专利名称：与植物耐逆相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及与植物耐逆相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
水稻是最重要的粮食作物之一，全球约有一半的人口以稻米为主食，随着人口的 增加，对稻米的需求越来越多，与此同时，随着工业化、城市化的快速发展，稻田呈缩减的趋 势，如何在有限甚至更小的稻田面积上生产出更多的粮食是目前必需解决的一个全球性的 重大问题。理论估算与水稻生产实践证明现代高产水稻的产量潜力可达18-22. 5t/ha,实际 全球水稻平均单产只有3. 8t/ha(中国为6. 3t/ha)左右，主要是逆境制约了其遗传潜力的 发挥，其中包括干旱、盐碱、低温、高温、养分缺乏等非生物逆境因素。因此，提高现代高产水 稻品种的耐逆性是进一步挖掘水稻产量潜力、确保品质、拓宽种植面积的重要途径之一，而 要提高现代高产水稻品种的耐逆性最根本的方法就是培育耐逆高产水稻新品种，传统的育 种实践证明，耐逆性是一多基因控制的数量性状，很难通过传统的育种方法加以利用。随着 分子生物学的发展，通过转基因的分子育种途径则是被证明最有效的途径。通过对水稻本 身的重要耐逆基因进行分子操控(过表达等)有望大幅提高水稻的耐逆性。为此，首先必需 知道到底有那些重要基因参与了水稻的耐逆反应与适应过程。然而，目前从水稻中克隆的 耐逆基因十分有限，因此，克隆更多新的水稻耐逆基因，是十分必要的，不仅可为我国转基 因耐逆水稻新种质、新品种的培育提供具有自主知识产权的目的基因，而且可加深对水稻、 禾本科植物耐逆分子机制的认识，具有重要的现实价值与科学意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白，命名为OsMSrl，来源于水稻，是如下1)或2)的 蛋白1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸且与植物耐逆相关的由1)衍生的蛋白质。序列表序列2为OsMSrl的氨基酸序列，包括89个氨基酸，在该蛋白质序列中，疏 水氨基酸占39个，亲水氨基酸占50个，碱性氨基酸占13个，酸性氨基酸占16个，该蛋白质 的分子量为9. 973KD，等电点为5. 05。该蛋白质是国际上未曾报道的新蛋白质。为了使1)中的OsMSrl便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2_10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagll8WSHPQFEKc-my c10EQKLISEEDL上述2)中的OsMSrl可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述2)中的OsMSrl的编码基因可通过将序列表中序列1自5'末端第7到273位碱基所 示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错 义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述蛋白的编码基因，命名为OsMSrl，也属于本发明的保护范围之内。上述编码基因是如下1)或2)或3)的基因1)编码序列是序列表中序列1的自5’端第7位-第273位所示的基因；2)在高严谨条件下与1)限定的基因杂交且编码所述蛋白的基因；3)与1)限定的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。上述编码基因具体可以是序列1所示的基因。序列表1为编码OsMSrl的1个完整cDNA克隆。该序列共由328个碱基组成，其 中，5’端未翻译区包括6个碱基，3’端未翻译区包括52个碱基，编码区由267个碱基(从 第7位到第273位)组成，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的OsMSrl蛋白，编码区 中，A 占 14. 6% (48 个)，C 占 28.0% (92 个)，G ^ 44. 8% (147 个)，T 占 12. 5% (41 个)， Α+Τ 占 27. (89 个)，C+G 占 72. 9% (239 个)。上述的高严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲 液，pH7. 2,7% SDS)中，65°C预杂交30min ；弃预杂交液，加入杂交液(0. 25mol/L磷酸钠 缓冲液，PH7.2,7% SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65°C杂交12hr ；弃杂交液，加入洗膜 液I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,5% SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ；加入洗膜液 II (20mmol/L 磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,1% SDS)，65°C洗膜 30min。扩增上述OsMSrl基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上述基因的转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
