专利名称：一种编码蔗糖酶的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码蔗糖酶的基因，特别是涉及克隆自环境宏基因组的一 种新的编码蔗糖酶的基因，该基因编码的蛋白质可用于蔗糖的降解。
背景技术：
蔗糖是植物中光合作用产生的可再生的碳水化合物，每年全球产量超过了
5亿吨(马尔克斯'萨瓦亚，亚克，蔗糖乙醇的中巴合作，商务周刊，2009， 1:72)。 蔗糖的酶水解是一个重要的生物化学反应过程蔗糖通过蔗糖水解酶一 0 -呋喃 果糖苷酶或称蔗糖酶(P-fructofuranosidase， Invertase , EC 3. 2.1.26) 的水解作用分解产生单糖(葡萄糖和果糖)，单糖再进一步被用于生产如燃料乙 醇等重要的工业产品，因而高效的蔗糖水解酶是蔗糖生物能源利用的关键因素 (Marris E， Sugar cane and ethanol: drink the best and drive the rest, Nature, 2006, 444(7120): 670-672)。
蔗糖通过蔗糖酶的催化水解得到葡萄糖和果糖。葡萄糖和果糖在微生物细 胞中进入糖酵解发酵途径分解产生代谢物质。通过这样的代谢路径，酵母利用 葡萄糖和果糖来产生乙醇。利用酵母发酵蔗糖生产乙醇是所有的生物质生产乙 醇中能量投入产出比最高的，这个投入产出比达到了8 (Marris E, Sugarcane and ethanol: drink the best and drive the rest, Nature, 2006， 444(7120): 670-672)。(能量投入产出比在这里是指计算蕴藏在生产得到的一吨酒精里的 能量，这个是产出；投入是，为了发酵乙醇耗费的原料所蕴藏的能量，以及这
3个原料的种植、运输等环节耗费的能量)。生物燃料乙醇作为解决目前的石油危 机和温室效应的可替代能源受到了重视，利用蔗糖作为生物燃料乙醇的发酵原 料成为一个有效的途径。蔗糖酶是微生物蔗糖代谢途径中的第一个酶，是蔗糖 代谢水解的关键酶之一，也是决定蔗糖发酵时间的最主要的因素之一。寻找新 的蔗糖酶基因用于构建新的更适合工业化生产各种化工产品的基因工程菌，提 高微生物水解蔗糖的转化效率和水解速度，从而縮短发酵生产时间，对于降低 直接发酵甘蔗汁生产各种化工产品的生产成本具有十分重要的意义。
蔗糖酶属于一个较小的糖基水解酶家族。蔗糖酶是一类糖基水解酶
(glycosyl hydrolases),糖基水解酶根据催化功能域的氮基酸序列相似性， 被划分成不同的家方夷(families) (Davies G. ， Henrissat B, Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 1995， 3:853-859; Henrissat B., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. ， 1996， 316:695-696)。根据碳水化合物活性酶数据 库(hUp:〃www. cazy. org/fam/accjm. html)上所列糖基水解酶类的最新清单， 目前糖基水解酶类有U2个家族，而蔗糖水解酶属于糖基水解酶类家族32的一 个成员。
蔗糖酶分布于植物、真菌和细菌中。目前国内外对细菌蔗糖酶基因的克隆 以及重组表达研究集中于对肠道细菌，比如常见的克雷伯氏菌、大肠杆菌、沙 门氏杆菌等微生物(Sharon J. Reid， Valerie R. Abratt. Sucrose utolosation in bacteria:genetic organisation and regulation, Appl Microbiol Biotechnol. 2005， 67:312-321)。在这些研究中都是通过对微生物的实验室 的培养来进行研究的。但是自然界中可以被人类培养的微生物只占自然界中微 生物种类的1% (Rapp6 MS, Gio窗noni SJ. The uncultured microbialmajority. Annu. Rev. Microbiol., 2003， 57:369—94)，而其余的99%的微 生物用目前的实验条件是无法培养的。这些不可培养的微生物中蕴藏着大量的 基因资源。从这些无法培养的微生物中获取基因资源成为微生物研究的热点
(Voget S， Leggewie C, Uesbeck A， et al. Prospecting for novel biocatalysts in a soil metagenome. Appl. Environ. Microbiol., 2003, 69(10) 6235-6242)。近年来从环境样品未培养微生物提取基因组DNA然后构 建宏基因组DNA文库以分离各种新基因已是成熟技术(Daniel R. The soil metagenome—a rich resource for the discovery of novel natural products. Curr. Opin. Biotechnol. ， 2004, 15 (3) :199-204)。