专利名称：提高植物同化和吸收甲醛能力的植物表达载体及其应用的制作方法
提髙植物同化和吸收甲醛能力的植物^&^体及其JOT
駄领域
本发明属于植物基因工程领域，具体地，涉及一种提高植物同化和吸收甲醛能
力所需植物表达载体PK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi及其在提高植物吸收和耐受外源
甲醛能力中的应用。
背景絲
甲醛目前己被认为是一种主要的室内空气污染气体，它的污染源来自烟雾，家 具，工业粘胶剂及varnishes等(shah and singh 1988)。甲醛反应能力极强，能 与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应，是一种非常活泼的化合物(Feldman 等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol， 1973,13:1-49)，因j!W所有的生物来说都 有很高的毒性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三种 一是使用环保材料；二 是开窗通风；三是用植物或除污剂清除污染，使用除污剂有二次污染的可能。用室 内栽培植物清除甲醛污染，是最自然、最环保的方式，科学研究证明确魏些植物 售g够吸收，甲醛，但吸收能力和速度非常有限(Giese等，1994， Plant Physiol. 104: 1301-1309)。
^^難内S31各种脱甲^itS^，也会产生^i^度的甲醛，所以几乎所有的生 物对甲醛!1^各自的解 1制。1t^物m甲醛毒性有不同的方法，总体上可归纳为两 Wl制氧化甲^^0a;禾l佣同4fcii^固定甲醛。甲基营养菌是一类能利用
ca的各种还原态形式如甲烷、甲醇、甲胺作为碳源和能源生长的微生物。甲基营养
型细菌同化甲醛的途径有三种核酮糖单磷酸途径(RuMP)，丝氨酸途径，核酮糖 二磷酸途径(Ribulose bisphosphate pathway, RuBP)。 RuMP途径作为高效捕^^1 离甲醛的一个系统，在甲醛浓度极低的情况下还能，作用，在该途45中固定甲醛 的关键酶是6-磷酸己酮糖(Hexulose-6-P)合成酶(HPS)和6-磷自糖异构酶(PHI)， 目前已从多种甲基营养型细菌中克隆到hps和phi基因。由于RuMP途径的所有反通过基因工程手段，可以将RuMP途径的两个关键基因hps和phi导入一些非 甲基营养菌中，增强其甲醛代谢能力。
1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中駄量最大的蛋白质，这种蛋白 质的含量占植物细胞中可溶性蛋白的40-50%。 Rubisco的小亚基(rbcS)由细胞核 基因编码，控制rbcS基因表达的启动子为光诱导型启动子(PrbcS)， PrbcS的作用 有很强的组织特异性，需要光信号的诱导，在茎中有低水平的表达，在叶片中的表 达最强。用报告基因的研究结果表明在叶片中PrbcS的活性比CaMV35S的高3-4倍， 因此PrbcS是一种很强的光诱导型启动子(Jefferson等，1987，EMB0， 6:3901-3907)， 常被用来实现目的基因在叶片中的高水平,。rbcS的转移肽可以将其定位到叶绿 体中，因此也在植物基因工程中经常被用于把表达的目标蛋白定位到叶绿体中。
迄今为止，现有技术中未见有提高植物同化和吸收甲醛能力的植物表达载体 pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服天然植物代谢甲醛能力和速度非常有限的缺陷，禾拥基
因工程技术在观赏植物叶片细胞的叶绿体中过量雜hps/phi基因，从而构建一条 有效代谢甲醛的同化途径(图l)，利用植物的光合作用同化甲醛，以提高植物吸收 和耐受甲醛的能力，创造有净化室内甲醛污染的特殊观赏植物，维护人体的健康。
本发明提供的提高植物代谢甲醛能力的植物表达载体是 pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi载体，它是含有甲基营养菌J^co/^c"W鹏卵striMB19 的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖异构酶融合而成的双功能酶HPS/PHI基因 hps/phi的植物表达载体。该载体中，hps/phi基因由番茄Rubisco 3C小亚基的光 诱导型启动子和叶绿,移肽控制其在植物叶片叶绿体中过量表达。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案植物表达载体pK2-35S-PrbcS-W-hps/phi ，为含有番茄1， 5 二磷酸核酮糖羧化 酶(Rubisco)3C小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)及其转移肽序列和甲基营养 菌卵s^i' MB19的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖异构酶融合 而成的双功能酶HPS/PHI基因的植物表达载体。
其中hps/phi基因的GenBank登录号为AB292776。
其起始载体为P證7。
所述的hps/phi基因上游添加有从番茄基因组中分离出来的光诱导型启动子 PrbcS和叶绿体基质定位序列。
所述的pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi载体中含有hps/phi基因，其hps/phi基 因的GenBank登录号为AB292776，所述的hps/phi基因上游都有番茄Rubisco 3C 小亚基的启动子PrbcS和叶绿体定位序列HcT，该植物^ii载体的起始载体为pK2GW7。
