一种烟草赤星病菌孢子接种体的制备方法

文档序号:551062阅读:376来源:国知局
专利名称:一种烟草赤星病菌孢子接种体的制备方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术,更具体地说,本发明涉及一种烟草赤星病 菌孢子接种体的制备方法。' 背景技术烟草赤星病(Tobacco Brown Spot Disease)是烟叶成熟后期常见的叶部 病害,在各烟区普遍发生,是我国烟草的主要病害,病原是链格孢菌 (J/^maWa aten ato)。目前,人工接种赤星病用的病菌接种体,以病菌 孢子液为主。在实验室、温室一般采用平板菌丝培养、自然产孢后制备烟草 赤星病菌孢子接种体,仅见个别的研究通过紫外光诱导产孢。由于人工接种 用烟草赤星病菌为较强致病力,其产生孢子的效率往往比较低。仅依靠传统 的培养产孢,只能满足离体叶片接种用;要满足大田人工接种,仅设置诱发 行接种也需要花费较大的劳动来制备较大量的接种体。用紫外光诱导产孢, 紫外剂量与时间控制不当,容易造成变异,也容易导致培养物污染。因此, 如何更为有效的制备烟草赤星病菌接种体,就成为烟草育种、植保工作中亟 待解决的技术问题。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足之处,提供一种经济有效的烟 草赤星病菌孢子接种体的制备方法。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。 *除非另有说明,本发明中所釆用的百分数均为质量百分数。 本发明提供了一种烟草赤星病菌孢子接种体的制备方法,所述的方法 关键在于采用改进的诱导产孢方法,分离、筛选得到的强致病力菌株4 6 点点接于CA平板,黑暗培养5 7天,封皿置6 1(TC冰箱黑暗诱导产孢3 5 天,1%葡萄糖溶液洗下孢子,'脱脂棉过滤,即可获得赤星病菌孢子接种体。 本发明的方法,具体采用以下步骤(1)从发病田块中釆集病叶,经过分离、纯化、致病力筛选测定,获得强致病力病菌,将菌种保存于CA斜面,置于4'C条件下恒温保存,备用。(2)将烟草赤星病菌产生孢子的菌丝4 10点点接到CA平板培养基上, 在25土rC下恒温培养5 7天,选择菌丝黑褐色、在平板表面形成一层较致 密菌丝层的培养物,用于诱导产孢。所述的赤星病菌点接物为已经大量产 生孢子的培养物,接种时每点以孢子接种体为主。(3) 密封培养好的平板,置6 10'C冰箱黑暗诱导产孢3 5天。所述 的赤星病菌诱导产孢方法为高湿、低温诱导,诱导前病菌菌丝已充分生 长。(4) 1%葡萄糖溶液洗下平板中的孢子和菌丝,脱脂棉过滤除菌丝, 滤液即为赤星病菌孢子接种体。通常每内皿直径9cm的平板可获得孢子 含量为0.1 1.0亿个/ml的孢子悬浮液20 25ml,孢子萌发率90%以上。本发明与现有技术相比,具有以下突出优点1. 赤星病菌点接物为已经大量产生孢子的培养物,接种时每点以孢 子接种体为主,其菌丝体很少或不能继续生长,这种移植方法类似于涂 孢子悬浮液,只是接种位点相对少而已,但与涂孢子悬浮液一样,由于 接种点相对较多,培养物能够较快占据整个平板表面,因此可较快耗尽 营养,促进培养物的大量产生孢子。点接与孢子涂布相比,可显著减少 后继培养物的杂菌污染。2. 赤星病菌诱导产孢方法为高湿、低温诱导。病菌在前期的适温培 养时,菌丝已充分生长。密封平板置6 1(TC黑暗冰箱中,为潜在的产孢 菌丝创造了一个高湿、低温、黑暗的环境,这种环境可刺激菌丝大量产 生孢子。3. 制备的赤星病菌孢子接种体,每内皿直径9cm的平板可获得孢子 含量为0.1 1.0亿个/ml的孢子悬浮液20 25ml,孢子萌发率90°/。以上。这 种方法制备的孢子量是常规的50 100倍,可减少50 100倍制备孢子接种 体的工作量。4. 获得的孢子生活力强,如不加1%葡萄糖溶液洗皿,在6 1(TC黑 暗冰箱内平板可保存3 6月,尽管孢子萌发率略有降低,但孢子总量增加,有效接种体基本维持不变。
