M，Liu Q，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，ShinozakiK. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transferof a single stress inducible transcription factor. Nat Biotechnol，1999，17 :287_291)。转录因子因 为调控下游一系列抗逆基因的表达而逐渐受到重视，转转录因子抗逆基因工程的研究 也大量展幵(Hsieh T H，Lee J T，Charng Y Y，ChanM T. Tomato plants ectopicaly expressing Arabidopsis CBFlshow enhancedresistance to water deficit stress. Plant Physiol，2002，130 :618_626) (Lee S C，Choi H W，Hwang I S，Choi D S，Hwang B K.Functional roles ofthe pepper pathogen-induced bZIP transcription factor， CAbZIPl， in enhancedresistance to pathogen infection and environmentalstresses. Planta, 2006, 224 1209-1225) (Dai X Y, Xu Y Y, Ma Q B, Xu W Y, Wang T, Xue Y B, ChongK. Overexpression of an R1R2R3MYB gene, 0sMYB3R_2, increases tolerance tofreezing, drought, and salt stress in transgenic Arabidopsis. Plant Physiol, 2007,143 1739-1751)(Gutha L R，Reddy A R.Rice DREBlB promoter showsdistinct stress-specific responses, and the overexpression of cDNA intobacco confers improved abiotic and biotic stress tolerance. Plant Mol Biol. 2008,68 :533_555)。CBF转录因子是一类受低温或干旱诱导的转录因子，它们特异地与CRT/ DRE(C-repeat dehydrat ion-responsive element)DNA i周控元件结合，激 舌下訪字冷诱 导或脱水诱导基因的表达，从而提高植物的抗逆能力。CBF4转录因子是拟南芥中的 干旱应答转录因子，其在拟南芥中超表达可提高拟南芥的抗旱和抗冻能力(Haake V, Cook D, Ri echmann J L, Pineda 0, Thomashow M F, Zhang J Ζ.Transcription factor CBF4is a regulator of drought adaptation inArabidopsis. Plant Physiol, 2002，130 =639-648) 0 rd29A基因是拟南芥中受干旱、高盐、低温胁迫等诱导表达的基因 (Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Characterization of the expression of a desiccation-responsive rd29geneof Arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants. Mol Gen Genet, 1993, 236 :331_340)。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育耐旱植物的方法及其专用重组质粒。本发明提供的重组质粒，是含有CBF4基因的重组质粒；所述重组质粒中，CBF4基 因由拟南芥rd29A基因(拟南芥亲水蛋白rd29A基因)的启动子驱动。所述重组质粒可为在pSP72质粒中插入如下DNA片段得到的重组质粒在BamHI 和SacI酶切位点间插入拟南芥CBF4基因；在Hind III和Bam HI酶切位点间插入拟南芥 rd29A(RD29A)基因的启动子；在HindIIII位点插入DNA片段B ；所述DNA片段B自上游至 下游依次为CaMV35S启动子、玉米Adhl内含子和EPSP基因。所述CaMV35S启动子、玉米Adhl内含子的制备方法如下用HindIII和BamHI酶 切质粒 pBARGUS(Vasi 1, V.，et al, Bio/technology, 10(6) :667_674，1992)回收 1. Okb 片 段，该片段含CaMV35S启动子(0. 