一种两步法盐析纯化重组丝蛋白的方法

专利名称：一种两步法盐析纯化重组丝蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及材料制备技术领域，尤其涉及一种两步法盐析纯化重组丝 蛋白的方法。
背景技术：
桑蚕丝除了作为纺织原料外，由于其优越的力学性能和相对良好的生 物相容性，近年来，以丝素蛋白为基材的各种细胞生长支架材料的研究应 运而生，成为组织工程中的一个热门研究领域。桑蚕丝素蛋白的分子一级
结构具有高度的重复性，其中70y。由Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser氨基酸序列 组成，是丝素蛋白结晶区域的主要构成单元，为蚕丝蛋白提供良好的热稳 定性、强度和弹性模量；而Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Tyr 、 Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Val-Gly-Tyr等序列组成丝素蛋白的半结晶区，为蚕 丝蛋白提供良好的伸展能力和弹性。随着对桑蚕丝素蛋白的基因和分子结 构的深入研究，利用基因重组方法来合成类丝状蛋白质材料已经成为了可 能。专利号为200610049415.3，名称为"一种重组动物丝-RGD融合蛋白及 其生物合成方法"发明专利制得了重组动物丝一RGD融合蛋白SEQ ID NO: 1。 由于重组丝蛋白的后续应用开发需要大量且具有一定纯度的原料，而 外源基因在表达过程中必然伴有宿主以及其它基因的表达，所以从多种杂 蛋白体系中纯化出目的融合蛋白显得尤其重要，而采用亲和层析虽然可以 制得高纯度的重组蛋白，但工艺复杂，成本高且不适于大量制备。

发明内容
本发明的目的是提供工艺简单、成本低、操作方便的一种两步法盐析 纯化重组丝蛋白的方法，该方法包括下列步骤(1) 将含有目的基因表达质粒的大肠杆菌经发酵培养和IPTG诱导表 达后，离心收集菌体，将其重悬于裂解缓冲液中，冰浴并超声波破碎后， 离心收集上清，调节pH至6.0后，添加(朋4)2304至20%饱和度，并于37°C 静置2小时后离心收集上清液；
(2) 将步骤(1)所得的上清液调至pH6.0，添加(NH4)2S04至40X饱 和度，并于37。C静置2小时后离心收集沉淀，经过真空干燥后得重组丝蛋 白粉末。
步骤(1)中所述的发酵培养，其所用的发酵培养基是TB液体培养基。 步骤(1)中所述的IPTG的浓度是1 mM，诱导时间4小时。 步骤(1)中所述的诱导表达后离心收集菌体，其离心是在4'C， 8000 rpm， 20 min。
步骤(l)中所述的裂解缓冲液是pH8.0， 50mmol/LNaH2P04， 300mmol/L NaCl， 10咖ol/L咪唑。
步骤(1)中所述的超声波破碎后离心是4。C， 14500 rpm， 10 min。 步骤(1)中所述的调节pH是用HC1和1N NaOH溶液调节pH值。 步骤(l)中所述的37。C静置2小时后离心是4。C， 12000 rpm， 20min。 步骤(2)中所述的离心是4T:， 12000 rpm， 20 min。
本发明的有益之处在于，本发明的方法制备的每升培养基可以生产重 组丝蛋白lg左右，与现有技术(对照例)相比，提高20倍，大大提高了 重组蛋白的生产效率。