植物皿载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi由下述方法构建而成
(1) hps/phi基因的扩增
以hps/phi的原核表达载体pET-23a-hps/phi质粒为模板，用hps/phi基因的 特异性引物，上游引物5' r袭CACCGCATGCAGCTCCMGTCGCCATCG (城)，下游引 物3' 一 TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG 进行扩增，得PCR产物；
(2) hps/phi基因的TA克隆
回收并纯化hps/phi基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法 提取质粒DNA， M: PCR检测和酶切检测获得重纟M粒pMD-hps/phi;
(3) 入门载体pENT砂-PrbcS-*T-hps/phi的构建
用5 力I和feoRI切割pENTR*-PrbcS-*T~GFP和pMD-hps/phi ，回收载体 pENTR*-PrbcS-*T片断和hps/phi基因片断，用连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和 hps/phi基因片断，获得入门载体pENTRHc-PrbcS-W-hps/phi;
(4) hps/phi基因植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的构建通过Gateway技术的LR反应把PrbcS_*T-hps/phi片段亚克隆到植物表达载体 pK2GW7中，获得hps/phi基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-H^T-hps/phi 。 植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的构建方法，包括下述步骤
(1) hps/phi基因的扩增
以hps/phi的原核,载体pET-23a-hps/phi质粒为模板，用hps/phi基因的 特异性引物，上游引物5，孺M:CACCGCATGCAGCTCCMGTCGCCATCG (細)，下游引 物3， 2TZ2cB: TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG 进行扩增，得PCR产物；
(2) hps/phi基因的TA克隆
回收并纯化hps/phi基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法 提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-hps/phi;
(3) 入门载体pENTI^-PrbcS-*T-hps/phi的构建
用和￡coRI切割pENTR*-PrbcS-*T~GFP (见本发明人的另一申请专利，申 请号为200710066422. 9)和pMD-hps/phi ，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和 hps/phi基因片断，用连接酶连接PENTI^-PrbcS-W和hps/phi基因片断，获得入 门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi;
(4) hps/phi基因植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的构建
通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-hps/phi片段亚克隆到植物^ii载体 pK2GW7 (Gateway的目的载体，比利时VIB/Gent公司)中，获得hps/phi基因的植 物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi 。
植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi在制皿高植物吸收和耐鈔卜源甲
醛的能力的转基因植株中的应用。
因为HPS和PHI依次催化的反应的底物和产物都是植物开尔文循环的中间产 物，所以本发明技术方案的提出是基于甲基营养型细菌的甲醛同4^径可以安装成 高等植物开尔文羧化反应的一个支路，基于在植物的叶绿体中过量表达来自
7卵sWMB19的HPS和PHI可以增强转基因植物对甲醛的抗性，并提高植物吸收和 同化外源甲醛的能力。
本发明载体中，hps/phi基因的上游添加有光诱导型启动子PrbcS和叶绿体基 质定,列。本发明使用的光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体定位序列是从番茄的 基因组中分离出来的rbcS-3C的启动子和叶绿体基质定，列，是一个由 切割产生的1.7 kb的DNA片断(Sugita et al. ， 1987， MGG， 209: 247-256)。
本发明利用光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体基质定，列(*T)构建hps/phi 基因的植物表达载体，以便在转基因植物叶片的叶绿体基质中过量表达6-磷酸己酮 糖合成酶/6-磷酸果糖异构酶的融合蛋白HPS/PHI，通过该融合蛋白在转基因观赏植 物的叶绿体中构建甲醛的光合作用同化途径，增强植物同化甲醛的效率，进而提高 了植物吸收和耐受外源甲醛的能力。
图1使用HPS/PHI构建甲醛同化途径的原理示意在叶绿体中过量^ii^功能酶HPS/PHI，另卩么HPS/PHI就可利用开尔文循环的中 间产物Ru5P为固定甲醛的受体，催化以Ru5P和甲醛为^t/的縮合，产生6—磷酸己 酮糖(Hu6P)， HPS/PHI再催化Hu6P的异构化，生成6—磷酸果糖(Fructose 6-P，
