专利名称：：一种防治烟草粉螟的生防菌剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种防治烟草粉螟的生防菌剂。属微生物
技术领域：
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背景技术：
：烟草粉螟^力est/ae7"&77a(他bner)，属鳞翅目螟蛾科。在烟叶仓库害虫中是仅次于烟草甲的仓贮害虫。烟草粉螟广泛分布于世界热带及温带地区，国内分布于辽宁、甘肃、云南、贵州、四川、湖南、湖北、河南及江苏等地。在云南，烟叶仓库害虫以烟草粉螟为害最重，资料统计表明，每年因这种害虫造成的忙烟量损失占总贮量的0.5%1%。烟草粉螟以幼虫危害烟叶，成虫不吃食物。幼虫喜吃含糖高、尼古丁低的烤烟和香料烟。目前，防治烟叶仓库害虫主要应用熏蒸剂(如磷化铝)薰蒸。但是近年来，国内外对环境保护日益重视，要求减少和禁止使用剧毒薰蒸剂的呼声高涨，氰化氢、溴甲烷、磷化铝等已相继被禁用。在烟叶仓库中使用磷化铝，由于操作不当易造成火灾，且仓库需要良好的密封性能。由于人类对环境保护及自身健康意识的增强，生物防治已成为人们研究的热点。
发明内容本发明的主要目的在于克服现有技术之不足，而提供一种使用安全、烟叶及环境污染低的防治烟草粉螟的生防菌剂，为烟叶的贮存提供技术支持。本发明采用的是苏云金杆菌科尔默亚种few7hs2^^y/^7'e/sissi/力5"/.co/历er菌株5，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院；保藏日期2009年2月6日；保藏登记入册的编号CGMCCNO.2895。菌株5属于苏云金杆菌，系本发明人从大量复烤烟叶里分离出的苏云金杆菌中筛选出来的，对烟草粉螟具有较好防治效果。本发明人通过13项生理生化试验结果与已知的29个苏云金杆菌亚种的生理生化指标比较，鉴定为科尔默亚种co7历er，血清型Ha。本发明的生物菌剂经如下工艺制成试管种子培养将菌株5接种到试管斜面培养基上，试管斜面培养基(重量百分比)配方为牛肉膏5%，蛋白胨1.0%，琼脂2.0%,氯化钠0.5%,pH8.0;30'C恒温培养2天，获得试管种子。液体发酵采用试管培养的苏云金杆菌菌株5原种，按三角摇瓶一种子罐一发酵罐的三级工艺培养。在30L发酵罐中，装入20L液体发酵培养液，液体培养基(重量百分比)配方为玉米粉0.5%、黄豆粉2.0%、酵母粉0.15%、鱼粉0.25%、蛋白胨0.05%、磷酸二氢钾0.25%、碳酸钙0.05%和硫酸镁0.035%、0.025%植物油作消泡剂，初始pH值为7.5。经0.05mpa灭菌30分钟，冷却至室温接入1.8L菌株5液体种子，接种量为9%(体积比)，发酵温度为30。C，通气量为15%(体积比)，搅拌速度为150r/min，发酵时间为36h。制备生防菌剂将经液体发酵后的培养液在5。C温度下，用高速离心机5000g离心20分钟，去除上清液一离心后的沉淀物用冻干超滤仪在室温下冻干一粉碎成粉得到生防菌剂，生防菌剂(粉剂)的活芽孢数为4.76Xl(T个/ml。本发明的生防菌剂具有使用安全、烟叶及环境污染低的优点，能广泛用于烟叶贮存中烟草粉螟的生物防治。具体实施例方式一、生防菌剂的制备本发明的生物菌剂经如下工艺制成试管种培养将菌株5接种到试管斜面培养基上，试管斜面培养基(重量百分比)配方为牛肉膏5%，蛋白胨1.0%，琼脂2.0%，氯化钠0.5%，pH8.0;30。C恒温培养2天，获得试管种。液体发酵采用试管培养的苏云金杆菌菌株5原种，按三角摇瓶一种子罐一发酵罐的三级工艺培养。在30L发酵罐中，装入20L液体发酵培养液，液体培养基(重量百分比)配方为玉米粉0.5%、黄豆粉2.0%、酵母粉0.15%、鱼粉0.25%、蛋白胨0.05%、磷酸二氢钾0.25%、碳酸钙0.05%和硫酸镁0.035%，0.025%植物油作消泡剂，初始pH值为7.5。经0.05卿a灭菌30分钟，冷却至室温接入1.8L菌株5液体种子(接种量为9%)，发酵温度为3(TC，通气量为15%，搅拌速度为150r/min，发酵时间为36h。