图1分别为本发明实施例和对照例中重组丝蛋白的十二烷基硫酸钠一 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)照片。
图1中1泳道一蛋白质分子量标准；2泳道一对照例中的重组丝蛋白， 分子量为22 KD; 3泳道一实施例中的重组丝蛋白，分子量为22 KD。
具体实施例方式
4下面结合实施例详细说明本发明的技术方案。 实施例
(1) 将含有目的基因(对应的氨基酸序列为n个SEQ ID NO: 1)的 表达质粒(pET30a(+)-SilkRGD(n)，具体参考专利200610049415. 3，名称 为"一种重组动物丝-RGD融合蛋白及其生物合成方法")的大肠杆菌在1L TB液体培养基中发酵培养0. 5小时，并经IPTG (1 mM)诱导表达4小时后， 离心(4'C， 8000 rpm， 20 min)收集菌体，将菌体重悬于裂解缓冲液(pH 8.0， 50簡1/L NaH2P04 , 300 mmol/L NaCl， 10 mmol/L咪唑)中，冰浴 并超声波破碎，离心(4°C， 14500 rpm， 10 min)收集上清，用HC1和1N Na0H溶液调节pH至6.0后，添加(NH4) 2304至20%饱和度，并于37。C静置 2小时后离心(4°C， 12000 rpm， 20 min)收集上清液；
(2) 用HC1和1N NaOH溶液调节步骤(1)所得上清液的pH至6. 0， 添加(朋4)2S04至40%饱和度，并于37T静置2小时后离心(4。C ， 12000 rpm， 20 min)收集沉淀，经过真空干燥后得l g重组丝蛋白粉末。
对照例
为获取高纯度重组蛋白的亲和层析法。
将含有目的基因表达质粒的大肠杆菌(取与实施例1相同情况下的大 肠杆菌)在1L TB液体培养基中发酵培养0. 5小时，并经IPTG IPTG (1 mM) 诱导表达4小时后，离心(4°C, 8000 rpm， 20 min)收集菌体，将菌体重 悬于裂解缓冲液(pH8. 0， 50mmol/LNaH2P04， 300 mmol/L NaCl， 10iranol/L 咪唑)中，冰浴并超声波破碎，，离心(4"C， 14500 rpm， 10 min)收集上 清后，上样于Ni-NTA柱(购自德国QIAGEN公司)，用相同柱床体积的洗涤 缓冲液(pH 8. 0， 50 mmol/L NaH2P04， 300 mmol/L NaCl， 50 mmol/L咪唑) 洗柱3次，最后用同样柱体积的洗脱缓冲液(pH8.0， 50 mmol/L NaH2P04， 300 mmol/L NaCl， 250 mmol/L咪唑)洗脱，收集含目的蛋白的洗脱溶液， 将洗脱溶液放入透析袋中，于4。C下透析三天，冷冻干燥后得60 mg重组 丝蛋白粉末。
实施例结合图1:图1分别为本发明实施例和对照例中制备的重组丝蛋白的SDS-PAGE图。图l中l泳道一蛋白质分子量标准；2泳道一对照 例中的重组丝蛋白，分子量为22KD; 3泳道一实施例中的重组丝蛋白，分 子量为22 KD。采用两步法盐析纯化能够得到纯度较高的重组丝蛋白。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显 然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术 人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本 发明的保护范围。序列表
SEQ ID NO 1:
15 Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val 30 Pro Gly Val Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala 40 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Ala Ser
权利要求
1、一种两步法盐析纯化重组丝蛋白的方法，其特征在于包括步骤如下(1)将含有目的基因表达质粒的大肠杆菌经发酵培养和IPTG诱导表达后，离心收集菌体，将其重悬于裂解缓冲液中，冰浴并超声波破碎后，离心收集上清，调节pH至6.0后，添加(NH4)2SO4至20％饱和度，并于37℃静置2小时后离心收集上清液；(2)将步骤(1)所得的上清液调至pH6.0，添加(NH4)2SO4至40％饱和度，并于37℃静置2小时后离心收集沉淀，经过真空干燥后得重组丝蛋白粉末。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的发酵培养， 其所用的发酵培养基是TB液体培养基。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的IPTG的 浓度是l mM，诱导时间4小时。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的诱导表达 后离心收集菌体，其离心是在4'C， 8000 rpm， 20 min。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的裂解缓冲 液是pH 8.0， 50 ramol/L NaH2P04， 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑。
6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的超声波破 碎后离心是4。C， 14500 rpm， 10 min。
7、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的调节pH 是用HC1和1N Na0H溶液调节pH值。
8、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的37。C静 置2小时后离心是4。C, 12000 rpm， 20 min。
9、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的离心是4°C， 12000 rpm， 20 min。
全文摘要
本发明公开了一种两步法盐析纯化重组丝蛋白的方法，(1)将含有目的基因表达质粒的大肠杆菌经发酵培养和IPTG诱导表达后，离心收集菌体，将其重悬于裂解缓冲液中，冰浴并超声波破碎后，离心收集上清，调节pH至6.0后，添加(NH₄)₂SO₄至20％饱和度，并于37℃静置2小时后离心收集上清液；(2)将步骤(1)所得的上清液调至pH 6.0，添加(NH₄)₂SO₄至40％饱和度，并于37℃静置2小时后离心收集沉淀，经过真空干燥后得重组丝蛋白粉末。本发明的有益之处在于，本发明的方法制备的每升培养基可以生产重组丝蛋白1g左右，与现有技术(对照例)相比，提高20倍，大大提高了重组蛋白的生产效率。
文档编号C12P21/02GK101487037SQ20091009619
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者吴娟红, 吴罗杰, 姚菊明, 凯 沈, 范科杰 申请人:浙江理工大学