专利名称：用花蕾鉴定香石竹染色体数目的方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定香石竹染色体数目的方法，尤其是一种用花蕾鉴 定香石竹染色体数目的方法，属于细胞生物学和细胞遗传学技术领域。
背景技术：
香石竹(Dianthus caryophyllus Linn)，又名康乃馨，为石竹科石竹 属的多年生宿根性草本植物，是世界著名的鲜切花之一，也是云南省最主 要的大宗出口花卉之一。在香石竹杂交育种中存在着杂交不亲合，结实率 偏低的现象。其中一个原因是对很多种质的细胞学背景不清楚。因此，要 增加杂交的成功率、提高杂交育种效率，应先解决香石竹染色体倍性分析 问题。
染色体是基因的载体，制备染色体标本无疑是细胞遗传学最基本的技 术，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决 条件。植物细胞染色体的观察和分析，对于染色体核型分析、细胞融合后 染色体的行动以及培养过程中细胞变异等遗传学现象的研究具有重要意 义。
香石竹的染色体长度为2.5-4.0um，属小染色体类型，具有正常的着丝 点，由于香石竹染色体数目多，且属于小染色体，压片难度较大，因此需 寻找细胞分裂指数高的材料进行染色体计数。根尖是染色体计数最常用的 材料，尤其种子根尖细胞是研究染色体最可靠的材料。香石竹结实率低， 多数种不结实而靠营养繁殖，但扦插苗生根周期长，且扦插费时费力，因 此若用纤插苗生根来取根尖进行染色体制片，则需花费较长一段时间，取 材难度大。另外取茎尖进行染色体制片时，由于茎尖取材易受生长季节的限制，且有不同的非分生细胞或贮藏物或分泌物的干扰，使中期分裂相细 胞极少或没有，茎尖剥取困难，从而影响染色体制片和计数。因此，必须 对现有技术加以改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种取材容易，省时省力，且中期细胞分裂相 多的用花蕾鉴定香石竹染色体数目的方法。
本发明通过下列技术方案完成 一种用花蕾鉴定香石竹染色体数目的 方法，其特征在于经过下列工艺步骤-
A，取香石竹长1.0-1.9cm的花蕾；
B，将花蕾放入冰水混合物中预处理22-26h;
C，将预处理后的花蕾清洗后，浸入下列体积比的固定液中固定处理 2-24h:无水乙醇冰醋酸=3 : 1;
D，将固定处理后的花蕾清洗后，于室温下，浸入浓度为lmol/L的HCL 溶液中解离处理10-20min;
E，将解离处理后的花蕾清洗后，置于载玻片上，用解剖刀撕碎花蕾组 织，滴l-3滴卡宝品红染液，染色5-10min;
F,在染色处理后的花蕾组织上盖上盖玻片，覆盖上吸水纸，轻击花蕾 组织，使细胞迅速分散；
G，用指甲油将盖玻片四周封固，用光学显微镜观察即得染色体数目。
所述花蕾具体取其花药或子房壁或花冠组织。
所述C、 D、 E步骤的清洗采用蒸馏水清洗2-3次，清洗用具是注射器。 本发明与现有技术相比具有下列优点和效果采用上述方案，即用幼小 花蕾组织进行染色体制片，从而对香石竹染色体数目进行计数，与传统的 用根尖组织进行染色体制片相比，解决了根尖染色体制片中，视野细胞少、 镜检困难，染色体分散不良的缺点，同时克服了香石竹扦插苗生根周期长，且扦插费时费力的问题；与茎尖染色体制片相比，克服了非分生细胞或贮 藏物或分泌物的干扰问题，只需取花蕾即可进行染色体制片，不会破坏植 株的生长状态，取材方便，且中期分裂相细胞多，解决了香石竹染色体小， 数量多，染色体难于计数的难题。因此，在植株开花时，利用花蕾进行染 色体制片是行之有效的方法。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。 实施例1