45kb)和玉米Adhl内含子(0. 55kb)序列。所述EPSP基因的核苷酸序列具体可为GenBank Accession Number X63374. 1自 5’末端第1至1335位核苷酸。所述重组质粒还可为在PSP72质粒中插入如下DNA片段得到的重组质粒在 BamHI和Sac I酶切位点间插入拟南芥CBF4基因；在Hind III和Bam HI酶切位点间插入 拟南芥rd29A基因的启动子。所述CBF4基因的核苷酸序列具体可为GenBank Accession Number NM_124578自 5’末端第1至675位核苷酸；所述拟南芥亲水蛋白rd29A基因的启动子的核苷酸序列具体 可为 GenBank Accession Number D13044 自 5，末端第 3928 至 5410 位核苷酸。所述重组质粒在培育转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。所述转基因植株具体可为抗旱转基因植物，如抗旱转基因玉米。本发明还保护一种培育抗旱植物的方法，是将所述重组质粒导入植物细胞中，得到抗旱植物。所述植物具体可为玉米。本发明还保护一种培育脯氨酸含量和/或叶绿色含量提高的植物的方法，是将所述重组质粒导入植物中，得到脯氨酸含量和/或叶绿色含量提高的植物。所述植物具体可 为玉米。本研究用PCR方法克隆了拟南芥菜脱水应答转录因子CBF4基因，以逆境诱导表达 基因rd29A的启动子为驱动，构建了逆境诱导表达载体PBAC146。用基因枪转化法转化玉米 优良自交系的幼胚和胚性愈伤组织，轰击后的愈伤组织经过筛选、分化和植株再生过程，共 获得36棵转基因植株。经PCR、PCR-Southern和Southern检测表明，外源目的基因已成功 整合到部分转基因玉米株系的基因组中。人工干旱处理下，转基因株系的抗旱生理指标测 定显示，一个转基因株系的脯氨酸含量和叶绿素含量比野生型对照提高一倍，间接表明转 基因株系的抗旱能力在某种程度上有所提高。
图1为pBAC146重组质粒的图谱。图2为愈伤组织的诱导、分化与转基因玉米苗的田间移栽；A 玉米幼胚诱导培养基上诱导愈伤组织；B 愈伤在筛选培养基上筛选；C 分化出 苗；D 壮苗；E 移栽。图3为转基因Ttl代植株外源CBF4基因片段的PCR检测；M :DL2000plus ladder ；+ 阳性质粒pBAC146 ；0 空白；-阴性对照(ck) ；1 12 转基因玉米Ttl代植株。图4为转基因T1代植株外源CBF4基因片段的PCR检测；M :DL2000plus ladder ；+ 阳性质粒 pBAC146 ；0 空白；_ 阴性对照(ck) ；1 4 转基因玉米T1代植株。图5为转基因T1代植株外源CBF4基因片段的PCR-Southern分析；+ 阳性质粒PBAC146 ；0 空白；-阴性对照(ck) ；1 4 转基因玉米T1代植株。图6为转基因Tl代玉米植株的Southern杂交检测；+ 阳性质粒pBAC146 ；0 阴性对照(ck) ； 1 4 转基因植株。图7为转基因玉米脯氨酸含量测定结果；Ck 转空载体植株(对照)；1 8 转基因植株。图8为转基因玉米叶绿素含量测定结果；Ck 转空载体植株(对照)；1 8 转基因植株。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。玉米辽单青贮178(北京农业生物技术研究中心作物遗传育种实验室)； pGEM-Teasy Vector、T4DNA连接酶等购自Promega公司；Taq DNA聚合酶、氨苄青霉素、 IPTG、X-gal等试剂均购自大连宝生物工程有限公司；DNA回收试剂盒购自天根生化科技公司；限制性内切酶购自Promega、New England Biolabs ；地高辛(DIG)标记与检测试剂盒和 化学发光检测试剂盒购自Roche Diagnostics GmbH公司；普通生化试剂购自Sigma公司、 Promega公司或国产。基因枪型号PDS_1000/He (BioRad)实施例1、重组质粒pBAC146的构建一、重组质粒pSHK49H3的构建1、将质粒 pBARGUS(Vasil，V.，et al, Bio/technology, 10(6) :667_674，1992)用 HindIII和BamHI酶切，回收1. Okb片段，该片段含CaMV35S启动子(0. 45kb) +玉米Adhl内 含子(0. 55kb)序列。2、将步骤1得到的1. Okb片段插入到pSP72的HindIII和BamHI位点，得到重组质粒。3、将编码抗除草剂草甘膦的玉米EPSP基因(GenBank Accession NumberX63374. 1 自5’末端第1至1335核苷酸序列)插入步骤2得到的重组质粒的BamHI和EcoRI位点间， 获得重组质粒PSHK49。4、将重组质粒pSHK49用EcoRI位点酶切后补成平端，引入含HindIII位点的适配 子(adaptor) CCCAAGCTTGGG序列，将得到的重组质粒命名为重组质粒pSHK49H3。