具体实施方式
通过下面给出的实施例和应用实施例,可以进一 步清楚地了解本发明, 但它们不是对本发明保护范围的限定。 实施例制备烟草赤星病菌接种体,首先需要通过分离、培养、致病力测定获 得强致病力病菌。通常可采用孢子悬滴法接种离体叶片,测定发病情况, 发病严重的菌株致病力强一些,以保证接种的有效性、可比性。然后培养 制备接种体,点接、黑暗培养,低温、高湿、黑暗诱导产孢,洗孢子,即 可获得赤星病菌孢子接种体。本例釆用孢子悬滴法接种离体叶片筛选获得的强致病力菌株97Aa003实施,具体如下(1) 将保存的强致病力菌株97Aa003, 4~5点点接到CA平板培养基, 选择生产较快的菌落,再转接到CA平板培养基,在25土1。C下恒温培养至大量产生孢子,作为扩大培养的菌种,备用。(2) 将烟草赤星病菌产生孢子的菌丝7 9点点接到CA平板培养基上, 在25土1。C下恒温培养5 7天,选择菌丝黑褐色、在平板表面形成一层较致 密菌丝层的培养物,用于诱导产孢。(3) 用封口膜密封培养好的平板,置6 1(TC冰箱黑暗诱导产孢3 5天。(4) 1%葡萄糖溶液洗下平板中的孢子和菌丝,脱脂棉过滤除菌丝, 滤液即为赤星病菌孢子接种体。通常每内皿直径9cm的平板可获得孢子 含量为0.1 1.0亿个/ml的孢子悬浮液20 25ml,孢子萌发率90%以上。应用实施例l品种抗性评价 1.材料与方法 1.1材料供试接种病原为强致病力烟草赤星病菌97Aa003菌株。供试品种为G28、 净叶黄、K326、云烟97、云烟98、 NC89共6个品种。 1.2方法1.2.1供试病原接种体的制备烟草赤星病菌孢子接种体的制备强致病力赤星病菌97Aa003菌株孢子 接种体的制备按照本发明方法进行。1.2.2抗性测定品种的小区布置试验处理为6个处理,待测定的6个品种,每个品种为l个处理。每处理植烟30株,4次重复。小区随机排列。管理与种植同优质烤烟模式。试验用 地约1.5亩。本试验在云南省烟草科学研究所研和试验基地进行。 1.2.3病菌人工接种封顶去2片脚叶后,将制备的烟草赤星病菌孢子接种体用1°/。的葡萄糖稀 释50 100倍,至10 100万个孢子/ml,按0.2%的质量比加入吐温80、过325目 标准筛的硅藻土,搅拌均匀,喷雾每处理中下部叶,至叶片布满均匀一层细 小水珠为止,接种后在试验田灌注水至半沟,保湿24 48小时。1.2.4病情调査在烟草赤星病菌接种前一天,进行一次病情基数调查,接种后每7天调 查一次病情。调查各处理的叶片,调查记载采用YC/T39-1996 "烟草病害分 级及调查方法"中烟草赤星病害的行业标准。以发病盛期时病情指数的高低, 评价抗性。2.结果与分析品种抗性测定结果见表l,以病情指数大于70为高度感病、50《病情指 数<70为感病、30《病情指数<50为低度抗病、20《病情指数<30为中度 抗病、小于20为高度抗病进行评价,可以看出G28高度感病,NC89感病 K326、云烟97、云烟98低度抗病,净叶黄高度抗病。表l.待测抗性品种的测定结果(病情基数为O)品种病情指数抗性评价G2878.24Aa高感(HS)净叶黄16.45Dd高抗(HR)K32635.06Cc低抗(L)云烟9839.36Cc低抗(-L)云烟9738.42Cc低抗(L)NC8954.21Bb感病(S)应用实施例2防治药剂筛选 1.材料与方法U材料 供试药剂见表2。供试接种病原为强致病力烟草赤星病菌97Aa003菌株。供试品种为 K326。1.2方法1.2.1供试菌株接种体的制备烟草赤星病菌孢子接种体的制备强致病力烟草疫霉97Aa003菌株孢子 接种体按实施例进行。1.2.2防治药剂的小区处理试验处理为5种药剂处理、l个空白对照共6个处理(表2)。每处理植烟 30株,4次重复。小区随机排列。管理与种植同优质烤烟模式。试验用地约 1.5亩。