制备生防菌剂将经液体发酵后的培养液在5t温度下，用高速离心机5000g离心20分钟，去除上清液一离心后的沉淀物用冻干超滤仪在室温下冻干一粉碎成粉得到生防菌剂，生防菌剂(粉剂)的活芽孢数为4.76X10"'个/ml。二、本发明生防菌剂防治烟草粉螟的功能试验1、菌株5对幼虫生长发育的影响设IOO、200、300倍三个浓度。以喷无菌水为对照。喷(菌)液量为20W/g菌剂处理烟叶后置于养虫室，温湿度为自然温湿度。每试验浓度接虫15头，三次重复。试验处理后7天调查烟草粉螟的死亡情况。从表l可知菌株5的100、200、300倍对一至五龄烟草粉螟幼虫的防治效果均均为100%。表l菌株5对烟草粉螟的防治效果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2、菌株5小批量防治烟草粉螟试验2.1材料与方法无虫复烤烟叶等级为云南玉溪中部桔黄二级GF烟叶；有虫复烤烟叶为云南昭通中部桔黄二级C2F烟叶。设100、200、300倍三个浓度，三次重复。以喷无菌水为对照。试验重复设置如表2。每小区4kg烟叶，喷(菌)液量为20ml/kg菌剂处理后置于玉溪烟厂第一烟叶库区11号试验仓库，温湿度为自然温湿度。试验处理后20天调査虫情。防治效果计算公式无虫复烤烟叶组_对照试验组-处理试验组防治效果=X100%对照试验组<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>试验后对照组基数-试验前对照组基数表2试验重复设置<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>菌株5200W33-200-1W33-200-2W33-200-3Y33-200菌株5300W33-300-1W33-300-2W33-300-3Y33-300CKWCK—1WCK-2WCK-3YCK2.2结果与分析2.2.1菌株5对无虫复烤烟叶组的防治效果由表3可知菌株5对无虫复烤烟叶组的防治效果100是88.94%;200倍是68.14%;300倍是65.04%。表3菌株5对无虫复烤烟叶组的防治效果菌株浓度(倍)无虫复烤烟叶组(头)防治效果(%)IIIIII合计菌株510083142588.94菌株52003126157268.14菌株53004326107965.04CK7877712262.2.2菌株5对有虫复烤烟叶组的防治效果由表4可知菌株5对有虫复烤烟叶组的防治效果100倍是88.57%;200倍是77.14%;300倍分别是65.71%。表4菌株5对有虫复烤烟叶组的防治效果菌株浓度(倍)有虫复烤烟叶组(头)防治效果(％)Bt33100688.57Bt332001077.14Bt333001465.71CK试验前2CK试验后__3菌株5在烟叶仓库中的防治效果试验3.1材料与方法试验地点为云南玉溪、楚雄烟厂烟叶仓库；烟叶等级为上部桔黄二级B2F;菌剂施用方法(1)、烟叶均匀喷雾，菌剂0.lg/lkg烟叶+无菌水5ml/lkg烟叶；(2)、烟包表面喷雾，0.2g/lkg烟叶+无菌水5ml/lkg。烟叶喷菌剂后按常规打包烟叶仓库存贮。施药后3、6、12个月定期调査虫害发生情况。3.2结果与分析从表5中可知喷菌剂后3个月玉溪、楚雄两个试验点各处理均未遭到虫害。6个月后两个试验点烟叶均匀喷雾的各处理防治效果较好；烟包表面喷雾处理均发生虫6害；12个月后两个试验点烟叶均匀喷雾的各处理防治效果较好；烟包表面喷雾处理均发生虫害，但与对照比虫害轻。总之，两个试验点烟叶均匀喷雾菌剂处理对烟草粉螟的防治效果好于烟包表面喷雾菌剂处理；烟叶均匀喷雾菌剂处理与对照比，防治草粉螟的效果较好。表5菌株5在烟叶仓库中使用效果评价试验地点处理喷菌剂后喷菌剂后3个月6个月喷菌剂后12个月喷施菌剂方法虫情防效虫情防效虫情防效烟叶均匀喷雾_-优-优玉溪烟包表面喷雾-+中+良CK一++++++烟叶均勾喷雾-_优+良楚雄烟包表面喷雾-+中++中CK一++++++—，，表示无虫害发生；"+"表示有虫害发生，"+"号越多表示虫害越严重。4施用菌剂后对烟叶化学成分的影响，喷菌株5菌剂后3、6、9、12个月取样对烟叶进行化学常规成分分析，各处理总糖、还原糖、总氮、烟碱、蛋白质含量与同期CK相比，无明显影响。说明使用菌株5防治烟草粉螟后对烟叶化学成分影响不大。