二、重组质粒pBAC145的构建1、制备拟南芥 CBF4 基因(GenBank Accession Number NM124578 自 5，末端第 1 至675核苷酸)。2、制备拟南芥 rd29A 基因启动子(GenBank Accession Number D13044 自 5，末端 第3928至5410位核苷酸)。3、将 CBF4 基因用 Bam HI 和 SacI 酶切后插入到 pSP72 (Promega)的 Bam HI 和 Sac I位点间，得到重组质粒。4、将rd29A基因启动子用HindIII和Bam HI酶切后插入到步骤3得到的重组质 粒的Hind III和Bam HI酶切位点间，得到重组质粒pBAC145。三、重组质粒pBAC146的构建用HindIII酶切重组质粒pSHK49H3，回收2. 3kb片段(该片段含 35S+intron+EPSP)，将该2. 3kb片段插入到重组质粒的pBAC145的HindIIII酶切位点间， 选择正向插入阳性质粒，进行测序，测序结果表明获得了重组质粒pBAC146(如图1所示)。pBAC146以CaMV 35S启动子和玉米Adhl基因的Intronl驱动的EPSP基因作为选 择标记基因，目的基因CBF4以拟南芥亲水蛋白rd29A基因的启动子驱动。rd29A基因的启 动子在受到干旱、冷害、盐渍等胁迫时表达，在正常条件下并不表达或表达量很低，对转基 因植株的正常生长没有影响。四、对照质粒的构建1、重组质粒pSHK49H3的构建方法同实施例1的步骤一。2、对照质粒的构建用HindIII酶切重组质粒pSHK49H3，回收2. 3kb片段(该片段含 35S+intron+EPSP)，将该2. 3kb片段插入到pSP72 (Promega)的HindIIII酶切位点，选择正 向插入阳性质粒，进行测序，测序结果表明获得了含携带DNA片段B的重组质粒，将其作为对照质粒；所述DNA片段B自上游至下游依次为CaMV35S启动子、玉米Adhl内含子和EPSP基因。实施例2、转基因玉米的获得和鉴定一、转基因玉米的获得取授粉后12d左右的辽单青贮178的果穗，经75%乙醇表面消毒后挑取其幼胚接 种到诱导培养基(N6基本培养基+10mgL-1 AgNO3+100mg L-1肌醇+2mg L-12,4-0+308 L-1 蔗糖+7g L—1琼脂)上，暗培养3 5d后诱导出胚性愈伤组织。纯化好的PBAC146质粒 调整浓度为Iygy L—1，按张晓东等的方法(Zhang X-D (张晓东)，Li D-M (李冬梅)，Xu W-Y (徐文英)，Jiang Y-Y (蒋有绎)，Hu D-F (胡道芬)，HanL-X (韩立新)· Development of transgenic wheat by biolistic bombardmenttransferring Basta resistance gene and novel HMW Glutenin subumit genes. Acta Agric Boreali—Sin (华北农学 艮)，1997, 12(1) :133-136(in Chinese))进行基因枪微弹的制备，PDS-1000/He型基因枪轰击胚性愈 伤组织，5d后将愈伤组织转移到含有草甘膦的筛选培养基(诱导培养基中加入Img L—1草 甘膦)上筛选20d左右。然后选取生长正常的愈伤组织转移到分化培养基(N6基本培养基 +0. 5mg L-11AgNO3+100mg L-1 肌醇+1. 5mg L^KT+SOg L—1 蔗糖+7g Γ1 琼脂+0. 5mg L-1 草甘 膦)上分化，分化的幼苗进行壮苗后移栽到温室。获得转基因植株的过程中，在各个时期进行观察和拍照，见图2。共获得36株转基 因再生植株(T0代)。用对照质粒代替PBAC146质粒，其它步骤同上，得到转空载体玉米，作为对照。二、转基因玉米的鉴定(一)Ttl代转基因玉米植株的鉴定 用CTAB法对转基因玉米叶片进行基因组DNA的提取，根据rd29A基因片段和CBF4 基因片段设计引物(上游引物为rd29A5 5，-AGGGTTTGATTACTTCTATTGG-3 ’ ；下游引物为 rdcbf3 :5，-TATGATTCCAGCCAACTTCC-3，；见序列表的序列1和序列2)，对36株转基因植株 (Ttl代)进行PCR检测。转空载体玉米植株为阴性对照，PBAC146为阳性对照，水为空白对 照。PCR 反应体系ddH2017. 3μ L，DNA 1 μ L (1 μ g μ L-1)，10 X PCR Reaction Buffer2. 5 μ L, dNTPs (2. 5mmol L-1) 2 μ L,上游引物 1 μ L,下游引物 1 μ L, Taq DNA 聚合酶 (5U μ L-1)。· 2μ L。PCR 反应程序95°C变性 5min ；94°C变性 50s，45°C复性 50s，72°C延伸 50s，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。