本试验在云南省烟草科学研究所研和试验基地进行。表2.供试药剂及处理设置处药剂药剂编号使用生产厂家理名称浓度A秀安50%异菌脲可湿性粉剂1500x浙江禾益农化有限公司B东旺19%恶霉>络铜水剂1800x北京巿东旺农药厂C菌克45%菌核.王铜可湿性粉剂600 x浙江禾益农化有限公司D菌霸多抗霉素画x浙江一帆化工有限公司E菌核净40%菌核净超微可湿性粉剂1200x温州巿斯佩斯化工农药有限公司CK1.2.3防治药剂的施用封顶去2片脚叶后,按处理设置表中各药剂分别喷雾。 1.2.4病菌人工接种 按照应用实施例l中的方法进行。 1.2.5病情调查在烟草赤星病菌接种前一天,进行一次病情基数调查,接种后每7天调 查一次病情。调查各处理的叶片,调查记载釆用YC/T39-1996 "烟草病害分 级及调查方法"中烟草赤星病害的行业标准。以第14天病情,评价药剂防治 效果。2.结果与分析药剂的田间小区防治试验结果(表3)表明,供试的5种药剂对大田发生 的赤星病都有一定的防治效果,其中,菌克防治效果最好,再次是菌核净, 秀安、东旺效果较差,菌霸效果最差。表2.药剂防治赤星病的田间小区试验结果(病情基数为0 )处理药剂名称病情指数 防治效果(%)A秀安14.5646.76CcB东旺15.0744.卯CcC菌克10.4861.68AaD菌霸17.6335.54DdE菌核净12.2455.25BbCK清水27.3权利要求
1. 一种烟草赤星病菌孢子接种体的制备方法,其特征在于包括以下步骤(1)获取强致病力菌株;(2)黑暗培养;(3)冰箱黑暗诱导;(4)获取赤星病菌孢子接种体。
2. 根据权利要求l所述的制备方法,其特征在于所述的强致病力菌株 的获取方法是从发病田块中釆集病叶,经过分离、纯化、致病力筛选测定, 获得强致病力病菌,将菌种保存于CA斜面,置于4。C条件下恒温保存,备 用。
3. 根据权利要求l所述的制备方法,其特征在于所述黑暗培养的方法 是将烟草赤星病菌产生孢子的菌丝4 10点点接到CA平板培养基上,在25± rc下恒温培养5-7天,选择菌丝黑褐色、在平板表面形成一层较致密菌丝 层的培养物,用于诱导产孢。
4. 根据权利要求l所述的制备方法,其特征在于所述的冰箱黑暗诱导 的方法是密封培养好的平板,置6 1(TC冰箱内黑暗诱导产孢3 5天。
5. 根据权利要求l所述的制备方法,其特征在于所述的获取赤星病菌 孢子接种体的方法是用P/。葡萄糖溶液洗下平板中的孢子和菌丝,脱脂棉过 滤除菌丝,滤液即为赤星病菌孢子接种体。
6. 根据权利要求3所述的赤星病菌点接物为已经大量产生孢子的培养 物,接种时每点以孢子接种体为主。
7. 根据权利要求4所述的赤星病菌诱导产孢方法为高湿、低温诱导,诱 导前病菌菌丝已充分生长。
8. 根据权利要求5所述的赤星病菌孢子接种体,每内皿直径9cm的平板可 获得孢子含量为0.1 1.0亿个/ml的孢子悬浮液20 25ml,孢子萌发率90%以上。
全文摘要
本发明公开了一种烟草赤星病菌孢子接种体的制备方法。其包括以下步骤(1)获取强致病力菌株;(2)黑暗培养;(3)冰箱黑暗诱导;(4)获取赤星病菌孢子接种体。其中,赤星病菌点接物为已经大量产生孢子的培养物,接种时每点以孢子接种体为主;赤星病菌诱导产孢方法为高湿、低温诱导,诱导前病菌菌丝已充分生长。赤星病菌孢子接种体,每内皿直径9cm的平板可获得孢子含量为0.1~1.0亿个/ml的孢子悬浮液20~25ml,孢子萌发率90%以上。本发明制备的孢子量是常规的50~100倍,可减少50~100倍制备孢子接种体的工作量。
文档编号C12R1/645GK101519645SQ20091009428
公开日2009年9月2日 申请日期2009年4月1日 优先权日2009年4月1日
发明者卢秀萍, 张树锋, 方敦煌, 李永平, 白江兰 申请人:云南省烟草科学研究所
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