含有上述基因的重组菌也属于本发明的保护范围。含有上述基因的重组载体也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有OsMSrl基因的重组表达载体。所述植物表达 载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN、pBY505 或其它衍生植物表达载体。使用OsMSrl基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、泛素 (Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Actin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子
结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子 或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需 与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子 的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或 结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、 萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是 抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。上述重组载体具体的构建方法如下是将上述的基因插入PJIT163的多克隆位 点，得到中间载体pJIT163-0sMsrl ；将所述中间载体经Sac I与EcoRV酶切以及pCAMBIA1300经Sac I和Sma I酶切 后得到的片段相连接，得到重组载体pCAMBIA1300-2XCaMV35S-0sMsrl-CaMV35S-Term。本发明的另一目的在于提供一种培育耐逆转基因植物的方法，是将上述的基因导 入目的植物，得到耐逆转基因植物。所述耐逆转基因植物为耐冷转基因植物。上述的基因是通过上述的重组载体导入目的植物中。携带有本发明的OsMSrl基 因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、如基因枪法、花粉管通道、显微 注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。上述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物为禾本科植物；该禾本科 植物具体可为水稻。实验证明过表达OsMsrl基因水稻93-11冷胁迫后的秧苗存活率可达71. 5%。从 冷胁迫后的秧苗成活率、光合能力的维持程度两个关键指标进行衡量，过表达OsMsrl基因 水稻93-11苗期耐冷性显著强于野生型对照和空载体对照。
图1是用EcoR I与Hind III双酶切pMD18_T阳性克隆获得包含OsMsrl cDNA片 断的目标带的图，其中，M是DNA分子量标准；1-5是被酶切的阳性克隆。图2为用潮霉素基因PCR引物PCR检测转基因水稻图，其中，3-9为阳性植株，2为 野生型对照(WT2)，1为无模板对照，10为阳性对照(pCAMBIA1300-0sMsrl)，M为DNA分子
量标准。图3为用2X35S启动子与OsMsrl组成的嵌合基因的特异引物PCR检测转基因水 稻图，其中，1为阳性对照，2-4为阳性植株，5为空载体对照(WTl)，M为DNA标准。图4为人工冷胁迫后转基因植物生长图。图5为自然冷胁迫后转基因植物生长图。图6为转基因再生苗(TO)人工冷胁迫前后的净光合速率(图6A)与电子转递速率(图6B)。图7为转基因再生苗(TO)人工冷胁迫前后的PSII最大光化学量子效率(图7A) 与实际光化学量子效率(图7B)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、培育耐逆转基因水稻一、重组表达载体的构建1、OsMsr 1基因的克隆人工合成一对引物，并在其5’端分别加上XbaI和Pmac I酶切位点。上游引物及 下游引物如下OsMsrl-F 5' -TCT AGA GAG GCA ATG GAG GTG GA-3'，OsMsrl-R 5' -CAC GTG CAG CAA CCA ACA CAC TG-3'。提取水稻培矮64S(由国家杂交水稻工程技术研究中心罗孝和提供，公众可从湖 南农业科学院种质资源库或Pei ’ai64S育种者罗孝和处获取)，文献罗孝和，邱趾忠，李任 华·导致不育临界温度低的两用核不育系培矮64S.