F6P),其可作为开尔文循环的中间产物，重i iaA开尔文循环途径。
图2本发明中间载体pMD-hps/phi的构建策略图； 图3本发明中间载体pMIHips/phi的检测A: hps/phi基因扩增产物的检测。M:入DNA/历72din， 1 3: hps/phi基因PCR 扩增产物；
B: pMEHips/phi质粒电泳检测。1 4: pMD—hps/phi ， 5:正对照(pUC18) C: pMD~hps/Phi质粒的酶切检测，M:入DNA/历'/3din， 1 3: 5 力I+iZ7al酶切 pMD~hps/phi的产物；D: pMD~hps/phi的PCR检测。M: ADNA/历yxi111, 1 3: PCR扩增产物。 图4本发明入门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的构建策略图； 图5本发明入门载体pENTI^-PrbcS-*T-hps/phi的检测图； A: pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi质粒电泳检测。M:入DNA/历7 d111， 1 2:
pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi ， 3:正对照(pUC-r-77zp^B);
B: pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的酶切检测。M:入DNA/历/2din， 1 2: ^Z o1
酶切pENT砂-PrbcS-*T-hps/phi的产物,3:正对照(pUC-r-hps/phi)， 4:负对照
(pMEHips/phi);
C: pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的PCR检测，上游引物为5， PrbcS-2，下游引 物为3， ttz祖。M:D2000 DNA marker, 1 3: pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的PCR扩增 产物，4:正对照(以pMHips/phi为模板的PCR扩增产物)。
图6用Gateway的LR反应构建hps/phi基因的植物表达载体的策略图7植物表达载体pK2-35S-PrbcS-求T-hps/phi的检测A:重纟M粒pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的电泳检测。M:入DNA/历/3dl11， 1 2: pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi质粒样品，3:正对照(pK2GW7)， 4:负对照 (pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi);
B: PK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的Wol酶切检测。M: X DNA/历'73din， l:pUC-r-^ra cAB (正对照)，2: pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi;
C: PK2-35S-PrbcS—*T—hps/phi的PCR检测。M: XDNA/ffi/3din， 1 2:以 pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi重M粒为模板，上游弓嫩为5' PrbcS-2,下游引物 为3， r础扩增得到的产物。3 4:以pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi重iSjf粒为模 板，上游弓嫩为5' 2tz M，下游引物为3' r/z cB扩增得到的产物。
图8农杆菌转化子菌落的PCR检测上下游引物分别使用5， iTP/A和3， 2TZ祖。M'. Marker III， 1 2:菌落PCR样品，3:正对照(模板为pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi质茅立)；
图9基因组PCR检测hps/phi在转基因天竺葵中的插入瞎况示意图； 扩增时上下游引物分别使用5， 2tz cA和3， 2tz沐。AB1、 AB2、 AB3、 AB4、 AB5、
AB6、 AB7、 AB8、 AB9、 AB10:转基因天竺葵，WT:野生型天竺葵，+: pMEHhps/phi
作为模板。
图10 western blot检测HPS/PHI在转基因天竺葵中的表达水平图； A:用HPS蛋白抗体作的Western分析；
B:用PHI蛋白抗体作^J Western分析。WT:野生型天竺葵叶片总蛋白；AB5， AB7， AB8:转基因株系天竺葵叶片总蛋白；control:表达重组HPS/PHI的大肠杆菌粗蛋 白。
图ll转基因天竺葵外液体甲醛抗性能力的检测图； WT:野生型天竺葵，AB5:转hps/phi天竺葵株系。 图12转基因天竺葵对气体甲醛抗性能力的检测WT:野生型天竺葵，AB5:转hps/phi天竺葵株系，AB8:转hps/phi天竺葵株系。
图13转基因天竺葵吸收液体甲醛速率测定图。
WT:野生型天竺葵，AB5:转hps/phi天竺葵株系，AB7:转hps/phi天竺葵株 系，AB8:转hps/phi天竺葵株系。 ， 具体实駄式
下面结合附图用本发明的实施例，一步说明本发明的实质性内容，但并不以 此限定本发明。
