专利名称：基于多孔微囊技术构建新型高效生物催化剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种“基于新型多孔微囊技术构建高效生物催化剂”的新技术。
背景技术：
在生物领域的微囊是将酶、辅酶、蛋白质等生物大分子或者微生物、动植物细胞封 在一层亲水性的半透膜内所形成的球状微囊，使生物大分子或者细胞阻隔在微囊的膜内， 而氧气、营养物质以及其它小分子物质则可以自由进出囊膜进行物质传递，从而达到催化、 培养或者免疫隔离的目的。生物微囊由于其有一层半透微囊膜和膜内液体环境的特征，所 以具有保护膜内酶分子或者细胞并控制物质通过囊膜传递的功能。因而生物微囊就犹如一 个微小的生物反应器，为酶的催化或者细胞的生长提供一个微环境。微囊技术是一种固定包裹技术，其效果与微囊壳材料的选择密切相关，而囊壳材 料的组成又决定了微囊产品的一些性能，如溶解性、缓释性、流动性等，同时它还对微囊化 工艺方法有一定的影响，因此囊壳材料的选择是进行微囊化的关键。其必须具有的条件高 浓度时有良好的流动性，保证在微囊化过程中有良好的可操作性能；能够乳化芯材并能形 成稳定的乳化体系；在加工、储存过程中能够将芯材完整的包埋在其结构中；易干燥以及 易脱溶；良好的溶解性；经济性。J. K. Park等较系统地综述了微囊固定化微生物细胞的方 法。上述微粒固定化细胞与微囊固定化细胞相比，前者容易出现细胞渗漏，反应底物与细胞 的接触受限，以至于这种固定化细胞的使用寿命及产物的产率等均受到较大影响。而后者 细胞载量高，加快了反应进程，节约了反应时间，提高反应产率，而且延长了其使用细胞寿 命。PVA能形成良好的凝胶，常用于细胞包埋固定化。其应用中常用的有PVA冷冻法， PVA化学交联法，PVA辐射交联法，国内外在这些方面有大量报道。PVA化学交联法和PVA辐 射交联法或是容易开联，或是对细胞有毒性而在实际应用时受到一定限制。本发明是PVA 应用的物理方法，即PVA冷冻法，凝胶成型利用PVA在0°C -40°C冷冻适当的时间PVA链 间的氢键和微晶区形成三维网络，从而形成物理交联的PVA水凝胶，且该凝胶具有一定的 力学强度，常温下在水中只会溶胀而不会溶解。同时在外层凝胶中加入海藻酸钙(CA)用于打孔。海藻酸钠固定化细胞因其操作 简便、细胞毒性较小等优点而广泛应用。但其缺点是海藻酸钙在磷酸缓冲液及中不稳定，脱 钙使得结构松散而坍塌。本发明正是利用海藻酸钙凝胶对磷酸盐溶液或其它钙离子络合剂 化学侵蚀的敏感性，通过化学侵蚀将已固定化后含海藻酸钙凝胶中的海藻酸盐部分溶解， 从而在原来的外层凝胶中形成空穴，达到致孔的目的，以提高催化剂进行生物催化反应时 原料和产物的传输效率。用CTAB对微生物细胞进行透性化处理是提高细胞用于生物催化反应时细胞催化 能力的有效方法。本发明在固定化了细胞前，对细胞进行透性化，提高了胞内酶的活性。而 常见的细胞固定化是没有进行过透性化处理的。
发明内容
本发明的目的是结合了同轴双层技术和原位化学侵蚀打孔技术的新方法用以制 备透性化啤酒酵母细胞多孔微囊的新型生物催化剂。为了实现上述目的，本发明主要操作步骤包括首先，对酵母细胞进行透性化处 理，以提高其催化活性；采用同轴双层技术制备内核为透性化啤酒酵母细胞，囊壳为PVA/ CA的微囊。其外部材料为用适当比例的海藻酸钠和PVA混合，对透性化细胞进行包衣后，滴 入适当浓度的氯化钙溶液中形成凝胶外衣层，并经冻融增加外衣层的机械性能；用适当浓 度的磷酸盐溶液或其它钙离子络合剂进行化学侵蚀使部分海藻酸钙凝胶溶解，达到原位侵 蚀打孔的目的，从而形成微通道以促进小分子原料和产物在凝胶外衣层中的传输。与打孔 前后的微囊相比，疏水和亲水分子能更容易透过打孔后的微囊囊壳进入囊心，传质系数也 明显高于未打孔的微囊。