大量具有应用价值的酶 基因通过宏基因组的方法被克隆和应用(Richardson TH, Tan X, Frey G, et al. A novel, high performance enzyme for starch liquefaction.J. Biol. Chem.， 2002， 277(29): 26501-26507 )。糖厂废水中含有丰富的蔗糖，被糖 厂废水浸润的土壤中有大量的微生物在进行蔗糖的分解，在这个土壤环境中的 未培养微生物中含有大量的蔗糖酶资源，其中很有可能有优于目前所发现的蔗 糖酶。通过构建糖厂废水污染土壤微生物的宏基因组DNA文库，能从中筛选得 到比目前应用还要好的蔗糖酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种编码蔗糖酶的基因及其应用。该基因是通过构建 糖厂废水污染土壤微生物的宏基因组DNA文库以及进行文库克隆的蔗糖酶活性 平板检测筛选法，得到了新的编码蔗糖酶的基因，这个蔗糖酶基因可应用于基 因重组菌中用于蔗糖的水解或是在宿主细胞中大量表达该基因以生产该蔗糖 酶。
本发明通过以下技术方案达到上述目的 一种编码蔗糖酶的基因，它具有
5序列表SEQ ID NO.l中所述核苷酸序列或其功能等同变异体。
所述基因功能等同变异体为SEQ ID NO. 1的核苷酸序列的突变形式，突变
形式包括缺失、无义、插入、错义。
所述基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。 一种表达载体，它含有权利要求l所述的基因。 一种宿主细胞，它含有所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。 所述蛋白质在蔗糖降解和对含蔗糖材料的处理中的应用。 所述编码蔗糖水解酶的基因众"(SEQ ID NO. 1)，是从广西武鸣县糖厂废
水污染土壤微生物宏基因组文库中分离得到。^2"基因的起始密码子为ATG，
终止密码子为TAA,由1761个核糖核苷酸组成。
S￡Q ID NO. 2的蛋白质是基因in^编码的蔗糖酶产物Inv2，由586个氨基
酸组成，自N端的第1 20位氨基酸为信号肽，自N端的第126—549位氨基
酸为家族32糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。
基因//7^在大肠杆菌中表达的重组产物Inv2能降解蔗糖。 含有本发明基因的表达载体，用于转化本发明基因的宿主。 本发明突出的实质性特点在于提供了一种新的蔗糖酶基因，该基因所编码
的蔗糖酶在蔗糖的降解中具有广泛的用途。
具体实施例方式
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。 提供的实施例是为了更好地理解本发明，而不应该被解释为限制本发明的 目的。
在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(^sc/jeric力ia co i) 株系EPI300 (购自Epicentre公司的文库制备试剂盒CopyControl FosmidLibrary Production Kit (目录号CCF0S110)的一个组分)；载体为购自 Epicentre公司的柯斯质粒载体CopyControl pCClFOS ;购自Epicentre公司 的文库制备试剂盒(CopyControl Fosmid Library Production Kit,目录号 CCF0S110)，购自TaKaRA、 MB1的限制性内切酶、修饰酶等试剂。 实施例的具体描述
1、糖厂废水污染土壤微生物总DNA的提取
取自广西武鸣县糖厂废水污染的土壤200克，悬浮在100 ml的0. 18 mol/L 磷酸钾缓冲液(pH 7. 2)中，然后在600转/分钟离心力下离心10分钟收集上清 液。上清中加入40ml聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)溶液，振荡30秒，再加入200 W 3 mol/L CaCl2溶液，振荡30秒后，在600转/分钟离心力离心5分钟，收 集上清液于另一个离心管中并用8000转/分钟离心力离心15分钟收集上清液中 的细菌细胞。收集到的菌体沉淀块悬浮在lmlTE溶液中，并在37"C下加入100 pl溶菌酶作用30分钟，然后以10000转/分钟离心1分钟再次沉淀细胞，细胞 沉淀块悬浮在600 pi PUREGENE公司的基因组DNA纯化试剂盒(Genomic DNA Purification Kit,目录号R-5500A)的细胞裂解缓冲液中，置80。C水浴锅5分 钟以裂解细胞，待样品冷却到室温后，加入200^1上述试剂盒中的蛋白质沉淀 溶液，充分混匀后13000转/分钟离心3分钟，将上清液转移到一个新的1.5ml 微量离心管中，加入600 nl 100%异丙醇，充分混匀后即见DNA絮状沉淀析出， 挑出DNA絮状沉淀，用70%乙醇洗2次DNA，干燥后将DNA溶于500 pl TE溶 液即得DNA粗提物。
将咖A粗提物加到含有Sephadex G200 (购自Pharmacia公司，目录号 17-0080-01)和2XPVPP的层析柱(200 mm x 10咖)上，用TE缓冲液洗脱， 按每组分1 ml分部收集洗脱液，每一组分加入100 plL的3 mol/L醋酸钠溶液及1 ml异丙醇沉淀DNA，把沉淀物溶于TE中，合并所得DNA溶液，0.7%琼脂 糖凝胶电泳后切下含20 kb以上的DNA的凝胶，用电洗脱法回收纯化DNA。 2、构建糖厂废水污染土壤微生物宏基因组文库