本发明下述实施例中所用到的试剂与仪器为试剂主要为^ 生物学实验试 剂，其余试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。 本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。载体pK2-35S-PrbcS-*T- hps/phi的构建(1) hps/phi基因的扩增及TA克隆 hps/phi基因的扩增及TA克隆的策略如图2所示，以pET-23a-hps/phi质粒为 模板，设计hps/phi基因的特异性引物(上游引物 5， 2wA:CACCGCATGCAGCTCCAAGTCGCCATCG (&M)，下游引物3， rzz cB: TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG 进行扩增。用hps/phi基因上下游特异性引物5' 2tz A和3' 7t 沐作PCR，在PCR反应混合液中加入50ng的 pET-23a-hps/phi质粒作为模板，同时加入75ng的特异性弓嫩5， tt^和3' ttz cB、 4pl譜(2.5 mM) ，25^1的2XGC Bufferl和0. 25^il的LA taq(5U/nD聚合酶(Takara)，加双蒸水使反应终体积为50|iil 。在PCR仪上于94°C加热2射中，然后 按照94。C、 30秒，55°C、 30秒，72°C、 2 ^H中的禾Mj^进行30个循环的反应，最后 在72°C延长反应10辦中的，进行PCR反应扩增得到hps/phi基因。反应完成后， 通过琼脂糖凝胶电泳分离hps/phi的PCR扩增产物(图3A)。回收并纯化hps/phi全 长基因(1. 2kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的TA克隆试剂盒将其连接到pMD].8-T (大 连宝生物公司)载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合 液转化大肠杆菌感受态DH5a (购自天根生化禾根公司)，采用碱裂解,取质粒 DNA，经1 %琼1離凝胶电泳(图3B)，选取大小和理论值相符的重组质粒pMHips/phi 4腿一步的PCR检测，用hps/phi基因上下麟异性弓嫩5， 2tz^和3' T7z cB作PCR， 亚克隆成功的重M粒均能扩增出1. 2kb左右的hps/phi基因DNA片段(图3D)。根 据阳性重M粒pMD~DAS载体两端的多克隆位点，用^力I和X&I双酶切重IW粒， 经1 %琼3離凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重纟舰粒pMHips/phi产生2条 带， 一条为1.2kb左右的hps/phi基因DNA插入片段，另一条为2. 3kb的载体片断 (图3C)。再次确认题接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5ct，挑单个菌落进 fr液体培养，用试剂盒纯化质粒pMD-hps/phi 。(2) 入门载体pENT砂-PrbcS-*T-hps/phi的构建pEOTR*-PrbcS-*T-hps/phi的构建策略如图4所示，用^S / I (Takara)和化cRI (Takara)切开纯化的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T~GFP (见本发明人的另一发明专 利申请，申请号为200710066422. 9)和pMD-hps/phi，通过琼脂糖凝胶电泳分离已 切开的载体和插入片段，从》 中回收PENTR*-PrbcS-*T~GFP被切割后产生的载体 片断pENTR[PrbcS^T (4. 0kb)及pMD-hps/phi被切割产生的hps/phi基因的DNA 片断(1.2 kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTI^-PrbcS-*丁和 hps/phi基因的DNA片断产生入门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi 。用连接反应混 合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5a，天根生化科扮，把转化好 的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km， 50|ig/ml)的平板上，于37。C过夜培养，筛选Km 抗性重组子離，从Km抗性重组子離中提M粒(图5A)，用屈ol (Takara) 进行酶切检测，连接成功的质粒和对照质粒pUC-r-hps/phi及pMD-hps/phi在琼月旨 糖凝胶电泳图上产生一条l.lkb大小的条带(图5B)。选出连接成功的质粒载体 pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi作为模板，上游引物为5， PrbcS-2 (根据PrbcS光诱导 启动子下游序列设计的上游引物，其序列为MGCCTTATCACTATATATACMG)，下游引 物为3' 2T^进行PCR检测，获得1. 4kb左右的产物，和IM照一致(图5C)。再 次确认，接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5a，挑单个菌落进行液体培养， 用试剂盒纯化质粒pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi 。(3) hps/phi基因植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T- hps/phi的构建 hps/phi基因植物^ii载体的构建策略如图6所示，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-hps/phi亚克隆到植物表达载体pK2GW7 (Gateway的目的载体，购 自比利时VIB/Gent公司)中。