经扫描电镜拍照，倒置显微镜观察，血细胞计数法计数，亚甲蓝染色以及酶活性等 检查，这种新型高效生物催化剂具有机械强度高、细胞内酶活性高，储藏稳定性好，细胞载 量高达80 %，传质效果好等特点。利用本发明可获得多孔微囊的新型生物催化剂，细胞载容量高，通透性好、机械强 度高。在低温下能长期保存，在生物催化反应中能长期反复使用。这将有利于这种新型高 效生物催化剂在生物催化及生物转化工业领域中的广泛应用。具体实施事例实例一用纯化水配置浓度为15%的PVA溶液和浓度为5%的海藻酸钠溶液，并在高压灭 菌锅中用121°C灭菌20min ；取15%的PVA溶液70ml，与5%的海藻酸钠溶液30ml充分混 合后制备成囊壳材料并置于同轴双层管外层(包衣层)的囊壳材料贮存容器中；另外将20 克的啤酒酵母细胞放入0. 2 %的CTAB溶液中进行透性化处理20分钟，将透性化处理后的啤 酒酵母细胞用去离子水反复洗3次、然后3000rmp离心5分钟，将离心后的啤酒酵母细胞液 装入同轴双层管的内层(内核液)，即内核液贮存容器中；在一定的压力下，将同轴双层管 内的物质同时挤压出，滴入经灭菌的4% CaCl2溶液中进行固化成型，形成直径为3 4mm 的内核为透性化啤酒酵母细胞液，外壳为载体材料的球状微囊。固化5分钟后，将固定化微 囊经用无菌水洗涤2 3次后，放在_20°C的冰柜中冷冻。18小时后，取出微囊，在0 4°C 环境中进行解冻2小时，如此反复2次即可。将制得的微囊置于2 3倍体积的pH为7. 0 的lmol/L磷酸缓冲液中，作用时间为30分钟，然后取出并用纯化水洗涤2次。将洗涤后的 微囊置于纯化水溶液12小时后，即得新型的高效多孔微囊生物催化剂。实例二用纯化水配置浓度为10%的PVA溶液和浓度为10%的海藻酸钠溶液，并在高压灭 菌锅中用121°C灭菌20min ；取10%的PVA溶液85ml，与10%的海藻酸钠溶液15ml充分混 合后制备成囊壳材料并置于同轴双层管外层(包衣层)的囊壳材料贮存容器中；另外将20 克的面包酵母细胞放入0. 5%的CTAB溶液中进行透性化处理10分钟，将透性化处理后的啤 酒酵母细胞用去离子水反复洗3次、然后3000rmp离心5分钟，将离心后的啤酒酵母细胞液 装入同轴双层管的内层(内核液)，即内核液贮存容器中；在一定的压力下，将同轴双层管 内的物质同时挤压出，滴入经灭菌的2% CaCl2溶液中进行固化成型，形成直径为3 4mm的内核为透性化面包酵母细胞液，外壳为载体材料的球状微囊。固化5分钟后，将固定化微 囊经用无菌水洗涤2 3次后，放在-20 0C的冰柜中冷冻。12小时后，取出微囊，在0 4°C 环境中进行解冻2小时，如此反复2次即可。将制得的微囊置于2 3倍体积的pH为7. 0 的lmol/L磷酸缓冲液中，作用时间为20分钟，然后取出并用纯化水洗涤2次。将洗涤后的 微囊置于纯化水溶液12小时后，即得新型的高效多孔微囊生物催化剂。
权利要求
基于新型多孔微囊技术构建高效生物催化剂，其主要步骤为a)细胞透性化处理将要包埋的啤酒或面包酵母细胞放在十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB)或甲苯或乙醇混合溶剂中，在4～40℃处理2～120分钟，使细胞透性化，增加细胞的酶活性。b)囊壳混合材料的制备用纯化水配置一定浓度的PVA溶液和海藻酸钠溶液，并在高压灭菌锅中用80～150℃灭菌2～120分钟。按一定比例分别取两种载体溶液，充分混合.制备出囊壳包衣材料基质。c)微囊的制备(化学固化)取一定量的聚乙烯醇和海藻酸钠混合载体基质置于同轴双层管外层(包衣层)，即囊壳材料贮存容器中；另外将啤酒酵母细胞液装入同轴双层管的内层(内核液)，即内核液贮存容器中，在一定的压力下，将同轴双层管内的两种物质同时挤压出，滴入经灭菌的适当浓度的CaC12溶液中固化一段时间，形成直径为3～4mm的内核为透性化啤酒酵母细胞液，外壳为PVA/CA载体复合凝胶的球状微囊。