为了用这些纯化的DNA制做基因文库，首先对这些DNA进行末端修补以产 生平头末端而和文库制备试剂盒中已处理好的同样具平头末端的CopyControl pCClFOSTM载体相连，依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入8 pl 末端修补缓冲液，4 pl末端修补酶混合物。室温下放置45分钟，再转移到70°C 水浴锅放置10分钟以终止酶反应，1. 0%低熔点琼脂糖凝胶电泳后切下含25 kb 一45 kb的DNA的凝胶进行DNA回收，为了使回收片段与文库制备试剂盒中已 处理好的具平头末端的载体在T4 DNA连接酶的作用下连接起来，依次在冰上向 一个新的灭过菌的微量离心管中加入2 |_11无菌水，1 pl IO倍快速连接缓冲 液，1 pl 10 mmol/L ATP， 1 jil CopyControl pCClFOS 载体，5 pl低熔点 琼脂糖凝胶回收的25 kb—45 kb的DNA， 1 pl快速连接DNA连接酶，混匀后 在室温下放置2个小时，再在7(TC放置10分钟以终止酶反应。为了将连接反 应产物用X包装提取物(Epicentre公司的文库制备试剂盒CopyControl Fosmid Library Production Kit的一个组分)包装，将在冰上刚刚溶化的人包装提取 物25 pi立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于冰上，再往其 中加入10 (il连接反应产物，充分混匀后置于3(TC 90分钟后，再往其中加入 25 pi溶化的X包装提取物，充分混匀后置于30°C 90分钟，向其中加入935 pi 噬菌体稀释缓冲液，再将该1 ml包装反应产物加入到10 ml的0D6Q。=1.0的宿 主大肠杆菌EPI300培养液中，37X:下放置20分钟让上述得到的包装的X噬菌体 吸附和侵染宿主细胞EPI300,在含12. 5 u g/ml氯霉素的培养基平板上筛选 转化子。结果共获得约ll万个转化子。3、 蔗糖酶基因//7P^序列的测定
用平板影印法将含有氨卞青霉素的LA平板上得到的转化子分别影印到含 有氨卞青霉素的以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基。M9基本培养基的配方为
每升含七水合磷酸氢二纳，12.8g;磷酸二氢纳，3g;氯化钠，0.5g;氯化铵，
lg。将平板倒置于37'C培养箱培养3天。结果筛选到两个能在以蔗糖为唯一碳
源的基本培养基上生长的克隆，本发明只涉及其中一个克隆。进一步提取该克 隆的质粒DNA并将其命名为pInv,用限制性内切酶5a/rfH酶切plnv后，将获 得的DNA片段与去磷酸化的经^朋HI酶切的pUC19质粒进行连接。再将连接产 物用氯化钙转化法转化到大肠杆菌菌株JM109中，在含100 y g/ml氨苄青霉素 的培养基平板上筛选转化子。结果共获得约320个转化子，用平板影印法将得 到的转化子影印到含有氨卞青霉素的以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基的平 板上，将平板倒置于37'C培养箱培养3天。结果筛选到一个能在以蔗糖为唯一 碳源的M9基本培养基上生长的亚克隆。进一步提取该亚克隆的质粒DNA并将其 命名为plrw-2，用限制性内切酶万rfl完全酶切pInv-2后，进行0.7%琼脂糖 凝胶电泳分析，结果Plnv-2除有一个2. 7 kb的载体片段外，还给出另外一条 DNA片段，大小为6.9 kb。于是，对plnv-2进行测序。plnv-2送交上海生工 生物工程公司测定DNA核苷酸序列。
4、 蔗糖酶基因2'/7^的核苷酸序列分析
用NCBI (National Center for Biotechnology Information, http:〃爾.ncbi. nlm.nih.gov)上的软件如0RF finder (http:〃www. ncbi. nlm- nih. gov/gorf/gorf. html),
Blast (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)对DNA序列进行分析。基因 的开放阅读框由1761个核苷酸组成，序列如SEQ ID NO: 1所示。其中，基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。
5、 蔗糖酶基因2'/2^编码的产物Inv2的氨基酸序列分析
蔗糖酶基因i/7"编码一个含586个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测 该蛋白质的理论分子量大小为66702. 64道尔顿。
使用Blast (http:〃www. ncbi. nlm, nih. gov/BLAST)搜寻GenBank数据库， 和Irw2催化功能域同源性最高的为牙龈二氧化碳嗜纤维菌(C邵; oc7t印/ 3卵 gjV7^'raJj's JCVIHMP016)的invertase 2的催化功能域(e-值为0.0)，两者 的相似性为56%、相同性为71%