以香石竹品种"秋收"为材料，摘取1.9cm长的花蕾，剥出子房，将 子房纵向切开，取其子房壁放入冰水混合物中预处理24h;用5ml注射器吸 取废液后，将预处理后的子房壁用蒸馏水清洗3遍，浸入体积比为无水 乙醇冰醋酸=3 : 1的卡诺氏I固定液中固定2 h;用相同注射器吸取废液 后，将固定处理后的子房壁用蒸馏水清洗3遍，于室温下浸入浓度为lmol/L 的HCL溶液中20min，进行盐酸解离；用相同注射器吸取废液后，再用蒸 馏水清洗子房壁3遍，置于载玻片上，用解剖刀撕碎子房壁组织，滴2滴 卡宝品红染液，染色10min，盖上盖玻片，覆盖上吸水纸，用筷子在盖上吸 水纸盖玻片上轻轻敲击子房壁组织，使细胞迅速分散，用指甲油在盖玻片 四周进行封固，随即用光学显微镜观察，其镜检效果在放大1000倍(10 倍目镜X100倍物镜)的情况下，中期分生细胞多，染色体收縮好，染色体 分散良好，易于计数。经染色体计数分析，香石竹品种"秋收"染色体数 目为30， 二倍体。
实施例2
以香石竹 品种"黄飞鸿"为材料，摘取1.3cm长的花蕾，剥出子房， 将子房纵向切开，取其子房壁放入冰水混合物中预处理22h;用5ml注射器 吸取处理后的废液后，将子房壁用蒸馏水清洗2遍，之后浸入体积比为无水乙醇冰醋酸=3 : 1的卡诺氏I固定液中固定4 h;用相同注射器吸取 处理后的废液后，将子房壁用蒸馏水清洗3遍，于室温下浸入浓度为lmol/L 的HCL溶液中15min，进行盐酸解离；用相同注射器吸取处理后的废液后， 将子房壁再用蒸馏水清洗3遍，置于载玻片上，用解剖刀撕碎子房壁组织， 滴3滴卡宝品红染液，染色5min，盖上盖玻片，覆盖上吸水纸，用筷子在 盖上吸水纸盖玻片上轻轻敲击子房壁组织，使细胞迅速分散，用指甲油在 盖玻片四周进行封固，四天后用光学显微镜观察，其镜检效果在放大1000 倍(10倍目镜X100倍物镜)的情况下，中期分生细胞数多，染色体收縮 好，染色体分散良好，易于计数。经染色体计数分析，香石竹品种"黄飞 鸿"染色体数目为60，四倍体。 实施例3
以香石竹品种"迷恋"为材料，取1.5cm长的花蕾，此时花粉正处于 单核靠边期，取出花药，放入冰水混合物中预处理24h;用5ml注射器吸取 处理后的废液后，将子房壁用蒸馏水清洗3遍，浸入体积比为无水乙醇 :冰醋酸=3 :1的卡诺氏I固定液中固定2h;用相同注射器吸取处理后的 废液后，将子房壁用蒸馏水清洗3遍，于室温下浸入浓度为lmol/L的HCL 溶液中20min，进行盐酸解离；用相同注射器吸取处理后的废液后，将子房 壁用蒸馏水清洗3遍，置于载玻片上，用解剖刀撕碎花药组织，滴2滴卡 宝品红染液，染色5min，盖上盖玻片，覆盖上吸水纸，用筷子在盖上吸水 纸盖玻片上轻轻敲击花药组织，使细胞迅速分散，用指甲油在盖玻片四周 进行封固，随即用光学显微镜观察，其镜检效果在放大1000倍(IO倍目 镜X100倍物镜)的情况下，中期分生细胞多，染色体收縮好，染色体分散 良好，易于计数。经染色体计数分析，香石竹品种"迷恋"染色体数目为 30， 二倍体。
实施例4以香石竹品种"罗加特"为材料，取1.2cm长的花蕾，此时花粉正处 于减数第一次分裂终变期到减数第一次分裂后期，取出花药，放入冰水混 合物中预处理22h;用5ml注射器吸取处理后的废液后，将子房壁用蒸馏水 清洗3遍，浸入体积比为无水乙醇冰醋酸=3 : 1的卡诺氏I固定液中固 定4h;用相同注射器吸取处理后的废液后，将子房壁用蒸馏水清洗2遍， 于室温下浸入浓度为lmol/L的HCL溶液中10min，进行盐酸解离；用相同 注射器吸取处理后的废液后，将子房壁用蒸馏水清洗2遍，置于载玻片上， 用解剖刀撕碎花药组织，滴3滴卡宝品红染液，染色5min，盖上盖玻片， 覆盖上吸水纸，用筷子在盖上吸水纸盖玻片上轻轻敲击花药组织，使细胞 迅速分散，用指甲油在盖玻片四周进行封固，随即用光学显微镜观察，其 镜检效果在放大1000倍(10倍目镜X100倍物镜)的情况下，中期分生 细胞多，染色体收縮好，染色体分散良好，易于计数。经染色体计数分析， 香石竹品种"罗加特"染色体数目为30, 二倍体。
实施例5