具体的做法是用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的 目的载体pK2GW7，在Gateway的LR反应体系中加pENTR*-PrbcS_*T-hps/phi和pK2GW7各150ng， l|til LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen)，混均于25 °C反12应过夜，通过齡酶的作用把PrbcS-*T-hps/phi整合到pK2GW7中获得hps/phi的 植物表达载体质粒pK2-35S-PrbcS-W-hps/phi 。用反应混合物转化高效率(108) 的大肠杆菌感受态细胞加5a，天根生化禾根)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮 观霉素(Spe， 50pg/ml)的平板上，于37。C过夜i咅养，筛选Spe抗性重组子菌落， 从Spe抗性重组子菌落中提取质粒(图7A)。化o1单酶切pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi 质粒和对照质粒pUC-r-hps/phi， 二者均出现一条1. lkb左右大小的条带(图7B)。 以pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi为模板，下游引物为3'頂」cB，上游引物分别为 5， 2T7^和5' PrbcS-2进行PCR扩增，hps/phi基因上下游引物扩增的片段大小为 1.2kb，上游用5， PrbcS-2引物扩增产物约为1. 4kb (图7C)。确认是连接成功的 质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 a ,挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。 实施例2:用含有hps/phi基因的植物^&载,tt^杆菌 制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体PK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi转入农杆菌(C58C1 (pPMP90))中，在加有壮观霉素的 平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加 入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化 仪(BIO-RAD)滑槽中，用l咖的电击杯和200欧姆，2. 5kV/0. 2cm的参lfcS行电击， 电击后立即取出电转化杯,M加入O. 5mlS0C培养基，混匀，转移到1. 5ml的离心 管中；28°C， 200rpm摇床培养3—5h;室温下，7500rpm离心lmin，弃大部分上清， 保留lOOjil将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe， 50pg/ml)的LB固体培 养基上，28"培养2天获得单 :;首先用牙鄉fe取农杆菌m^^入20pl ddaO 中，98。C处理15射中后取出10jxl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用上下游引 物5' 和3' 一作PCR检测，转化成功的菌落均能扩增出1.2kb的hps/phi 基因条带(图8 )，经菌落PCR确认,化子菌落用于转化植物。实施例3:用含有hps/phi基因植物表M体的农杆菌转化植物挑取携带有质粒pK2-35S-PrbcS-氺T-hps/phi的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培养基中(含Spe， 100pg/ml), 180rpm， 28。C培养24h，待菌液ODeoo至1.0左右，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。重复以上操作2 3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的ODeoo值为0.5。制备天竺葵(尸e7az^ m'鹏sp.frensham)的无菌
苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化天竺葵，然后m组织培养获得小苗，进一步
筛选获得所需的转基因植物。具体步骤如下，把无菌天竺葵的叶柄切成小段，在制备好的农杆菌菌液中浸染15—20min，用无菌吸7條吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1 (MS+NM02. l|ag/ml+BAP 0.02|ig/ml)上黑暗共培养2天，将外植,移至含卡那霉素(50pg/ml)的芽诱导培养基MS4 (MS+NM0. 53pg/ml+BAP0. 5pg/ml)上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生鹏，转入含卡那霉素(50]ag/ml)的MS培养基上进行根的诱导，获得转入hps/phi基因的植株。实施例4: hps/phi基因在转基因植物中的插入情况