杂交水稻，1992，(1) 27-29)的RNAj^ 反转录得到cDNA的第一条链。以上述OsMsrl-F和OsMsrl-R为引物，以培矮64ScDNA第1链为模板进行PCR扩增； 扩增体系为2 X GC buffer I 10. 0 μ L, dNTPmix (2. 5mM) 1. 6μ L,F primer (10 μ Μ) 0. 4 μ L, R primer (10 μ Μ) 0. 4 μ L, TaKaRa LA Taq 酶0· 6 μ L，模板4 μ L (约含培矮64S cDNA 0. 2 μ g), 用灭菌双蒸水补足至20. 0 μ L ；扩增程序为94 °C预变性5min，94 °C变性30s，58 °C退火 45s，72°C延伸1-min，共35个循环，最后在72°C下延伸IOmin0PCR扩增得到340bp的片段，将得到的PCR产物回收，连接pMD18_T克隆载体(购 自宝生物工程(大连)有限公司)，得到重组载体pMDlS-T-OsMsrl，然后将该重组载体转化 大肠杆菌，筛选阳性克隆，然后对阳性克隆用EcoR I与Hind III双酶切鉴定(如图1)，鉴 定正确后送Irwitrogen公司测序，测序结果表明目的片段的DNA序列具有序列表中序列1 所示的自5’端第1位-第328位的核苷酸序列，其中编码区是自5’端第7位-第273位， 可以编码序列2所示的蛋白。2、构建重组表达载体1)中间载体 pJITl63_0sMsrl 的构建将上述步骤1得到的pMD18-T-0sMsrl用BamH I与Hind III双酶切，得到的含 OsMsrl 基因的片段与经同样双酶切的 pJIT163(pGreen，http://www. ρ green, ac. uk/)相连 接，得到 pJIT163-0sMsrlo2) pCAMBIA1300-2 X CaMV35S-0sMsrl-CaMV35S-Term 的构建将步骤1)得到的中间载体pJIT163_0sMsrl用Sac I与EcoRV酶切，得到含OsMsrl、 2 X CaMV35S启动子与CaMV35S终止子的片段，将该片段与经Sac I和SmaI双酶切后的 pCAMBIAl300(CambiaLabs, http://www.cambia.org/daisy/bioforge_legacy/3725.html)相连 接，得到 pCAMBIA1300-2XCaMV35S-0sMsrl-CaMV35S_Term。其中，构建中间载体 pJIT163_0sMsrl的原因是需从其载体上获得嵌合基因的2XCaMV35S启动子与CaMV35S终止子。二、培育耐逆转基因水稻及其检测1、耐逆转基因水稻的获得1)用冻融法将步骤一的步骤2的重组表达载体pCAMBIA1300-2 X CaMV35S_0sMsrl -CaMV35S-Term转化农杆菌EHA105 (购于天根生化科技(北京)有限公司)。其中冻融法的步骤如下取出_70°C保存的农杆菌EHA105感受态细胞，冰浴融化； 取 10-20 μ 1 pCAMBIA1300-2XCaMV35S-0sMsrl-CaMV35S-Term 质粒 DNA (约 1-2 μ g)，力口 入到200ml融化的农杆菌感受态细胞中，用灭菌枪头搅勻，静置数分钟；置于液氮中lmin， 371水浴51^11，加入700-800口 1 LB 液体培养基，28°C、200rpm、震荡 4h ； IOOOg 30sec，去部 分上清，留100-150 μ 1，用枪头吸打重新悬浮，涂布于含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、 34mg/L氯霉素的LB平板上，28°C倒置培养2d。转化子鉴定从LB平板上挑取5-8个具卡那霉素、利福平、氯霉素3种抗性的单克 隆菌落，接种到含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、34mg/L氯霉素的3ml LB液体培养基中， 220rpm 28°C振荡培养40h。取1-2 μ 1菌液为模板，以步骤一中的OsMsrl-F和OsMsrl-R为引 物，进行PCR扩增，鉴定农杆菌中是否含有目的基因片段，PCR扩增反应条件及热循环设置同 步骤一，结果表明，pCAMBIA1300-2XCaMV35S-0sMsrl-CaMV35S-Term 已成功转化农杆菌。2)将上述鉴定正确的重组的农杆菌通过根癌农杆菌介导法侵染籼稻品种 93-11 (湖南师范大学生命科学院惠赠，公众可从湖南师范大学生命科学院水稻研究室免费 获取。文献袁隆平主编.杂交水稻学.北京中国农业出版社.2002，ppl53.)的愈伤组 织。然后将侵染后的愈伤组织在含潮霉素(50yg/ml)的筛选培养基上生长，得到对潮霉素 抗性再生植株。以与OsMsrl紧密连锁的潮霉素基因为检测对象，进行PCR验证。以潮霉素抗性再生植株叶片的基因组DNA为模板，以如下引物进行PCR扩增 hpt-F 5' -ACC TGC CTG AAA CCG AAC TG-3'与 hpt_R:5' -CTG CTC CATACA AGC CAA CC-3'。