以香石竹品种"锦葵钛合金"为材料，取1.2cm长的花蕾，取出花冠， 放入冰水混合物中预处理26h;用5ml注射器吸取处理后的废液后，将花冠 用蒸馏水清洗2遍，浸入体积比为无水乙醇冰醋酸=3 : 1的卡诺氏I固 定液中固定16 h;用相同注射器吸取处理后的废液后，将花冠用蒸馏水清 洗2遍，于室温下浸入浓度为lmol/L的HCL溶液中15min，进行盐酸解离； 用相同注射器吸取处理后的废液后，将花冠用蒸馏水清洗3遍，置于载玻 片上，用解剖刀撕碎花冠组织，滴1滴卡宝品红染液，染色5min，盖上盖 玻片，覆盖上吸水纸，用筷子在盖上吸水纸盖玻片上轻轻敲击花药组织， 使细胞迅速分散，用指甲油在盖玻片四周进行封固，第四天用光学显微镜 观察，其镜检效果在放大1000倍(10倍目镜X100倍物镜)的情况下， 中期分生细胞多，染色体收縮好，染色体分散良好，易于计数。经染色体计数分析，香石竹品种"锦葵钛合金"染色体数目为30, 二倍体。 实施例6
以香石竹品种"粉美人"为材料，摘取l.lcm长的花蕾，取出花冠， 放入冰水混合物中预处理26h;用5ml注射器吸取处理后的废液后，将花冠 用蒸馏水清洗2遍，浸入体积比为无水乙醇冰醋酸=3 : 1的卡诺氏I固 定液中固定16h;用相同注射器吸取处理后的废液后，将花冠用蒸馏水清洗 2遍，于室温下浸入浓度为lmol/L的HCL溶液中20min，进行盐酸解离； 用相同注射器吸取处理后的废液后，将花冠再用蒸馏水清洗3遍，置于载 玻片上，用解剖刀撕碎花冠组织，滴1滴卡宝品红染液，染色8min，盖上 盖玻片，覆盖上吸水纸，用筷子在盖上吸水纸盖玻片上轻轻敲击花冠组织， 使细胞迅速分散，用指甲油在盖玻片四周进行封固，二天后用光学显微镜 观察，其镜检效果在放大1000倍(10倍目镜X100倍物镜)的情况下， 中期分生细胞多，染色体收縮好，染色体分散良好，易于计数。经染色体 计数分析，香石竹品种"粉美人"染色体数目为60，四倍体。
权利要求
1、一种用花蕾鉴定香石竹染色体数目的方法，其特征在于经过下列工艺步骤A，取香石竹长1.0-1.9cm的花蕾；B，将花蕾放入冰水混合物中预处理22-26h；C，将预处理后的花蕾清洗后，浸入下列体积比的固定液中固定处理2-24h∶无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1；D，将固定处理后的花蕾清洗后，于室温下，浸入浓度为1mol/L的HCL溶液中解离处理10-20min；E，将解离处理后的花蕾清洗后，撕碎花蕾组织，置于载玻片上，染色5-10min；F，在染色处理后的花蕾组织上盖上盖玻片，覆盖上吸水纸，轻击花蕾组织，使细胞迅速分散；G，用指甲油将盖玻片四周封固，用光学显微镜观察即得染色体数目。
2、 如权利要求l所述的用花蕾鉴定香石竹染色体数目的方法，其特征 在于所述花蕾具体取其花药或子房壁或花冠组织。
3、 如权利要求l所述的用花蕾鉴定香石竹染色体数目的方法，其特征 在于所述C、 D、 E步骤的清洗采用蒸馏水清洗2-3次，清洗用具是注射器。
全文摘要
本发明提供一种用花蕾鉴定香石竹染色体数目的方法，包括取花蕾的花药、子房壁和花冠组织、冰水混合物预处理、固定液固定、染色、盐酸解离、压片和镜检。与传统的用根尖组织进行染色体制片相比，解决了根尖染色体制片中，视野细胞少、镜检困难，染色体分散不良的缺点，同时克服了香石竹扦插苗生根周期长，且扦插费时费力的问题；与茎尖染色体制片相比，克服了非分生细胞或贮藏物或分泌物的干扰问题，只需取花蕾即可进行染色体制片，不会破坏植株的生长状态，取材方便，且中期分裂相细胞多，解决了香石竹染色体小，数量多，染色体难于计数的难题。因此，在植株开花时，利用花蕾进行染色体制片是行之有效的方法。
文档编号C12Q1/68GK101613755SQ20091009474
公开日2009年12月30日 申请日期2009年7月17日 优先权日2009年7月17日
发明者周旭红, 婷 张, 桦 曹, 李绅崇, 敏 桂, 莫锡君, 蒋亚莲, 江 龙 申请人:云南省农业科学院花卉研究所