反应产物用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测。阳性质粒和13株转基因植株扩增出了 669bp的目标片段，而转空载体玉米植株 (阴性对照)和水(空白对照)没有扩增出带，初步说明外源CBF4基因片段整合到部分转 化玉米株系的基因组。部分植株PCR检测结果见图3。(二)T1代转基因玉米植株的鉴定获得的Ttl代转基因植株移栽到温室后，4株成功结实获得T1代，对转基因植株的 T1代进行鉴定，转空载体玉米植株的T1代作为阴性对照，PBAC146为阳性对照，水为空白对眧。1、PCR 鉴定方法同步骤(一)，检测结果如图4所示。有四个转基因株系扩增出669bp目标片段，表明这四个转基因株系均整合进了外源目的基因片段。2、PCR-Southern 鉴定为了防止假阳性的出现，将步骤1鉴定阳性的四个转基因株系进行PCR-Southern鉴定，步骤如下(1)以pBAC146为模板，rd29A5和rdcbf3为上下游引物，按照Roche公司PCR DIG Probe Synthesis Kit使用手册提供的步骤进行探针标记，PCR所得产物经胶回收后作为杂 交探针。(2)对转基因植株基因组DNA进行PCR反应，反应体系和反应程序步骤(一)，PCR 产物电泳后按照785型真空转膜仪(Bio-Rad)使用手册进行转膜，信号检测按照Roche公 司的DIG DNA Labeling and Detection Kit使用手册提供的方法进行。结果如图5所示。四个转基因株系的PCR-Southern结果也为阳性，进一步验证了 PCR结果。3、Southern 杂交鉴定为避免PCR及PCR-Southern检测结果中假阳性的出现，又对PCR-Southern检测 呈阳性的四个株系进行了 Southern杂交检测，步骤如下(1)为了使用适宜大小的Southern检测探针(500bp左右最佳)，根据CBF4 基因序列设计引物(上游引物5’ -CTGGGAGGAAGAAGTTTCGT GAG-3’ ；下游引物 5，-CGTTATGATTCCAGCCAACTTCC-3，)，用该引物按照 Roche 公司 PCR DIG ProbeSynthesis Kit使用手册提供的步骤进行探针标记。(2) Southern 步骤参照 Sambrook 等(Sambrook J,Russell D. MolecularCloning A Laboratory Manual,3rd edn. New York CoId Spring HarborLaboratory Press,2001. PP 304-331)方法进行。植物基因组DNA利用HindIII进行完全酶切。酶切产物浓缩后、 0. 8%琼脂糖凝胶、25V电泳过夜，转膜、杂交，然后进行信号检测(同步骤2)。结果如图6所示。阳性质粒和3个转基因株系出现特异性杂交信号，转空载体植 株没有出现杂交信号，由于质粒PBAC146上含有两个HindIII酶切位点，因此Southern杂 交结果不能看出外源基因导入的拷贝数。Southern杂交结果进一步证实外源基因CBF4成 功导入到转基因玉米基因组中。三、转基因玉米的耐旱能力鉴定为了验证所获得的转基因株系的抗旱能力，将T1代长势较好的并且经分子检测阳 性的1个转基因株系所获得的种子(T2代)种植到温室花盆中，并通过PCR的方法筛选到8 个阳性植株，将该8个植株干旱处理如下(转空载体玉米植株的T2代作为对照)将植株的3周龄苗置于26_28°C、相对湿度为15_20%、连续光照下，不浇水，观察 表型并拍照同。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株均分别为15株。1、转基因玉米植株的脯氨酸含量测定脯氨酸作为一种重要的细胞内渗透调节物质，其在植物受到水分胁迫时可出现大 量积累。大量研究表明，在干旱胁迫下，玉米不同生育期的叶片中游离脯氨酸含量均有明显 增加。一般来说，同一品种，脯氨酸含量越高，抗旱性越强。转基因玉米的T2代人工抗旱处理6d后，用磺基水杨酸法测定其叶片中的游离脯 氨酸含量，测定方法参见王军卫等(Wang J W，Yang F P，Chen X Q，Zhang L Q，Geng D M，Zhang X D, Song Y Z, Zhang G S. Induced expression of DREBtranscriptional factor and study on its physiological effects of droughttolerance in transgenic wheat. Acta Genet Sin, 2006，33 :468_476)。结果见图7。除2号和5号转基因植株的脯氨酸含量比对照较低外，其余转基因植 株均比对照高，其中7号最高，达到了 199. 53mg L—1，将近对照的2. 5倍，而其余也比对照高 出20%以上，脯氨酸含量测定结果间接表明转基因植株的抗旱能力高于转空载体植株。