为了确认通过卡那霉素筛选的转基因天竺葵株系确实含有导入的目的基因的DNA片段，用PCR方法对筛选到的转基因植物作进一步的鉴定。首先采用CTAM娥取植物基因组称取植物叶片100rag左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特审,棒研磨至粉末状；加入900nl预热到65。C的2XCTAB缓冲液(Tris-HC1 pH 7.5 100mM，EDTA 20慮,NaCl 1.4 M， CTAB 2%), 65。C度水浴加热20 ，后取出冷却；加入500nl氯仿一异戊醇混合液(24: 1)摇匀，4。C离心10min (7500rpm)后转移上清至1. 5ml EP管；再次加入50(^1氯仿—异戊醇混合液(24: 1)摇匀，4t:离心10min(7500rpm);取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3M pH5. 2醋,和等体积异丙醇，摇匀后4。C离心20min (12000rpm);弃上清，用75%乙醇清洗两次后，千燥，用含RNase的TE缓冲液溶解并,RNA。以植物基因组DNA为模板，用hps/phi基因上下游特异性引物作PCR检测，成功转入hps/phi基因的植株均能扩增出1. 2kb的hps/phi条带(图9)。经PCR确认的转基因植株用于western-blot分析。实施例5: hps/phi在转基因天竺葵中^K平检测
采用western-blot方法检测hps/phi在转基因天竺葵中,水平。首先使用Plant Total Protein Extraction kit (Sigma, USA)从天竺葵叶片中抽提可溶性总蛋白，操作步骤参照说明书。再用Bradford方法测定样品中的蛋白质浓度后，每个样品取15 u g总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后半干转膜至PVDF-P膜(GE, USA)。 一抗分别为甲基营养菌必ro力scf er/譜卵sz^' MB19 HPS和PHI的兔抗体，二抗为辣根过氧化酶标记的猴抗兔IgG (GE，USA)。转基因天竺葵样品和正对照样品中都有一条41kD左右目标蛋白带，而在野生型样品没有出现(图IO)，说明A^/ph'基因编码的蛋白已在转基因植物中成功地表达。
实施例6:转hps/phi基因植物对甲醛的抗性检测
为了检测hps/phi在转基因植物中是否发挥预期作用，将AB5株系转基因植物小苗和未转基因植物的野生型小苗移入加有甲醛(浓度为7mM)的MS固体培养基上，在25'C持续光照培养，15天后观察植物表型变化(图11)。结果说明同时转入hps/phi的植物比野生型长势好，，说明引入的甲醛同皿径能够在植物中发挥预期作用，增强植物对甲醛的同化能力，使转基因植物对于培养基中液体甲醛的抗性增强。
为了g转基因植物对气体甲醛的抗性，将AB5和AB8株系转基因植物幼苗移入有MS培养基的密封容器中培养，约15天生te在容器中自一个开口的500 ul离心管，并在离心管中加入一定量(30ul ) 37%的甲醛溶液。25"C光照培养15天后，观察转基因植物的生长状况，转基因天竺葵生长状况明显优于野生型天竺葵(图12)，说明转hps/phi基因可提高天竺葵对气体甲醛的抗性。
实施例7:转基因^葵自体甲醛吸iltoi率的^i
甲醛可与Nash试剂(醋酸氨15%，冰醋酸0.3%,乙酰丙酮0.2%)发生化学反应产生有颜色的物质，该物质的最大吸收波长为410nm，因此可以制备甲醛的标准曲线，根据HCHO的标准曲线即可计算出反应液中甲醛的含量，利用该方法可以测定植物对甲醛的吸收速率。取2g左右植物叶片材料放入小三角瓶中，加入150ml甲醛(4mM)溶液处理一定时间后，取出40ul处理液，加水至500ul，再加入500"1 Nash试剂在3(TC保温30辦中后，测定OD仙，根据标准曲线计算出处理液残存甲醛浓度(图13)。处理70小时后，转基因天竺葵株系AB5、 AB8已经将处理液中所有甲醛吸收完毕，转基因株系旭7处理液中残留约7%甲醛，而野生型甲醛残留高达33%。三个转基因天竺葵株系在90小时后已经将处理液中所有甲醛吸收完毕，而野生型天竺葵处理液中仍然残留约17%甲醛。因此转hps/phi天竺葵吸收甲醛的速率明显高于野生型植株，能在较短的时间内将处理液中的外源甲醛吸收完毕。
与现有技术相比，本发明的优越性在于本发明克服了天然植物代谢甲醛能力和速度非常有限的缺陷，禾,基因工程技术在观赏植物叶片细胞的叶绿体中过量表达hps/phi基因，从而构建一条有效代谢甲醛的同，径(图l)，利用植物的光合作用同化甲醛，达到了提高植物吸收和耐受甲醛的能力，创造有净化室内甲醛污染的特殊观赏植物，维护人体的健康的目的。
本发明利用光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体基质定位序列(*T)构建hps/phi基因的植物,载体，以便在转基因植物叶片的叶绿体基质中过量表达6-磷酸己酮糖合成酶/6-磷,糖异构酶的融合蛋白HPS/PHI， M该融合蛋白在转基因观赏植物的叶绿体中构建甲醛的光合作用同化途径，增强植物同化甲醛的效率，进而提高了植物吸收和耐鈔卜源甲醛的能力。
权利要求
1、植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi，为含有番茄1，5二磷酸核酮糖羧化酶Rubisco 3C小亚基基因的光诱导型启动子PrbcS及其转移肽序列和甲基营养菌Mycobacterium gastri MB19的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖异构酶融合而成的双功能酶HPS/PHI基因的植物表达载体。
2、 如权禾腰求1所述的植物魏载体，其hps/phi基因的GenBank登录号为 AB292776。
3、 如权利要求1戶腿的植物魏载体，其起始载体为pK2GW7。
4、 如权利要求1所述的植物表达载体，所述的hps/phi基因上游添加有从番茄基因组中分离出来的光诱导型启动子PrbcS和叶绿体基质定位序列。
