专利名称：：一种病圃中烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法
技术领域：
：本发明属于植物病原鉴定
技术领域：
，具体涉及烟草黑胫病菌生理小种的鉴定与黑胫病抗性的鉴定，特别是涉及一种对烟草黑胫病菌生理小种鉴定的方法。
背景技术：
：烟草黑胫病是烟草(M'c^/""flto6a^m)生产上的毁灭性病害之一，是制约我国各烟区烟叶生产的最重要因素，可以危害烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等所有的栽培烟草。美国北卡罗莱纳州每年因烟草黑胫病损失的烟叶约占总产量的1%2%，1995年和1996年两年间因黑胫病造成的损失就达3610万美元，占病害总损失的35.13%，居各病害之首。该病在我国分布范围很广，除黑龙江省尚未发现之外，其余各植烟省区(含台湾省)均有发生。平均发病率为5%12%，严重田块发病率高达75%，甚至造成绝收。据不完全统计，我国烟草黑胫病平均每年发病面积高达76373hm2，产量损失2869.26万千克，产值损失超过l.23亿元人民币。生产实践表明，防治黑胫病最经济、有效、环保的措施就是选育抗病品种，抗性鉴定自然成为抗源挖掘利用、抗病育种、抗性监测等工作中重要的一环。烟草黑胫病菌的变异性是烟草黑胫病实施综合防治计划中应当注意的重要问题之一。在烟草的生产过程中，新的高毒力菌系或新的生理小种的出现，往往使一批抗病品种"丧失"抗病性而成为感病品种，造成病害大流行，于是人们又开始新的抗病育种工作。所以，明确烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法，研究烟草黑胫病菌生理小种的变化和组成，及其与寄主抗性间的关系，对烟草抗黑胫病育种工作是极端重要的。到目前为止，尚未见病圃中烟草黑胫病菌生理小种鉴定方法的报道，国内亦没有针对某一明确的生理小种类型开展烟草黑胫病的抗病性鉴定。
发明内容本发明提出一种病圃中烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法，本发明采用鉴别寄主在田间的抗病反应与采集菌株在TTC固体培养基平板上的颜色变化相结合的方法，以尽快鉴定出对所测病圃中烟草黑胫病菌的生理小种，为烟草黑胫病的综合防治和确立抗病育种的目标提供依据。本发明的目的通过以下技术方案实现一种病圃中烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法，包括以下顺序步骤一、测定鉴别寄主在田间的抗病反应；在病圃中栽培鉴别寄主尺//"附^^刚》//(3、NC1071、L8、TV.m^/cm^;y、抗病对照K326、感病对照红大和任意其他种质，如潘圆黄、BL-921、CV78-5。每品种设3个重复，按照病圃管理办法进行管理，烤烟采收后挖根调査，按国家标准对鉴定品种进行分级和抗性评价。结合前人烟草黑胫病菌O、1、2和3号小种的寄主反应判断生理小种类型。二、测定菌株在TTC固体培养基中的颜色变化；从病圃中随机采集不同品种的病株，分离纯化病原并鉴定后，进行TTC法测定。根据颜色变化判断烟草黑胫病菌生理小种类型。三、综合上述两步鉴定结果，判断生理小种类型。本发明率先提出了一种具有实用价值的烟草黑胫病菌生理小种鉴定方法，实现了对现有病圃中烟草黑胫病菌的生理小种类型进行鉴定，然后有针对性地开展烟草抗病种质资源筛选和烟草新品种选育等研究，是一种较为经济实用的方法，具有良好的市场应用前景。图1为供试菌株在TTC固体培养基上产生明显的颜色变化的示意图。具体实施例方式实施例l:1、材料与方法l.l供试材料l丄l培养基燕麦液体培养基用于摇床加富培养，燕麦固体培养基用于菌株活化与培养，加0.05g/mL氯霉素用于病原的分离与纯化。蔗糖-柠檬酸-维生素-无机盐(SCBM)液体培养基蒸馏水1000mL、蔗糖30g、柠檬酸20g、氯化钙1.0g、硝酸钾2.0g、磷酸二氢钾0.67g、磷酸氢二钾0.33g、1%三氯化铁10滴、VB1lmg。TTC液体培养基为上述培养基中加入0.05%TTC;TTC固体培养基为燕麦琼脂培养基内加入0.05%TTC。表1所用试剂规格、纯度、厂家<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>l丄2供试品种iV.p/i/mk^!