2、转基因玉米植株的叶绿素含量测定叶绿素是植物叶片的主要光合色素，叶绿素含量是植物生理研究中的重要指标。转基因玉米的T2代人工抗旱处理6d后，参照彭运生等(Peng Y_S(彭运生)， LiuE(>ClJM). Comparative study about extraction method of chlorophyll. ActaAgric Univ Pekingsis (北京农业大学学报)，1992，18 (3) :247_250(in Chinese))的方法进行叶 绿素含量测定，取玉米叶片的中部，准确称取鲜重(W)，剪碎，置于15mL试管中，采用丙酮 无水乙醇(2 1)混合液浸提，每个样品加IOml混合液，绝对黑暗的环境中浸提24h。取 提取液于721型分光光度计分别在波长663nm和645nm下读取OD值，按以下公式计算Ca、 Cb。
叶绿素 Ca=(12‘7D663_2‘69D645”V
1000W
cb_ (22.69D645 - 4.68D663) * V 1000W结果见图8。干旱处理下的部分转基因植株的叶绿素含量远远高于对照水平，其 中5号(2. 25mg g-1)叶绿素含量是对照的2倍，此项结果也表明部分转基因株系的抗旱性 高于转空载体株系。序列表<110>北京市农林科学院<120> 一种培育耐旱植物的方法及其专用重组质粒<130>CG6NARY92438<160>2<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1agggtttgat tacttctatt gg 22<210>2<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220><223><400>2tatgattcca gccaacttcc 20
权利要求
含有CBF4基因的重组质粒；所述重组质粒中，CBF4基因由拟南芥rd29A基因的启动子驱动。
2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述重组质粒是在PSP72质粒中插入 如下DNA片段得到的在BamHI和Sac I酶切位点间插入拟南芥CBF4基因；在Hind III和 Bam HI酶切位点间插入拟南芥rd29A基因的启动子；在HindIIII酶切位点插入DNA片段 B ；所述DNA片段B自上游至下游依次为CaMV35S启动子、玉米Adhl内含子和EPSP基因。
3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于所述EPSP基因的核苷酸序列为 GenBank Accession Number X63374. 1 自 5，末端第 1 至 1335 位核苷酸。
4.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述重组质粒是在PSP72质粒中插入 如下DNA片段得到的在BamHI和Sac I酶切位点间插入拟南芥CBF4基因；在Hind III和 BamHI酶切位点间插入拟南芥rd29A基因的启动子。
5.如权利要求1至4中任一所述的重组质粒，其特征在于所述CBF4基因的核苷酸序 列为GenBank Accession Number NM_124578自5，末端第1至675位核苷酸；所述拟南芥 rd29A基因的启动子的核苷酸序列为GenBank Accession Number D13044自5，末端第3928 至5410位核苷酸。
6.权利要求1至5中任一所述重组质粒在培育转基因植物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述转基因植物为抗旱转基因植物；所述转 基因植物为抗旱转基因玉米。
8.一种培育抗旱植物的方法，是将权利要求1至5中任一所述重组质粒导入植物中，得 到抗旱植物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述植物为玉米。
10.一种培育脯氨酸含量和/或叶绿色含量提高的植物的方法，是将权利要求1至5中 任一所述重组质粒导入植物中，得到脯氨酸含量和/或叶绿色含量提高的植物。
全文摘要
本发明公开了一种培育耐旱植物的方法及其专用重组质粒。本发明提供的重组质粒，是含有CBF4基因的重组质粒；所述重组质粒中，CBF4基因由拟南芥rd29A基因的启动子驱动。用发明得到的重组质粒转化玉米的幼胚和胚性愈伤组织，获得了耐逆性增强的转基因植株。人工干旱处理下，转基因植株的脯氨酸含量和叶绿素含量比野生型对照提高一倍，表明转基因株系的抗旱能力有所提高。本发明具有重大的经济价值。
文档编号C12N15/82GK101988073SQ200910090410
公开日2011年3月23日 申请日期2009年7月31日 优先权日2009年7月31日
发明者张晓东, 张立全, 李向龙, 杨东歌, 杨凤萍, 薛静, 陈绪清 申请人:北京市农林科学院