PCR检测结果如图2所示，以与OsMsrl紧密连锁的潮霉素基因为检测对象，再生植 株均扩出预期DNA条带(504bp)，而野生型对照未扩出DNA条带(图2)。说明与OsMsrl紧 密连锁的潮霉素基因已整合到水稻基因组中。以35S启动子与OsMsrl组成的嵌合基因为检测对象，进行PCR验证。以潮霉素抗性再生植株叶片的基因组DNA为模板，以如下引物进行PCR扩增PMLlF 5' -AAC CTC CTC GGA TTC CAT TG-3' ；PMLlR 5' -CCA CCTCCA TTG CCT CTC T-3，。PCR检测结果如图3所示，以35S启动子与OsMsrl组成的嵌合基因为检测对象， 再生植株也均扩出预期DNA条带(715bp与376bp)，而空载体对照未扩出DNA条带(图3)。 说明35S启动子与OsMsrl组成的嵌合基因也已整合到水稻基因组中。2、检测分析将上述转pCAMBIA1300-2XCaMV35S-0sMsrl-CaMV35S-Term 水稻移至温室培养， 自交，收集转基因水稻的种子，萌发成苗，随机取两株过表达OsMsrl的株系，命名为T13-1 和 T17-1。 将pJIT163经Sac I与EcoRV酶切后的片段与经Sac I和Sma I酶切过的PCAMBIA1300 相连接，得到空载体 pCAMBIA1300_2 X CaMV35S-CaMV35S_Term。按照制备转 ρ CAMBIA1300-2XCaMV35S-0sMsrl-CaMV35S-Term 水稻的方法，制备出转空载体 pCAMBIA130 0-2XCaMV35S-CaMV35S-Term水稻作为空载体对照，命名为WT1。常规种子萌发成的苗作为野生型对照，命名为WT2。1)冷胁迫秧苗存活率实验A.人工冷胁迫将上述WT1、WT2以及T13-1和T17-1苗龄为25天的幼苗放入人工气候箱平均 7. 7°C处理3天(气候箱环境是光期ll°C、8h ；暗期6°C、16h)。然后21°C恢复生长10天后 拍照并统计人工冷胁迫后的活苗数。实验设三次重复，每次重复中各处理20株。结果如图4所示，经冷处理并恢复生长后，T13-1和T17-1株系大部分能存活，而 WTU WT2基本不能存活。具体结果如表1所示，WTl的存活率8. 5%,WT2的存活率11. 5%、T13_1的存活率 为53. 5%,Τ17-1的存活率为55. 0%ο表1转基因93-11人工冷胁迫后秧苗存活率(2008)
权利要求
一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与植物耐逆相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)的基因1)编码序列是序列表中序列1的自5’端第7位-第273位所示的基因；2)在高严谨条件下与1)限定的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；3)与1)限定的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。
5.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的构建方法如下是将 权利要求2或3所述的基因插入PJIT163的多克隆位点，得到中间载体pJIT163-0sMsrl ；将所述中间载体经Sac I与EcoRV酶切以及pCAMBIA1300经Sac I和Sma I后得到的 片段相连接，得到重组载体 pCAMBIA1300-2XCaMV35S-0sMsrl-CaMV35S-Term。
7.一种培育耐逆转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的基因导入目的植物，得 到耐逆转基因植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述的基因是通过权利 要求5或6所述的重组载体导入目的植物中。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述耐逆转基因植物为耐冷转基因 植物。
10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶 植物；所述单子叶植物为禾本科植物；该禾本科植物为水稻。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白，命名为OsMSr1，来源于水稻，是如下1)或2)的蛋白1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与植物耐逆相关的由1)衍生的蛋白质。本发明还保护该蛋白的编码基因，将该基因导入水稻中得到的转基因水稻的耐冷性明显增强。
文档编号C12N1/00GK101993483SQ200910091729
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月24日 优先权日2009年8月24日
发明者夏新界, 徐孟亮 申请人:夏新界