>H/o//a、NC1071、L8、iV.m^//cawfc、红大(CK)、K326(CK)、潘圆黄、BL-921、CV78-5。1.2方法1.2.1鉴别寄主在田间的抗病反应在云南省烟草科学研究所研和试验基地进行试验测定。利用有病连作烟田作病圃，诱其自然发病。06-08年自然病圃中种植iV.p/ww&gz>n:/b//a、NC1071、L8、W."w&cm^y、红大(CK)、K326(CK)、潘圆黄、BL-921、CV78-5等品种，小区随机排列，三次重复，每品种每重复种植一行，每行35株。栽培管理常规漂浮育苗、适龄移栽，烟苗成活后田间多浇水，保证田间湿度，施肥按常规管理。植株生长期均不施用杀菌剂，虫害管理与大田管理相同。病害严重度分级按中华人民共和国烟草行业标准YC/T39的规定。抗性评价标准按中华人民共和国烟草行业标准YC/T41-1996的方法进行。自然发病于病发初期、盛期和未期各调查一次，每次均应调查各品种全部植株，并计算各品种的病株率、病情指数，然后以病情指数为主要依据评定各品种的抗病能力。(1)病害分级标准(以整株为单位)0级全株无病；1级茎部病斑不超过茎围1/2，或半数以下叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑；2级茎部病斑超过茎围的1/2，或半数以上叶片调萎；3级茎部病斑环绕茎围，或2/3以上叶片凋萎；4级病株全部叶片凋萎或枯死。病情指数计算病指-2X各级病株数x该病级值y(调査总株数x最高级值)x100(2)抗性评价标准高抗病情指数05，用HR表示；抗病病情指数为5.0125，用R表示；中抗病情指数25.0150，用MR表示；中感50.0175，用MS表示；感病病情指数75以上，用S表示。试验数据用浙江大学唐启义、冯明光编的实用统计分析及其DPS数据处理系统进行分析，分析抗病性差异。结合前人烟草黑胫病菌O、1、2和3号小种的寄主反应(表l)判断生理小种类型。表l烟草黑胫病菌O、1、2和3号小种的寄主反应寄主名称病害反应特殊反应0号小种1号小种2号小种3号小种RSRMS叶对0号小种感病NC1071RS/RN.咖cZ/cawfcRs//N.//柳6喂>^//"Rs//注病害反应R为抗病，MS为中感，S为感病。1.2.2供试菌株在TTC固体培养基平板上的颜色变化08年从玉溪研和自然抗性鉴定病圃中随机采集4个不同品种的病株，分离纯化病原并鉴定后，进行TTC法测定。TTC法测定的病菌在SCBM固体(pH5.5)培养基28。C恒温培养，培养基分别加TTC(0.05。/。,w/v)和不加两种处理，定期观察菌落生长和颜色反应。每处理设3个重复，以不加TTC的燕麦琼脂培养基为对照，观察颜色反应。2结果与分析2.1供试菌株在TTC固体培养基平板上的颜色变化表2各分离物在TTC固体培养基内的变色反应培养基菡株编号采集品种时间2h12h24h48h72h96h120hBpl潘圆黄-+++++++++++++TTC固体培养基BP2BP3BL-921CV78-5-+++++++++++++++++++++BP4K326-++++++++++++Bpl潘圆黄CKBP2BP3BP4BL-921CV78-5K326注-无色(nocolour)+微红(lightred)++浅红色(red)+++深红色(crimson)各分离物在培养基中生长时菌落呈放射状，在显微镜下观察，菌丝无隔膜，分枝多呈锐角，孢子囊形状呈椭圆形，初生孢子囊无明显乳突，成熟孢子囊顶端有一明显乳突，接种红大烟苗发病症状同烟草黑胫病，确定为烟草黑胫病菌株。分离纯化的4个菌株，在TTC固体培养基上产生明显的颜色变化如表2和图1所示，故该4个菌株应为0号或1号小种。2.2鉴别寄主在田间的抗病反应表3大田烟草种质资源的抗性评价品种名称平均病指标准差抗性评价5%显著水平1%显著水平4.177.22RcBNC]0717.874.01RbcB24.070.80RbBTV.22.220.00RbcB红大(CK)76.8518,85SAK326(CK)7.876.85RbcB结合田间抗性鉴定结果表3，鉴别寄主TV.m^/cm/to、L8、NC1071、W/^mkjg!'m:/b/&对烟草黑胫病菌表现为R，抗病对照K326表现抗病，感病对照红大表现感病，病情指数高达76.85%，与其它抗病品种病指差异极显著。