d)微囊的物理固化将化学固化成型的含有透性化酵母细胞液的微囊用去离子水洗几次，然后放在 60～ 10℃的冰箱中冷冻，每次冷冻时间为1～24小时，冷冻完成后取出放在0～25℃进行解冻，每次解冻1～5小时，这样的冻融过程反复进行1～10次。e)多孔微囊的制备将制得的微囊置于1～5倍体积的磷酸盐或柠檬酸或EDTA缓冲液中，经若干时间后取出，并用纯化水洗涤2次。将洗涤后的微囊置于纯化水溶液12小时后，即得多孔微囊生物催化剂。液体环境所述PVA水溶液在0.01％～15％(W/V)；所述海藻酸钠浓度在0.01％～10％(W/V)；所述CaCl2溶液浓度在0.1％～20％(W/V)；所述的磷酸盐或柠檬酸或EDTA浓度为0.01～2mol/L；透性化处理所用CTAB或甲苯或乙醇混合溶剂溶液为0.01％到8％；透性化时间为1～60分钟。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a)中所述的用CTAB或甲苯或乙醇混 合溶剂进行透性化处理，从而提高细胞内的酶活性，从而进一步提高生物催化剂的催化活性。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b)中所述囊壳混合材料中，PVA的浓 度为1 15%，海藻酸钙的浓度为0. 1 10%以及其相互比例。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)中所述的CaCl2溶液为0.1% 20% (W/V)，固化时间为1 30分钟，所形成的微囊为直径为3 4mm。
5.冻融条件为-60 -10°C，1 10次，每次1 24小时。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d)中冻融条件为-60 -10°C，1 10次，每次1 24小时。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e)中，在磷酸盐或柠檬酸或EDTA溶液 中振荡，凝胶层打孔1 80分钟。利用凝胶层海藻酸钙对磷酸盐溶液或其它钙离子络合剂 化学侵蚀的敏感性，通过化学侵蚀将囊壳凝胶中的藻酸盐部分溶解，从而形成空穴，以提高 在用生物催化剂进行生物催化反应时原料和产物的传输效率。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于使用后的多孔微囊，经过去掉囊壳包衣层， 洗净细胞后，可以再经过要求1中所述的步骤从b)、c)、d)到e)所述处理，重复应用。
全文摘要
通过结合同轴双层技术和原位侵蚀打孔技术，制备新型高效多孔微囊生物催化剂的新方法。制备微囊过程中，采用同轴双层技术制备内核为透性化啤酒或面包酵母细胞，外层囊壳为聚乙烯醇/海藻酸钙混合凝胶的微囊，直径3～4mm，最后通过反复冻融进行进一步固化，增加其微囊外层的机械强度。由于微囊内部是细胞液，因此就形成类似于微小的生物反应器的微囊生物催化剂。同时，通过原位化学侵蚀打孔技术，用磷酸盐溶液或其它钙离子络合剂进行化学侵蚀使部分海藻酸钙凝胶溶解，达到原位侵蚀打孔的目的，从而形成微通道以促进小分子原料和产物在凝胶外衣层中的传输。除此之外，通过对啤酒酵母或面包酵母细胞的透性化处理，提高了多孔微囊核中细胞的催化活性。通过上述方法，构建出了细胞载量高、催化效力强、扩散限制小、机械强度好的多孔微囊新型高效生物催化剂，并以此用于生物催化制备手性醇等重要手性药物与医药化工中间体。
文档编号C12R1/865GK101899429SQ20091010398
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月31日 优先权日2009年5月31日
发明者于明安, 侯毅, 王施韦, 赵泉, 黎刚, 龚耿浩 申请人:重庆医科大学