(表6)表6喷施菌株5菌剂对烟叶化学常规成分的影响测定时间(月)样品总糖名称(％)与对照还原糖与对照比(%)(%)比(%)总氮(%)与对照蛋白质与对照烟碱比(%)(%)比(%)(%)与对照比(%)0喷药前26.7824.122.229.573.613菌株525.37CK25.190.7422.3223.77-6.101.862.09008.129.30-12.692.923.14-7.016菌株524.73CK25.39-2.7122.2022.82-2.721.961.818.298.267.529.843.403.254.629菌株524.10CK24.22-O.5022.0822.57-2.172.282.222.7010.199.883.143.383.302.4212菌株525.50CK24.454.3122.4322.131.342.182.170.5110.1710.051.243.203.28-2.36注数据由云南省烟草科学研究所分析测试中心分析.5施用菌剂对单体烟评吸结果的影响喷菌剂后12个月取烟样进行单体烟评吸，结果见表7。经云南烟草研究院产品开发研究室评吸认为1#(菌株5)样烟在香气质、香气量、杂气方面的品质均优于賴(CK)样烟。在刺激性、劲头、余味方面4支烟较为接近。表7均匀喷雾处理喷菌剂后12个月的单体烟评吸结果评吸指标fffck_i_总分处--s香气质香气量烟气浓度杂气刺激性劲头余味平均[30分]'[9分][9分][9分]2[分][9分]菌株26.80±1.6426.80±1.107.40±0.897.00±0.716.40±0.891.20±0.456.80±1.3082.405CK25.00±3.3224.40±2.886.20±0.846.00±1.226.80±1.301.60±0.556.80±1.3076.80注由云南烟草研究院产品开发研究室评吸.8权利要求1、一种防治烟草粉螟的生防菌剂，该生物菌剂由生产菌株经试管种子培养、液体发酵及制备生防菌剂工序得到，其特征在于a.生产菌株为苏云金杆菌科尔默亚种(Bacillusthuringiensissubsp.colmer)菌株5，CGMCCNO.2895；b.试管种子培养将菌株5接种到试管斜面培养基上，试管斜面培养基配方为牛肉膏5％，蛋白胨1.0％，琼脂2.0％，氯化钠0.5％，pH8.0，配方的比例为重量百分比，30℃恒温培养2天，获得试管种子；c.液体发酵将菌株5种子接种到发酵罐液体培养基中，液体培养基配方为玉米粉0.5％、黄豆粉2.0％、酵母粉0.15％、鱼粉0.25％、蛋白胨0.05％、磷酸二氢钾0.25％、碳酸钙0.05％和硫酸镁0.035％，0.025％植物油作消泡剂，初始pH值为7.5，配方的比例为重量百分比，在发酵温度30℃，通气量15％，搅拌速度150r/min的条件下发酵36h；d.制备生防菌剂将经液体发酵后的培养液在5℃温度下，用高速离心机5000g离心20分钟，离心后的沉淀物用冻干超滤仪在室温下冻干，粉碎成粉得到生防菌剂。全文摘要本发明涉及一种防治烟草粉螟的生防菌剂，属生物
技术领域：
。该生防菌剂由如下工序制备a.生产菌株为苏云金杆菌菌侏5，CGMCCNO.2895；b.将菌株5接种到牛肉膏5％，蛋白胨1.0％，琼脂2.0％，氯化钠0.5％，pH8.0的试管斜面培养基上，30℃恒温培养2天，获得试管种子；c.将种子接种到装有玉米粉0.5％、黄豆粉2.0％、酵母粉0.15％、鱼粉0.25％、蛋白胨0.05％、磷酸二氢钾0.25％、碳酸钙0.05％和硫酸镁0.035％，消泡剂0.025％，pH7.5，其余为水的发酵罐中，在发酵温度30℃，通气量15％，搅拌速度150r/min的条件下发酵36h；d.培养液5℃下用离心机5000g离心20分钟，沉淀物室温冻干，粉碎即得生防菌剂。本发明的生物制剂具有使用安全、烟叶及环境污染低的优点，能够用于烟叶贮存中烟草粉螟的生物防治。文档编号C12R1/07GK101558765SQ20091009413公开日2009年10月21日申请日期2009年2月27日优先权日2009年2月27日发明者勇刘,宋春满,李天飞,邓云龙,高家合申请人:云南省烟草科学研究所