结合已报道的四个小种的寄主反应(表1)，判断该田块黑胫病菌应为0号生理小种，从该大田中随机采集的四个烟草品种潘圆黄、BL-921、CV78-5、K326上的烟草黑胫病菌，通过生理分化方法鉴定结果为0或1号生理小种，故确定所测病圃病原为0号生理小种。实施例2:该病圃中烟草黑胫病抗病种质资源的筛选烟草黒胫病是由烟草疫霉[尸/^鄉滅ora7ams7力'cavar."z'c加.a""g(BredadeHean)Tucker]引起的一种世界性烟草毁灭性真菌病害。病原菌属鞭毛菌亚门疫霉属，是喜高温高湿的兼性寄生菌，可以危害所有的烟草类型，在烟草生长的任何阶段都能侵染根、茎、叶，引起萎蔫、茎损伤和植株死亡。近年来，由于连作烟田面积扩大以及连作年限的增长，烟草黑胫病有加重流行的趋势。为减轻该病造成的损失，人们曾用农业防治、化学防治、抗病育种等多种不同方法控制烟草黑胫病，但由于该病菌的游动孢子形成速度快且数量大，侵染烟株后潜育期短、发病快，在一个生长季节可以发生多次再侵染，同时该病有时还与其它病害混合发生，一旦病害流行则难以控制。如果防治措施不到位黑胫病引起的损失可达100%。针对目前烟草黑胫病的严重危害，研究抗病新品种已成为当今防治烟草黒胫病的重点。本申请针对某一生理小种，开展烟草抗病种质资源的筛选，旨在为有效控制烟草黒胫病的发生、减小经济损失提供理论依据。1材料与方法1.1试验条件本研究田间试验于2006~2008年在云南省烟草科学研究所研和试验基地进行，属亚热带内陆高原型气候，年平均气温15.523/TC，年平均降雨量700卯0mm。栽培土壤为红壤土，根作层3545cm。1.2材料供试品种包括CV16-2、Iskngold、CV78-5、晋太7615、乌江1号、筑波1号、CV78-4、DarisSpecial、落地黄、NC2514、小黄金1025、MD609、革新三号、N.plumbaginifolia、G28、NC95、NC1071、L8、N.nudicaulis、CokerTobacco、H80A432、安选79-l、潘圆黄、NC86、、M二》卜、NC-22-NF、BL-921、曰本烤烟l、龙岩C2、津引1号、COM烟、OX414、RG12、K358、RG17、D101、80X2028。以G28、K326、革新三号为抗病对照品种，红花大金元、小黄金1025为感病对照品种。1.3试验设计06-08年采用单因素完全随机区组设计，每一品种(系)为一处理，三次重复，每品种种植3墒，每墒18株，行株距为120cmX50cm，试验田面积为2.3亩。移栽后团棵期进行高培土，整个大田期共喷施防虫农药4次，并未喷施抗菌类农药。其他栽培管理措施均按照云南省烟草科学研究所的生产技术方案要求进行。l丄4抗病性测定最后烟叶釆收完毕，挖根调査，计算各品种发病率和病情指数，以病情指数作为抗性指标，根据抗性划分标准，评价各测定品种的抗病能力。病害调查分级标准与抗性划分标准同前面1.2.1。2结果与分析2.1烟草种质资源抗性鉴定结果表4各鉴定材料病指间的差异显著性处理08年病指抗性处理08年病指抗性BL-92199.07土L61aASNC-22-NF8.33土4.81ijklfJR红大(CK)76,85土l&.85bABSDarisSpecial7.87士5.26ijkl1JR潘圆黄76.85士U.97bABSNC10717.87土德ijkLTR晋太761573.15士l3.49bBCMSK326(CK)7.87士6.85ijklIJRCV78匿554.63士25.20cBCDMSCokerTobacco7.87士7.13ijklIJRIskngold51.39i33.36cdBCDEMSD1017.41±6.99jklIJRM訓942.59i3.20cdeDEFMR落地黄6.02士7.13jklIJRa:。