用简单组件结构研究工具(http:〃smart. embl-heidelberg. de)分析糖厂 废水污染土壤微生物中的蔗糖酶Inv2的组件结构，结果是自N端的第l一20位 氨基酸为信号肽，自N端的第126 — 549位氨基酸为家族32糖基水解酶 (glycosyl hydrolase)功能域。
6、 蔗糖酶基因//2V^的克隆和表达
使用上游引物5， - CACTCATGA TGCACCACCACCA CCACCACAATAGACAGATGAATCCAGGTC -3，和下游引物5，-CACCTGCAGACGATGATTTCACAGATGCMGC -3，，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增 蔗糖酶基因//7《，用限制性内切酶尸a《I和尸Wl酶切蔗糖酶基因&"后，与 经#"1和尸"I酶切的表达载体pSE380进行连接。再将连接产物转化到大肠 杆菌XL1-Blue中(转化方法为氯化钙法)，涂布到含100 u g/ml氨苄青霉素的 培养基平板上筛选克隆。进一步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pSE-i'"W， 用限制性内切酶历/7dl11酶切pSE-i/7^后，进行0. 7Q/^琼脂糖凝胶电泳分析， 结果pSE"'/ "除有一个5.1 kb的DNA片段外，还有一条大小为800 bp的DNA 片段。
10将含有质粒pSE-i/7"的重组大肠杆菌XL1-Blue菌株接种到20 mL含氨苄 青霉素的培养基培养基中，37。C振荡培养，待0D6。。为0.4时，加入IPTG使其终 浓度为0.5mmol/L， 3(TC诱导10小时。11000转/分钟离心3分钟，收集菌体， 用4ml浓度为100mmol/L的磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9分钟。用12000 转/分钟的转速离心10分钟，上清即为含有蔗糖酶Inv2的粗酶液。
7、蔗糖酶Inv2酶活的测定
取20 u l蔗糖酶Inv2粗酶液，加入500 ul浓度为IOO mmol/L的磷酸缓冲 液，与480 ul的l^蔗糖溶液混合，在37XM乍用1小时后，加入800 ul DNS溶 液。放置沸水中反应5分钟，室温冷却，用分光光度计测吸光度ODs。。。吸光度测 定值与不同含量的葡萄糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。DNS试剂配制方法 为，称取1克氢氧化钠用约40 ml双蒸水溶解，再称取l克二硝基水杨酸、0.2 克苯酚、0.05克无水亚硫酸钠、20克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约30 ml双 蒸水中，两种溶液混合，定容到IOO ml。序列表
〈110〉广西科学院
<120〉 一种编码蔗糖酶的基因及其应用 <160> 2
〈170> Patentln Version 3. 3 <210> 1 <211> 1761 <212> DNA
〈213〉土壤未培养微生物 <220>
<221〉 gene
<222> (1)…(1761)
<223>
〈400〉 1
caatattgctcagtctgcteiattcttgtcatgacgctgtctgcctgtggc60
tg肪tCC3ggtcattacaaag8L8L幼geLtC3ccagtacgt3tctgttgatt120
cccatccaggaggaagccaaacagccttcacgattggc犯caac犯aga^180
acatccaaaaccttctacatCCg8lttggCgtcgattactgggtCEl犯t3C240
gatgtgg鄉cctttaggggc幼aga幼tccaactctcgttcgagggagcCg6LgggttCgl300
atgctgggt￡itcagaeiacatgacaaattcgagttggeigtac犯cgaBccc360
tttcgacctggatttcatttC3CtCCtgElElt3tggttggatgaacgaccccaatgg3ttg420
gtctatctggatggcgagtaccatttgtttatccatacggtaaccgatgg480
ggg肪tatgcattgggggcatgctgtcagtaccgatctcacttcctggacctacttgcct540
actgccatcg肪ccggac肪etctcggggatatcttttcaggttctgccgttgtgg3CtCC600
SLCcaattcagccggatttggctcatcgctatttacacggcg6LgLtgggLgC3660
acccagcaacagtgcatcgcttacagcatcgaca幼ggtsgaaccttcac720
肪g犯tccggtactgccc犯tcccggcatc犯ggatttcagagacccaaaa^gtac3ctgg780cc犯gcaatgggtcatggct ttggcgacac aacagaccat tacctttttc840
ggttcacctg3Cttg犯g犯ttggacacgg ttgagcgaat tcggaaag犯ttacggagca900