5、 权利要求l的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi，由下述方法构 建而成(1) hps/phi基因的扩增以hps/phi的原核，载体pET-23a-hps/phi质粒为模板，用hps/phi 基因的特异性引物，上游引物5' 2wA:CACCGCATGCAGCTCCMGTCGCCATCG(城)，下 游引物3， 7tz沐TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG 进行扩增，得PCR产物；(2) hps/phi基因的TA克隆回收并纯化hps/phi基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱 自 取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重,粒pMD~hps/phi;(3) 入门载体pENT扭-PrbcS-*T-hps/phi的构建用S/ 力I和fcoRI切割pENTR*-PrbcS-*T~GFP和pMCHips/phi ，回收载体 pENTR*-PrbcS-*T片断和hps/phi基因片断，用连接酶连接PENTR*_PrbcS-*T和 hps/phi基因片断，获得入门载体pENT肿-PrbcS-*T-hps/phi;(4) hps/phi基因植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的构建通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-hps/phi片段亚克隆至诉直物表 达载体pK2GW7中，获得hps/phi基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi。
6、 植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的构建方法，包括下述步骤(1) hps/phi基因的扩增以hps/phi的原核表达载体pET-23a-hps/phi质粒为模板，用hps/phi基因的 特异性引物，上游引物5' 7TgM:CACCGCATGCAGCTCCMGTCGCCATCG (柳)，下游引 物3， T7z cB: TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG (iZ近I))进行扩增，得PCR产物；(2) hps/phi基因的TA克隆回收并纯化hps/phi基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法 提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重乡舰粒pMD~hps/phi;(3) 入门载体pENTI^-PrbcS-W-hps/phi的构建用5 M和fcoRI切割pENTR*-PrbcS-*T~GFP和pMD~hps/phi ，回收载体 pENTR*-PrbcS-*T片断和hps/phi基因片断，用连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和 hps/phi基因片断，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi;(4) hps/phi基因植物表达载体pK2-35S-PrbcS-氺T-hps/phi的构建通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-hps/phi片段亚克隆到植物表达载体 pK2GW7中，获得hps/phi基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi。
7、 权利要求1^5植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi在制皿高植物 吸收和耐受外源甲醛能力的转基因植株中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种提高植物同化和吸收甲醛代谢能力的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi，为含有番茄1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)3C小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)及其转移肽序列和甲基营养菌Mycobacteriumgastri MB19的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖异构酶融合而成的双功能酶HPS/PHI基因的植物表达载体。以HPS/PHI的原核表达载体pET-23a-hps/phi质粒为模板扩增得到hps/phi基因，用光诱导型启动子和叶绿体转移肽控制其在植物叶片叶绿体中的表达，提高植物同化和吸收甲醛能力。实验表明在外源高浓度的气体和液体甲醛环境中生长时，转基因植物的生长状态好于野生型，叶片萎黄现象较轻。在4mM甲醛处理液中，转基因植物叶片能够在90小时内完清除处理液中的甲醛，但野生型叶片吸收效率较慢，仍有17％甲醛残留。
文档编号C12N15/82GK101629185SQ20091009483
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月13日 优先权日2009年8月13日
发明者宋中邦, 李昆志, 飞 殷, 胡清泉, 陈丽梅, 陈红梅, 莉 马 申请人:昆明理工大学