m42士l'.65cdefDEFGMRRG126.02土0.80jklJR筑波l号36.58土7.90cdefgDEFGHMR津引1号6.02±2.89jkllJR小黄金102532.87士4.88defghDEFGHIMRs、Y二卜5.09士2.12jk11JR革新三号29.17土17.07efghiDEFGHUMRN.plumbaginifolia4.17士7.22jklJHRCV16-225息12.50efghijEFGHIJRNC863.70士5.26jklJHR24.07士0.80efghijkFGHIJRK3583.70士2.89jklJHRN,nudicaulis22.22土0.00efghijklFGHLfROX4143.24士4.46jklJHR安选79-119.91士11.14fghijklFGHURCOM烟2.31士4.01kiJHR,M3216.67土11.87ghijklFGH[JRG28i.85士3.2UJHRNC251415.28士13.25hijklFGHURNC951.39士1.391JHR龙岩C214.35士17.69hijklG1IUR口本烤烟l139上1.391JHR<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>烟叶采收完毕后，挖根调査，计算病情指数，根据抗性评价标准评价种质资源的抗病性。通过对39份烟草种质资源抗黑胫病鉴定(表4)，抗病对照K326的平均病指7.87，抗性评价在抗病范围内，感病对照红大的平均病指为76.85，抗性评价在感病范围内。烟草品种BL-921发病最重，病情指数最高，达99.07，高于红大病指，与感病对照红大间差异显著，其余品种发病轻于红大，其中潘圆黄、晋太7615与红大间差异不显著，其余品种与红大差异显著。RG17的病情指数最低，为0.93。高抗品种N./7/ww6塔/w/oto、G28、NC95、NC86、日本烤烟l、COM烟、0X414、K358、RG17与抗病对照品种K326差异不显著，所有抗病品种CV16-2、CV78-4、DarisSpecial、落地黄、NC2514、NC1071、L8、N.m^caw/^、CokerTobacco、H80A432、安选79-l、二>卜、NC-22-NF、龙岩C2、津引l号、RG12、D101、OX2028与K326差异亦不显著。感病品种有BL-921、红大、潘圆黄、晋太7615、CV78-5、Islangold、MD609、乌江1号、筑波1号、小黄金1025与K326差异极显著。权利要求1、一种病圃中烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法，其特征在于步骤如下一、测定鉴别寄主在田间的抗病反应在病圃中栽培鉴别寄主，烤烟烟叶采收后挖根调查，按国家标准对鉴定品种进行分级和抗性评价，结合烟草黑胫病菌0、1、2和3号小种的寄主反应判断生理小种类型；二、测定菌株在TTC固体培养基中的颜色变化；从病圃中随机采集不同品种的病株，分离纯化病原并鉴定后，进行TTC法测定。根据颜色变化判断烟草黑胫病菌生理小种类型；三、综合上述两步鉴定结果，鉴别寄主在田间的抗病反应和TTC测定结果判断生理小种类型。2、根据权利要求l所述的病圃中烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法，其特征在于所述鉴别寄主为^/^附&*"//0/&、NC1071、L8和JV.m^/cawfc。3、根据权利要求l所述的病圃中烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法，其特征在于所述抗病对照为K326。4、根据权利要求l所述的病圃中烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法，其特征在于所述感病对照为红大和任意其他种质，如潘圆黄、BL-921、CV78-5。全文摘要一种病圃中烟草黑胫病菌的生理小种鉴定方法，采用鉴别寄主在田间的抗病反应与采集菌株在TTC固体培养基平板上的颜色变化相结合的方法，可以尽快鉴定出对所测病圃中烟草黑胫病菌的生理小种，实现了对现有病圃中烟草黑胫病菌的生理小种类型进行鉴定，然后有针对性地开展烟草抗病种质资源筛选和烟草新品种选育等研究，为烟草黑胫病的综合防治和确立抗病育种的目标提供依据；是一种较为经济实用的方法，具有良好的市场应用前景。文档编号C12Q1/18GK101671720SQ20091009499公开日2010年3月17日申请日期2009年9月22日优先权日2009年9月22日发明者勇刘,卢秀萍,李梅云,李永平,高家合申请人:云南省烟草农业科学研究院