catggtggtgUtgggaatgcccggacttg tttccgttgg agttcgaagg tSLaSLELCCeLaa960
tgggtactUtggtcagtatcaatcctggt gggcceiaacg gaggttcagc aacgcagtat1020
tttataggcgatttcgacggaaaaaccttt agtgccgatc cgctgcccta tccgttatgg聽
gttgatt3tgcteitgcaggt gtteicgttca gc肪catcgg犯agaacgat1140
ggtCg2LCgC3ttttC3tgggttgg3tgagt 33ttggg3tt 3tgCC33tg3 Cgt3CCg3Cg1200
肪a3gctttcgaccctaccg cgcgaattga aattggcgag caatggccaa1260
catttg3ttctgaceiagtgcccccgtttct gaagtcacca aattgcgtgg caaatctggt1320
g犯acgatc3atatcttggtaaacagcgaa aaaagcatca ccaacgtttt gcaggatttc1380
幼tggc犯gttcgaact犯atatgaccatt c犯cgtaaeig atgcceia^gt ttggggcttc1440
ggacta犯aa3cgaactaggagattatctg aatttcacgt tcgattggga acagaaaatc1500
ctgaet8gtcgatcgtcgaaatacgggtatc aaggaerttCEi gtcei幼a^tt cgcaiEiccgag1560
ccattcgcaccactcgcgaaacacgacagc tacaccatcc gactgtttert ggacaaggct1620
tcgtccgaaatattcatcaatgeLCggag肌acggtgttga ccaacttggt gttcccttcg麵
aaagtctcacgttctttaca gccaataagc catggaacgt tga犯atctg1740
aaaat3ttcgaaatceiaata811761
<210〉 2 <211〉 586 〈212〉 PRT
〈213〉土壤未培养微生物 〈400〉 2
Met Lys Lys Ser lie Leu 1 5 Leu Ser Ala Cys Gly Asn 16 20 Glu Lys lie Thr Ser Thr
13
Leu Ser Leu Leu lie Leu Val Met Thr
10 15 Arg Gin Met Asn Pro Gly His Tyr Lys
25 30 Tyr Leu Leu lie Pro lie Gin Glu Glu31
Alei Lys Glu 46
Thr Ser 61
Tyr Trp 76
Gin Leu 91
Asn lie 106
Phe Arg 121
Asp Pro 136
Tyr Gin 151
Gly His 166
Thr Ala 181
Ala Val 196
Leu lie 211
lie Ala 226
Lys Asn
35 Lys 50 Phe 65 Tyr 80 Glu 95 Ser 110 Phe 125 Leu 140 Pro 155 Ser 170 Pro 186 Ser 200 Tyr 215 lie 230 Leu
lie Lys Thr Ala Phe Thr lie Gly Asn Asn
Lys Thr Phe Tyr lie Arg Leu Ala Glu Asn Lys
Val Lys Tyr Asp Val Glu Ala Phe Arg Gly Lys
Ser Phe Glu Gly Ala Glu Gly Ser Met Leu Gly
Lys Gin Ser Asp Lys Phe Glu Leu Glu Tyr Asn
Pro Gly Phe His Phe Thr Pro Glu Tyr Gly Trp
Asn Gly Uu Val Tyr Uu Asp Gly Glu Tyr His
Tyr Asn Pro Tyr Gly Asn Arg Trp Gly Asn Met
Ala Val Ser Thr Asp Leu Thr Ser Trp Thr Tyr
lie Glu Pro Asp Lys Leu Gly Asp lie Phe Ser
Val Asp Ser Thr Asn Ser Ala Gly Phe Gly Lys
Ala lie Tyr Thr Ala Asn Gly Ala Thr Gin Gin
Tyr Ser lie Asp Lys Gly Arg Thr Phe Thr Lys
Pro Val Leu Pro Asn Pro Gly lie Lys Asp Phe
40 lie 55 Ala 70 Phe 85 Ser 100 Leu 115 Glu 130 Gly 145 Trp 160 Ser 175 Asp 190 Gly 205 Ala 220 Thr 235 lie
45 Lys Glu
60 lie Asp
75 Glu lie
90 lie Arg
105 Glu Pro
120 Met Asn
135 Leu Phe
150 His Trp
165 Leu Pro
180 Gly Ser
195 Asn Ala
210 Gin Cys
225 Tyr Glu
240 Arg Asp241245250 255
ProLys Val His TrpAsn Glu Gin AlaLys Gin Trp Val Met Ala
256260265 270
LeuAla Thr Gin GinThr lie Thr PhePhe Gly Ser Pro Asp Leu
271275280 285
LysAsn Trp ThrArgLeu Ser Glu PheGly Lys Asn Tyr Gly Ala
286290295 300
HisGly Gly ValTrpGlu Cys Pro AspUu Phe Pro Uu Glu Phe
301305310 315
GluGly Lys ThrLysTrp Val Leu LeuVal Ser lie Asn Pro Gly
316320325 330
GlyPro Asn GlyGlySer Ala Thr GinTyr Phe lie Gly Asp Phe
331335340 345
AspGly Lys ThrPheSer Ala Asp ProLeu Pro Tyr Pro Leu Trp
346350355 360
ValAsp Tyr GlyArgAsp Asp Tyr AlaGly Val Thr Phe Ser Asn
361365370 375
lieGly Lys AsnAspGly Arg Arg liePhe Met Gly Trp Met Ser
376380385 390
AsnTrp Asp TyrAlaAsn Asp Val ProThr Lys Ser Phe Arg Asn
391395400 405
AlaMet Thr LeuProArg Glu Leu LysLeu Ala Ser Asn Gly Gin
406410415 420
HisLeu lie LeuThrSer Ala Pro ValSer Glu Val Thr Lys Leu
421425430 435
ArgGly Lys SerGlyGlu Thr lie Asnlie Leu Val Asn Ser Glu
436440445 450
LysSer lie ThrAsnVal Leu Gin AspPhe Asn Gly Lys Phe Glu
15451
Leu Asn Met Thr 466
Gly Leu Lys Asn 481
Trp Glu Gin Lys 496
Lys Glu Phe Ser 511
Ala Lys His Asp 526
Ser Ser Glu lie 541
Uu Val Phe Pro 556
Ala Asn Lys Pro
571
Lys
586
455 460 lie Gin Arg Lys Asp Ala 470 475 Glu I>eu Gly Asp Tyr Leu 485 490 lie Leu Lys Val Asp Arg 500 505 Gin Lys Phe Ala Thr Glu 515 520 Ser Tyr Thr lie Arg Leu 530 535 Phe lie Asn Asp Gly Glu 545 550 Ser Gin Thr Tyr Lys Ser 560 565 Trp Asn Val Glu Asn Leu 575 580
465
Lys Val Trp Gly Phe 480
Asn Phe Thr Phe Asp 495
Arg Asn Thr Gly lie 510
Pro Phe Ala Pro Leu 525
Phe Met Asp Lys Ala 540
Thr Val Leu Thr Asn 555
Leu Thr Phe Phe Thr 570
Lys lie Phe Glu lie 58权利要求
1.一种编码蔗糖酶的基因，其特征在于，该基因具有SEQ ID NO.1核苷酸序列或其功能等同变异体。
2. 权利要求I所述的基因，其特征在于，所述其功能等同变异体为SEQ ID N0.1的核苷酸序列的突变形式，突变形式包括缺失、无义、插入、错义。
3. 权利要求1的基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求l所述的基因。
5. —种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述表达载体转化的原 核细胞或真核细胞。
6. 权利要求3所述的蛋白质在蔗糖降解和对含蔗糖材料的处理中的应用。
全文摘要
一种编码蔗糖酶的基因inv2，它具有序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列或其功能等同变异体编码的蔗糖酶SEQ ID NO.2。该基因或其功能等同变异体编码的蔗糖酶在蔗糖的降解中具有广泛的用途。
文档编号C12N15/56GK101624597SQ20091011428
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者浩 庞, 黄志民, 黄日波, 黎贞崇 申请人:广西科学院